전자 폰 프레이 장치를 사용하여 생쥐의 뒷발에서 촉각 감도의 변화를 측정합니다.

요약

Electronic von Frey 측정은 염증 사건 전후에 지속적으로 가해지는 압력 자극에 대한 설치류의 기계적 인출 임계값의 변화를 빠르고 정확하게 측정할 수 있기 때문에 고전적인 von Frey 필라멘트에 대한 효과적이고 개선된 대안입니다.

초록

기계적 압력으로 인한 뒷발 철수 역치에서 염증으로 인한 변화를 측정하는 것은 설치류의 통증 인식 변화를 평가하는 데 유용한 기술입니다. 금단 역치는 먼저 기준선에서 측정한 다음 약물, 독, 부상, 알레르겐 또는 기타 유발 염증을 따라 피부의 매우 특정 부위에 정확한 힘을 가하여 측정할 수 있습니다. 전자 von Frey 장치를 사용하면 고전적인 von Frey 측정과 달리 사용 가능한 필라멘트 크기에 의해 제한되지 않는 마우스 뒷발 철수 임계값을 정확하게 평가할 수 있습니다. 측정의 용이성과 신속성은 짧은 기간 내에 여러 측정을 수행할 수 있기 때문에 급속 발병, 염증 및 신경병성 통증의 다양한 모델에서 촉각 민감도 결과에 대한 평가를 통합할 수 있습니다. 개별 설치류 피험자에 대한 실험 측정은 실험 그룹 내에서 및 실험 그룹 간에 기준선 반응을 표준화하기 위해 쉽게 설정할 수 있는 개별 기준선 반응 및 제외 기준에 대해 내부적으로 제어할 수 있습니다. 따라서, 전자 폰 프레이 장치를 사용한 측정은 다른 비인간 포유류 모델에도 적용될 수 있는 설치류의 기계적 이질통에 대한 잘 정립된 고전적 폰 프레이 필라멘트 기반 분석의 유용한 변형을 나타냅니다.

서론

만성 비전염성 질환은 인간의 사망률과 이환율의 불균형적인 몫을 차지하고 있다¹. 만성 통증은 전 세계 질병 부담의 중요한 요소로 점점 더 인식되고 있습니다². 이는 통증의 예방, 관리 및 치료에 대한 혁신에 큰 자극을 제공했습니다. 동시에, 통증의 근본적인 생물학이 복합체³이라는 풍부한 증거가 있다. 통증 보호, 부적응 및 만성 통증의 기전은 면역계와 신경계 사이의 복잡한 상호 작용을 가리킵니다^3,4. 이러한 메커니즘을 규명하기 위해서는 분자 해부에서 행동 분석에 이르기까지 엄격하고 정량적이며 재현 가능한 실험적 접근 방식이 필요합니다.

설치류 모델은 염증성 및 신경병성 통증의 분자 플레이어를 특성화하는 데 매우 중요했습니다⁵. 유해 자극에 대한 이전에 명시된 반응의 시간 및 강도 감소는 설치류 피험자가 통증 감각을 보고할 수 없기 때문에 이러한 동물의 통증 상태를 측정하는 데 사용됩니다⁶. 감염 7,8, 화학물질 노출^{6, 9,10}, 외과적 절개¹¹ 및 신경 결찰¹²에 의해 유발될 수 있는 염증성 통각(inflammatory nociception)의 설치류 모델에서 체온 및 압력에 대한 변화된 반응은 일반적으로 조직 민감도의 척도로 사용된다.

기계적 민감도 또는 압력 자극에 대한 반응은 종종 고전적인 폰 프레이 필라멘트(CvF)를 사용하여 측정됩니다. 기계적 민감도를 평가하기 위해 이러한 팁이나 머리카락을 사용하는 다양한 방법이 있습니다^6,13; 가장 자주 사용되는 방법은 다음과 같습니다. 특정 압력이 있는 팁(시리즈 내; 예를 들어, 2 g,¹³)을 시작점으로 선택하고 랫드 또는 마우스의 50% 철수 임계값(팁이 조직에 적용되는 횟수의 50%를 생성하는 데 필요한 자극 강도)은 이전에 지정된 반응 행동(¹³)의 표시에 따라 팁 무게의 위아래로 움직여 결정됩니다. 그런 다음 치료 그룹에 대한 절대 50% 금단 임계값을 기준선과 치료 후 시점 간에 비교합니다. 이 수동 기술은 시간이 많이 걸립니다. 폰 프레이 챔버에 갇힌 각 피험자가 보내는 시간이 늘어나는 것 외에도, 이것은 또한 다양한 무게의 테스트 팁이 염증이 있는 조직에 적용되는 횟수를 증가시켜 연구에서 설치류에게 더 큰 불편함을 유발합니다. 또한 50%의 철수 임계값이 계산되어 설치류 그룹 간에 비교됩니다. 실험 대상자들의 개별 반응은 일반적으로 처리되지 않은 개별 기준선 반응으로 정규화되지 않으며, 우리가 아는 한 가지 예외⁶. 결과적으로, 설치류 피험자는 일반적으로 이전에 결정된 범위 내에서 일관된 기준선 반응을 기반으로 치료 그룹에 배정된 것으로 보고되지 않으며, 특정 연구 및 분석 세트에 대해 기준선 반응을 표준화할 수 있도록 일관되게 적용된 배제 기준 세트를 기반으로 평가되지 않습니다.

여기에서는 전자 폰 프레이 장치(EvF)를 사용하여 Bothrops jararaca 독에 노출된 후 쥐의 뒷발 촉각 민감도를 측정하는 대체 방법을 제시합니다. Cunha와 동료^{6는 설치}류에서 EvF 기술의 사용을 개척하고 CvF와 EvF 효능을 체계적으로 비교하여 EvF가 염증성 통증의 설치류 모델에서 촉각 민감도에 대한 "보다 민감하고 객관적이며 정량적인" 측정을 제공한다는 것을 입증했습니다. 간단히 말해서, EvF 측정에서 테스트 중인 조직에 적합한 강성을 가진 균일한 직경(0.8mm)의 비흡습성 폴리프로필렌 폰 프레이 팁을 전자 프로브에 부착하고 설치류가 팁에서 후퇴하는 힘/무게를 표시하는 판독값을 표시합니다. CvF와 EvF 측정 사이에는 몇 가지 중요한 차이점이 있습니다. 첫째, EvF를 사용하여 기준선 및 실험 반응을 모두 측정하는 프로세스는 반응이 있을 때까지 뒷발에 대한 압력이 증가하여 가해질 수 있고 CvF에서와 같이 팁을 변경할 필요가 없기 때문에 크게 간소화되었습니다. 동물들은 분석 챔버에 갇혀 있는 시간이 줄어들기 때문에 실험 중에 스트레스를 덜 받고 더 편안합니다. 둘째, EvF는 허용 가능한 기준선 임계값 범위의 형태로 연구 대상자에 대한 합리적 제외 기준을 상대적으로 쉽게 구현할 수 있도록 합니다. 이를 통해 치료 그룹 내에서 그리고 치료 그룹 간에 기준선 반응을 표준화할 수 있습니다. 셋째, 실험적 치료 후 피험자의 반응은 항상 자신의 개별 기준선 반응과 비교되어 측정을 위한 중요한 내부 통제를 생성합니다. 넷째, 인출 임계값의 정확도는 수동 필라멘트의 중량 형태로 사용할 수 있는 증분이 아닌 지속적으로 압력이 가해질 수 있기 때문에 더 높은 수준의 해상도로 기록됩니다. 잘 설계된 CvF 분석과 마찬가지로 EvF 기반 실험도 동일한 조사자(치료에 맹인)가 힘을 가하고 반응 행동을 기록하여 수행됩니다. 이 기술은 측정의 내부 일관성을 확립하기 위해 연구자 측의 시간과 노력이 필요하며 일관되지 않은 기준선 반응으로 인해 제외해야 할 수 있는 마우스에 대해 적절한 허용치가 만들어지도록 실험을 계획해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

기계적 민감도에 대한 구현하기 쉽고 효과적이며 잘 통제된 평가는 독과 같은 염증 사건 모델에 행동 평가를 추가하는 것을 용이하게 합니다. 우리는 수컷 ND4 스위스 쥐가 남아메리카 핏바이퍼 Bothrops jararaca에서 유래한 독을 뒷발에 주입한 후 향상된 기계적 민감도를 보였다는 것을 발견했습니다. 행동 반응은 부종, 호중구의 유입, 영향을 받은 조직의 비만 세포 탈과립화를 동반했습니다.

프로토콜

Macalester College의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)는 모든 프로토콜을 승인했습니다. 이 실험에는 8-12주 된 수컷 ND4 스위스 마우스가 사용되었습니다.

1. Bothrops jararaca 독 준비 및 주입

1. 주의: B. jararaca 독은 독성이 있습니다. 장갑, 마스크, 보안경을 착용하여 파우더를 취급하고 용액을 준비할 때.
2. 29G x 1/2인치 바늘이 있는 3/10ml 인슐린 주사기를 사용하여 양쪽 뒷발에 발바닥 내 주사를 통해 45μg/kg B. jararaca 독(이전 용량 반응 실험에 의해 결정된 요법) 또는 0.9% 식염수 비히클(10μl)을 투여합니다. 참고: 실험 설계에 따라 치료 및 대조 용액을 각 뒷발에 각각 별도로 주입하여 각 피험자 내에서 내부 통제를 제공할 수 있습니다.

2. 전자 폰 프레이 장치 설정 및 작동

1. 전자 von Frey 장치를 프로브 스탠드에 놓습니다. 프로브와 케이블이 디스플레이 장치에 적절하게 연결되어 있는지 확인하고 기기를 켭니다. 설정 모드에서 판독값을 0(0.00g)으로 설정하고 제공된 테스트 추(5.00g)를 von Frey 프로브의 원뿔에 부드럽게 놓습니다.
2. 실험실 노트에 판독 값을 기록하고 테스트 세션이 끝나면 이 절차를 반복합니다. 테스트 세션 전후의 테스트 분동 판독값 사이에 0.20g 이상의 불일치가 있거나 테스트 분동이 적용된 후 판독값이 변동하는 경우 장치(제조업체에 의해)를 재교정해야 할 수 있습니다.
3. 마우스 뒷발의 철수 임계값을 평가하려면 프로브와 함께 제공된 팁 중에서 적절한 폴리프로필렌 팁을 사용하십시오. 팁 선택은 프로브하는 조직에 따라 다릅니다. 단단한 팁은 덜 민감하고 단단한 뒷발 조직에 잘 작동하는 반면, 반 유연한 팁은 항문 생식기 융기와 같은 더 부드러운 부위에 더 나은 선택일 수 있습니다(Chatterjea, 미발표). 단단한 팁을 프로브의 원뿔에 부드럽게 장착합니다.
4. 최대 적용 압력을 기록하려면 최대 적용 압력이 디스플레이에 기록되도록 작동 모드를 설정에서 작동으로 전환하십시오. 이 모드에서는 프로브가 집어넣을 때 최대 적용 압력 판독값이 디스플레이 화면에 저장됩니다.

3. 뒷발 인출 임계값 평가에 대한 일반적인 고려 사항

1. 이상적으로는 EvF 장치를 사용하여 뒷발 철수 임계값(기계적 민감도)을 측정하기 위해 두 명의 조사관이 필요합니다 - 한 명은 장치를 작동하고 측정을 수행하고, 다른 한 명은 기록된 측정을 기록하고 마우스를 처리합니다.
2. 편향을 줄이기 위해 장치를 작동하는 연구자는 치료 및 기록된 금단 임계값에 대해 블라인드 상태여야 합니다. 또한 측정 간의 일관성을 보장하기 위해 동일한 개인이 모든 기준선 및 실험 철회 임계값을 평가해야 합니다.
3. 조용하고 온도가 조절되는 방에서¹⁴일차와 같은 시간에 모든 측정을 수행하십시오.
4. 측정값을 기록하는 실험자는 각 마우스를 메쉬 바닥 스탠드에 설정된 다중 장치 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 하우징의 개별 챔버에 배치해야 합니다. 구멍이 뚫린 PMMA 뚜껑으로 챔버를 덮고 그 위에 무거운 물체를 올려 쥐가 탈출하지 못하도록 합니다. 스탠드 아래에 흡수재를 놓아 배설된 폐기물을 흡수/수집합니다. 마우스가 기준선 또는 실험적 철수 임계값 평가 전에 챔버에서 15분 동안 적응하도록 합니다 ^6,7,10.
5. 쥐의 뒷발은 메쉬 바닥의 개구부를 통해 쉽게 접근 할 수 있어야합니다. 따라서 메쉬 바닥 스탠드를 브레이크가있는 카트 또는 모든면에서 접근 할 수있는 안정적인 벤치 탑의 편안한 높이에 배치하십시오.
6. 측정하는 동안, 마우스는 측정 챔버 바로 바깥에 놓인 식품 펠릿(¹⁵) 또는 챔버 바닥의 철망을 따라 펜을 두드리거나 실행함으로써 생성되는 매우 미세한 소음으로 주의가 산만해져야 할 수 있지만, 측정 중에는 그렇지 않다. 이렇게 하면 마우스가 가만히 있게 되어 실험자가 더 쉽게 측정을 시작할 수 있습니다.

4. 기준선 뒷발 철수 임계값 평가

1. 첫 번째 기준선 측정은 치료를 시행하기 48시간 전에 수행해야 합니다. 견고한 팁을 장착할 때 프로브를 영점화합니다. 두 손을 사용하여 프로브를 천천히 들어 왼쪽 또는 오른쪽 뒷발의 중간(발바닥 영역)을 자극합니다(두 발이 동일한 치료를 받은 경우).
2. 뒷발 후퇴, 뒷발 핥기 또는 네 발 점프와 같은 정의된 통각 반응 행동이 관찰될 때까지 압력을 점진적으로 증가시킨다^6,10. 다른 조사자에게 관찰된 행동을 유발한 압력을 기록하도록 지시합니다.
3. 인접한 챔버에 위치한 마우스의 인출 임계값을 측정합니다. 각 마우스의 금단 임계값을 한 번씩 평가할 때까지 계속합니다. 앞에서 설명한 대로 각 마우스가 5x로 측정되도록¹⁰번 더 반복합니다.
4. 각 마우스에 대해 5개 측정값의 중앙값을 계산한 다음 각 값이 중앙값에서 얼마나 벗어나는지 계산합니다. 편차가 가장 적은 3개의 값을 선택하고 평균을 구하여 앞서 설명한 대로¹⁰개의 임계값을 구합니다. 이 데모에서는 5개의 값 중 3개를 사용하여 측정을 표준화했습니다. 구체적인 측정 횟수는 실험 설계에 따라 다를 수 있지만 기준선을 평가하기 위해 모든 마우스를 동일한 횟수로 찔러야 합니다.
5. 24시간 후에 기준선 측정을 반복합니다. 마우스당 5회 측정하고 중앙값에 가장 가까운 3개의 평균을 구하여 기준선 금단 임계값을 구합니다.
6. 마우스의 평균 기준선 금단 임계값을 계산하려면 치료 전 48시간 및 24시간에 취한 기준선 금단 임계값의 평균을 계산합니다. 평균 기준선 인출 임계값이 3.50g 미만이거나 두 기준선 임계값이 2.00g 이상 다른 경우 실험에서 마우스를 제외합니다. 이러한 기준은 실험에 참여한 모든 마우스가 일관된 기준선 반응을 보이며, 치료 후 더 낮은 임계값을 관찰할 수 있을 만큼 충분히 높은 기준선 철회 임계값을 갖도록 합니다.
7. 참고: 제외 임계값은 조사하는 조직, 연구된 동물의 균주 및 사용된 팁 유형에 따라 달라집니다. 예를 들어, 3.5g이 ND4 뒷발 조직에 대한 유용한 벤치마크이지만 항문 생식기 융기와 같은 더 부드러운 영역은 더 낮은 배제 임계값이 필요하다는 것을 발견했습니다(Chatterjea, 미발표).
8. 마우스는 치료 그룹에 할당하여 치료를 시행하기 전에 실험 그룹의 평균 금단 기준선이 가능한 한 유사하도록 합니다.

참고: 기준선 측정은 실험 48시간 전에 수행할 수 있습니다. 그러나 치료를 시작하기 전에 일정한 간격으로 최소 2세트의 기준선 측정을 완료해야 합니다.

5. 실험적 뒷발 철수 임계값 평가

1. 실험 설계에 의해 결정된 적절한 시점에서 치료 후 뒷발 철수 역치(기계적 민감도)를 평가합니다. 측정이 완료된 후 즉시 음식과 물을 이용할 수 있는 쥐를 우리로 되돌려 보냅니다.
2. 위에서 설명한 단계를 따르십시오; 특히 여러 시점에서 민감도를 평가해야 하는 경우 (치료된) 뒷발 조직을 과도하게 자극할 가능성을 줄이기 위해 5회 대신 3회 측정을 수행하십시오. 3회 측정 중 2회 측정값이 2.00g 이상 차이가 나는 경우 4번째 측정을 수행합니다.
3. 3회 측정의 평균을 계산하여 각 마우스에 대한 실험적 철회 임계값을 구합니다. 4번의 측정이 수행된 마우스의 경우, 실험적 금단 임계값을 얻기 위해 중앙값에서 가장 적게 벗어나는 3개의 평균을 계산합니다.
4. 특정 시점에서 각 마우스에 대한 델타 인출 임계값을 얻으려면 실험적 철회 임계값에서 기준선을 뺍니다. 모든 마우스와 모든 실험 시점에 대해 반복합니다⁹.
5. 수집된 데이터에 대해 적절한 통계 분석을 수행합니다. 여기에서는 JMP 9.0(SAS, Cary, NC)을 사용하여 일원 분산 분석(One-way ANOVA) 및 Tukey HSD 사후 분석을 수행했습니다.

결과

국소적으로 B. jararaca 독소를 투여하면 ND4 Swiss 수컷 생쥐의 뒷발 촉각 민감도 변화와 조직 부종이 유발됩니다.

45 µg/kg의 B. jararaca 독소를 투여하고 1.5시간 후, ND4 Swiss 수컷 마우스는 기저치보다 3.0 g 낮은 압력에서 뒷발을 떼어냈습니다(Figure 1A). 모든 그룹의 기저치 반응은 약 4.5 g의 가압 시에 나타났으며, 독소 처리 후 실험군 마우스는 1-1.5 g의 가압 시에 뒷발을 떼어냈습니다(데이터 미제시). 생리식염수를 처리한 대조군 마우스는 테스트한 모든 시점에서 기저치와 비교하여 압력 반응의 감소가 거의 또는 전혀 나타나지 않았습니다. 처리된 마우스의 반응 역치 감소는 독소 투여 후 3시간과 6시간에서도 명확하게 유지되었으며(Figure 1A), 24시간 후에는 대조군과 구분이 되지 않았습니다(데이터 미제시). 독소가 투여된 마우스의 뒷발에서는 염증의 특징인 조직 부종이 관찰되었습니다. 독소 투여 1.5시간 후, 앞서 설명된 방식¹⁰으로 측정한 결과, 처리된 뒷발은 기저치보다 1.5 mm 더 두꺼웠으며, 이러한 부종은 3시간과 6시간까지 지속되었습니다(Figure 1B). 반면, 생리식염수를 처리한 발은 실험 기간 동안 부종이나 두께 변화가 나타나지 않았습니다. 여기에 제시된 대표 실험의 경우, 기저치 측정에 총 21마리의 마우스가 사용되었으며, 그중 14마리가 실험 대상으로 선정되었습니다. 이들은 각 그룹 전체의 기저치 평균 반응이 약 4.5 g이 되도록 처리군에 배정되었습니다.

B. jararaca 독소로 인해 유도된 촉각 민감도 변화는 ND4 Swiss 수컷 마우스의 뒷발 내 비만세포 탈과립 및 호중구 유입을 동반합니다.

촉각 민감도 증가 및 조직 부종 외에도, 독소에 노출된 쥐와 생리식염수를 처리한 쥐의 뒷발에서 호중구 유입(그림 2A-B)과 비만세포 탈과립(그림 2C-D)을 평가하였습니다. 호중구는 혈류로부터 병변으로 가장 먼저 유입되는 염증 세포이며, 염증성 통각 수용 반응을 매개하는 것으로 알려져 있습니다^10,16,17. 비만세포는 조직에 상주하는 감시 세포이며¹⁸, 비만세포의 탈과립은 쥐의 뒷발¹⁰ 및 랫드의 경막¹⁹에서 나타나는 통각 수용 반응과 연관이 있는 것으로 밝혀졌습니다.

여기서, 안락사시킨 마우스의 독소 투여 1.5시간 후 수집한 4 µm 파라핀 매립 시상면 족저 조직 절편¹⁰의 hematoxylin-eosin 염색 세포 수를 측정하여 평가한 결과, 독소가 주입된 뒷발로의 호중구 유입이 식염수 처리된 뒷발에 비해 거의 1,000배 증가했음을 확인하였습니다(그림 3A).

식염수를 처리한 발의 경우, 뒷발 조직의 plantar mast cells는 대부분 온전하거나 가벼운 탈과립 현상을 보였습니다(그림 3B). 반대로, 독소에 노출된 뒷발에서는 mast cells의 15-20%에서 중등도 및 광범위한 탈과립 현상이 나타났습니다(그림 3B). 앞서 설명한 조직 절편을 toluidine blue로 염색하고, 이전에 기술된 방법¹⁰에 따라 관찰된 mast cell당 가시적인 과립의 수를 세어 탈과립 상태를 확인하였습니다.

그림 1. 국소적 B. jararaca 독성 물질 투여는 ND4 Swiss 수컷 생쥐의 뒷발 기계적 민감도 변화와 조직 부종을 유발한다. 기초 회피 역치와 기초 발 너비는 발바닥 내 주입 48시간 전과 24시간 전에 측정되었다. B. jararaca 독액 (Bjv; 45 µg/kg) 또는 매개체(식염수) 처리(10 µl). 처치 후 1.5, 3, 6시간에 회피 역치를 평가하였다(A). A중간 발바닥 부위의 평균 발 너비(마우스 좌우 발 너비의 평균값) 조직 부종을 결정하기 위해 이전에 설명한 바와 같이, 베이스라인과 처리 후 1.5, 3, 6시간째에 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정하였다.¹⁰ (B). 유의성은 Sal 투여군과 비교되었다 (* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 각각 0.001). 처리군당 n = 10-11마리의 마우스를 사용하였다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. B. jararaca 독소로 유도된 기계적 민감성은 ND4 Swiss 수컷 마우스의 뒷발에서 비만세포 탈과립 및 호중구 유입을 동반한다. 처리 후 1.5시간에 처리군당 3마리의 마우스를 CO₂로 안락사시켰으며 , 뒷발을 적출하여 10% formalin에 24시간 동안 보관한 후 70% ethanol로 옮겼고, 15% EDTA에서 1-2주 동안 탈칼슘 처리 후 파라핀에 매립하였다. 4 µm 시상 절편을 각각 호중구(A-B)와 비만세포(C-D)를 시각화하기 위해 hematoxylin-eosin(A-B) 및 toluidine blue(C-D)로 염색하였다. 이미지는 표시된 대로 400X 및 1,000X 배율에서 획득하였다. 여기에서 더 큰 이미지 보기.

그림 3. B. jararaca 독소로 유도된 기계적 민감성은 ND4 Swiss 수컷 생쥐의 뒷발에서 비만세포 탈과립 수준의 유의미한 증가와 호중구 유입을 동반한다. 염색된 조직 절편 상의 호중구와 비만세포는 Olympus CX21LED 현미경을 사용하여 계수하였습니다. 호중구는 처리군당 3개의 뒷발에서 뒤꿈치부터 발가락까지 400배 배율로 인접한 시야 내에서 계수하였습니다. (A). 처리군당 3개의 발바닥 패드에서 비만세포 수를 측정하였으며, 세포 경계 외부로 보이는 과립의 수에 따라 탈과립 상태를 다음과 같이 점수화하였다: 온전함(0), 경미함(0-10), 중간(10-20), 광범위함(21+). 이는 앞서 기술한 바와 같다.¹⁰ (B).  동일한 세포를 중복으로 계수하는 것을 방지하기 위해, 뒷발 단면에서 호중구 수와 비만세포 탈과립 수준을 평가한 연구자들은 접안렌즈 레티클에 그려진 격자를 사용하였다. 연구자들은 처치 내용을 알지 못하는 블라인드 상태에서 평가를 진행하였다.s. 유의성은 Sal 투여군 쥐와 비교하였다 (* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 각각 0.001입니다). 처리군당 마우스 수는 n = 3입니다.  더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

금단 반응의 변화 측정은 통증 및 염증의 설치류 모델에서 촉각 민감도의 변화를 평가하는 데 사용되는 중요한 도구입니다. 여기에서 우리는 이 평가를 수행하기 위한 전자 폰 프레이 장치의 유용성을 보여줍니다. 이 기술에는 몇 가지 장점이 있습니다: i) 서로 상당히 가까운 여러 시점에서 여러 마우스에 대해 가해진 압력에 대한 금단 반응을 신속하게 평가할 수 있고, ii) 단일 팁을 사용하여 조직의 작은 영역에 연속적이고 특정한 압력을 가할 수 있으며, iii) 금단 반응을 얻기 위해 가해지는 정확한 압력을 정확하게 측정할 수 있습니다. iv) 행동 평가가 가능한 한 정확하고 객관적인지 확인하기 위해 강력한 기준 컷오프, 제외 기준 및 내부 통제를 쉽게 구현할 수 있습니다.

EvF 분석에 대한 최상의 결과를 보장하기 위한 중요한 단계는 기기의 사전 교정과 일관된 측정 관행입니다. 프로토콜 섹션에 자세히 설명된 대로 기기는 사용 전과 사용 중에 주의해서 다루어야 하며 적절한 교정이 보장되어야 합니다. 측정을 수행하기 전에 최적의 기계 기능을 보장하기 위해 테스트 중량 판독값을 확인해야 합니다. 판독값이 크게 변동하거나 테스트 분동 판독값이 정확하지 않은 경우 즉시 제조업체에 연락하여 장치를 교정해야 합니다. 이를 염두에 두고 예상치 못한 기기 교정 필요성으로 인해 시간에 민감한 실험을 손상시키지 않도록 가능하면 백업 전자 von Frey 장치를 보유하는 것이 좋습니다. 또한, 잘 훈련된 단일 조사자는 치료 그룹에 대해 눈이 멀면서 주어진 연구 또는 일련의 실험에 대한 모든 기준선 및 실험 측정을 수행해야 합니다. 마우스는 조용한 방에서 평가해야 하며, 일정한 온도로 유지되어야 하며, 최소 15분 동안 EvF 챔버에 적응되 스트레스 및 불편함으로 인한 행동 변화를 최소화하기 위해 필요 이상으로 오래 챔버에 구속되지 않아야 합니다(특히 하루 이내에 여러 번 측정하는 경우).

EvF 측정은 기존 CvF 기술과 관련하여 상당한 개선을 제공합니다. 연구자들은 지속적인 압력을 가할 수 있으며 CvF 필라멘트 실험에서 수행되는 것처럼 다양한 무게의 팁 사이를 전환할 필요가^{없습니다 6.} 이로 인해 조직에 찌르는 횟수가 줄어들며, 이는 특히 염증이 있거나 손상된 조직의 경우와 관련이 있습니다. CvF 측정에 사용되는 사용 가능한 필라멘트 무게에 의해 제한되는 50% 인출 측정을 사용하는 것과 비교하여 인출이 발생하는 정확한 압력을 측정할 수 있습니다¹³. 합리적이고 균일한 제외 기준이 구현될 수 있기 때문에(위에서 논의한 대로) 모든 그룹이 실험 시작 시 유사한 평균 기준선을 갖도록 마우스를 실험 그룹에 할당할 수 있습니다. EvF 측정은 절대 반응 자체가 아닌 주어진 자극에 대한 행동 반응의 변화를 평가합니다. 따라서 각 마우스의 통각 수용 반응 변화는 개별 실험 철수와 기준선 철수 사이의 차이로 측정되므로 수행된 모든 측정에 대한 내부 제어를 제공합니다.

아마도 EvF의 가장 중요한 한계는 수동 측정과 유사하게 동일한 연구자가 특정 일련의 기준선 및 실험 측정에 대해 모든 측정을 수행해야 한다는 것입니다. 이로 인해 시간, 인력 및 장비의 관점에서 기술을 확장하는 것이 어렵습니다. 우리는 한 번에 ~20마리의 마우스(분석 챔버의 구성에 따라 다름)가 측정 사이에 최소 45분이 있는 경우 여러 시점에서 30-45분 이내에 측정할 수 있음을 발견했습니다. 이와 관련하여 관련된 고려 사항은 개별 실험자의 학습 곡선입니다. 개별 연구자가 본격적인 실험을 시작하기 전에 내부 일관성을 설정해야 하며, 이를 위해서는 원하는 일관성에 도달할 때까지 반복적인 기본 반응 측정을 포함하는 많은 시간의 헌신적인 연습이 필요합니다. 또한 기준선 컷오프를 사용한다는 것은 실험을 위해 기준선이 설정된 모든 마우스가 포함될 수 없음을 의미합니다. 우리는 실험당 기준선이 설정된 마우스의 25-30%가 일반적으로 제외된다는 것을 발견했습니다.

수정 및 향후 적용 측면에서 EvF 행동 측정은 염증 병리의 기초가 될 수 있는 수반되는 급성 및/또는 만성 통증을 분석하기 위해 광범위한 염증 모델에 강력한 차원을 추가합니다. 독 분석에서 우리는 촉각 민감도의 뚜렷하고 빠른 발병 변화가 ND4 수컷 마우스의 뒷발에서 조직 부종, 백혈구 모집 및 비만 세포 탈과립의 예상 결과를 동반한다는 것을 발견했습니다. 이러한 발견은 CvF²¹을 사용하여 측정한 ND4 스위스 마우스에서 쥐의 열 민감도²⁰ 및 B. jararaca 독에 의해 유도된 기계적 민감도에 대한 비만 세포 매개체의 기여에 대한 이전 관찰을 확증합니다. EvF 프로토콜은 뒷발 이외의 조직(예: 현재 CvF가 사용되는 복부⁷ 및 항문 생식기 능선⁸)에 사용하도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 알레르기, 상처 치유, 신경병증 및 기타 병리의 설치류 모델은 뒷발을 포함하거나 그 너머의 조직에서 기계적 민감도 측정을 포함하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.

요약하면, EvF는 설치류의 통각 수용 측정에 대한 고전적인 접근 방식을 업데이트하는 유용하고 효과적인 기술이며 다양한 질병 모델에서 통증의 복잡한 기본 메커니즘을 조사하는 데 중요한 새로운 도구입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
여기에 사용된 ND4 스위스 수컷 마우스	Harlan	0-32	마우스는 생후 8-12주였으며 Macaleter College의 IACUC 지침에 따라 수용 및 사용되었습니다.
3 ml/100 인슐린 주사기와 29 G 1/2 in needle	BD	BD309301	사용 후 적절한 용기에 폐기하십시오.
B. jararaca 독	Sigma	V5625	주의: 독성 물질. 눈과 피부 보호구를 착용하십시오. 멸균 0.9% 식염수에 녹입니다.
전자 폰 프레이 장치; 프로브 = 90g 범위	IITC	2394	부드럽게 움직이고 항상 수평인지 확인하십시오. 프로브를 영점 조정하려면 "프로그램" 및 "지우기"를 누르십시오. 설정에서 작동 모드로 전환하려면 "기능"("MH" 판독의 경우) 또는 "MAX"를 누릅니다.
메쉬 스탠드 + PMMA 챔버	IITC	410	모든 면에 접근할 수 있도록 안정된 벤치 탑 또는 4개의 바퀴가 있는 카트에 놓습니다.
Electronic von Frey 리지드 팁만, 90g 범위	IITC	2390	해당 없음