허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

Bruno B. Queliconi; Alicia J. Kowaltowski; Keith Nehrke

doi:10.3791/51231

방법 논문

허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델

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⸱

DOI:

10.3791/51231

⸱

2014년 3월 11일

Bruno B. Queliconi¹ , Alicia J. Kowaltowski¹ , Keith Nehrke²

¹Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, ²Department of Medicine, Nephrology Division, University of Rochester Medical Center, School of Medicine and Dentistry

이 논문에서

요약

프로토콜은 C에서 산소 결핍 / 기아를 사용하는 설명 허혈 / 재관류를 모델로 엘레. 기능적 결과는 사망률 증가, GFP - 라벨의 연결 과정에서 볼 수 이상 및 신경 세포의 기능을 필요로 장애 행동 반응 (가) 있습니다.

초록

유전자 모델 생물 C. elegans의에서 산소 결핍 / 기아에 대한 프로토콜은 허혈 / 재관류를 시뮬레이션 할 수 있습니다. 웜은 세균 음식에서 분리 무산소 아래에 배치 20 시간 (시뮬레이션 국소 빈혈)에, 이후 음식 (시뮬레이션 재관류)와 일반 대기로 이동합니다. 증가 죽음과 신경 손상과 기술이 실험 패러다임의 결과는 유기체의 생존, 터치 신경 프로세스의 형태로 변경뿐만 아니라 신경 기능의 동작 출력을 나타내는 터치 감도를 평가하기 위해 제공됩니다. 마지막으로, 일반 부엌 저장 용기를 사용하는 저산소 배양기를 구성하기위한 방법을 설명한다. 변경이 지정 인큐베이터에서 가스 혼합물에 수행되어야하고, 순환 수조 모두 온도 제어를 허용하고 쉽게 누출을 식별 할 수있게하기위한 유량 제어 유닛의 추가는 허용한다. 이 방법은 시판하는 저비용의 대안을 제공한다사용할 수있는 제품.

서론

C. elegans의 널리 브레너 ^1에 의해 처음 소개 된 이후 다세포 진핵 세포 모델 생물로 채택 된 선충이다. 그것은 유전 변경과 표현형 사이에 쉽게 링크 ^2를 변경 할 수있는 저렴하고 간단하고 다양한 모델입니다.

허혈은 반응성 산소 종의 파열은 ^3을 제조하고 손상의 대부분이 발생된다 재관류 하였다 영양분과 조직에 산소 공급의 부족에 의해 특징된다. 2002 년, C.에서 허혈 / 재관류 (IR)의 모델 엘레 정상 조건에서 24 시간 뒤에 약 20 시간 동안 산소 결핍, 영양 결핍과 열 스트레스에 전체 웜을 제출 관련 ^4를 개발했다. 이 모델은 기술적으로 산소 결핍 - 기아 (AS)이지만 상태, 세포 죽음은 재관류 동안 산화제에 의해 유도 된 손상을 포함하여 포유 동물에 보존되어 메커니즘을 통해 발생 ^{5. AS C.에 의해 유도 또한, 포유류의 IR과 유사한 손상 엘레 허혈 ^6,7 또는 마취 전 처치 ^8,9 방지 할 수있다.}

아래의 프로토콜은 C에서 IR을 모방하는 방법을 보여줍니다 엘레 AS로 인한 형태 학적 및 행동 이상을 득점하는 방법, AS 모델을 사용하는 방법과 실험 맞춤 제작, 쉽게 구성된 챔버의 대안을 사용하여 낮은 초기 투자를 실시 할 수 있도록하는 방법으로 프로토콜을 적용하는 방법 .

프로토콜

1. C. 엘레 성장

표준 재배 방법 ¹ 당 OP50 박테리아와 시드 35mm 선충류 성장 미디어 (NGM) 한천 플레이트, 준비합니다.
시드 NGM 판에 6 임신하는 성인을 배치하여 C. elegans의 동기화. ~ 100 계란 (~ 3의 시간)을 배치 한 후 성인을 제거합니다.
벌레가 젊은 성인 단계로 개발이 실험을 위해 최적화되어있다 할 시점에서 20 ° C에서 3 일, 대한 번호판을 품어. C. 동기화하는 다른 프로토콜 엘레 다른 곳에서 ^10에 설명되어 있습니다.

2. AS 용 재료

M9 완충액 (22 mM의 KH ₂ PO _4, 42 mM의 나 ₂ HPO _4, 86 mM의 염화나트륨, 1 mM의 _MgSO4로)가 N _2로 평형화하여 산소로 퍼징한다 실험 전에 30 분 동안 (아르곤은 또한 사용될 수있다) 얼음에 둘러싸여 있었다.
작은 구멍 (3mm 만들기) 폭은 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브의 뚜껑에있는 벌레는 AS 동안 배치됩니다. 이 과도한 미디어의 증발로 이어질 수있는 구멍은, 뚜껑을 열어 유지하지 않고 가스를 교환 할 수 있습니다.

3. 산소 결핍 / 기아

적어도 중으로 모든 실험을 실시한다.
상술 한 바와 같이 성장 젊은 성인 벌레를 포함하는 각 35mm 판에 RT 1 ㎖, 산소 M9 버퍼를 추가합니다. (박테리아가 접종되지 않은 가장자리에 M9 추가) 판에서 박테리아를 제거하지 않도록주의하십시오. ~ 1 분 후에 벌레는 M9에서 수영을해야합니다.
피펫 및 멸균 1 % BSA 솔루션을 추방하여 코트 BSA와 1 ㎖ 피펫 팁을.
정중 M9 버퍼에 웜을 포함하는 플레이트를 기울여, 그것이 첨가 같은 장소에서 M9을 제거하고, 제조 된 마이크로 원심 튜브에 서스펜션을 배치. 웜은 튜브의 바닥에 떨어졌다 때까지 얼음에 나머지를하자 (1 ~-2 분).
(약 100 μl를 떠나) 튜브에서 벌레를 방해하지 않고 가능한 M9의 최대 양을 제거, 산소 제거 및 아이스 M9의 1 ML을 추가하고 벌레가 다시 바닥에 정착 할 때까지 얼음에 튜브를 배치합니다. 마지막 단계의 3 배를 반복합니다. ~ 100 μL는 튜브에 남아 때까지 마지막 세척에서, M9를 제거합니다.
(3.6.2 절, 아래의 방법을 참고하십시오) 지정 밀폐 용기에, 또는, (아래의 지시 사항, 3.6.1 절 참조) 또는 무산소 / 저산소 챔버 내부에 환원 된 M9의 벌레와 튜브를 놓습니다.
1. 시판의 무산소 / 저산소 챔버가 사용되는 경우, 단계 3.5를 시작하기 전에, 챔버 내부에 일부 치환 M9를 남기고 웜 챔버 내부 일단 단계 5를 반복한다.
2. 커스텀 챔버가 사용될 경우, 저비용 장치를 생성하는 방법의 상세한 설명은이 프로토콜의 단부에 제공된다 ^(11)과 이전에 다른 그룹에 의해 설명되었다. 간단히 :
  1. 250 ㎖의 유리 섬유 복합 재질의 타입 용기 뚜껑에 두 개의 구멍을 만들어 그들에게 튜브 커넥터를 추가합니다. 하나는 다른 수조에 가스 출구 것이다 동안 가스 혼합물을 주입하기 위해 사용된다.
  2. 챔버에 벌레를 넣고 뚜껑을 사용하여 챔버를 밀봉.
  3. 상수 N ₂ 플럭스 (100 ㎖ / 분)와 가스.
  4. 26 ℃의 물을 욕조 안에 컨테이너를 배치 누수가 (실 자체에서 발생하는 기포에 의한 명백한) 시스템에 없는지없이 공기가 반환되도록 출구 관은 물에 잘 포장되어 있는지 확인합니다.
20 시간 동안 26 ° C에서 벌레를 품어.

4. 시뮬레이션 재관류

AS 조건에서 20 시간 후, 실내 공기에 배양 챔버에서 튜브를 제거합니다.
피펫 C. OP50 상 (단계 3.3에서와 같이) BSA 코팅 된 팁 엘레 35mm NGM 플레이트를 시드. 24 시간 동안 20 ° C에서 접시를 품어.이 후, 벌레가 득점 할 준비가 될 것입니다.

5. 라이브 웜 수스가 죽은 확인

백금 픽을 사용하여 가볍게 웜의 머리의 상단을 터치합니다. 라이브 벌레는 터치 후 뒤로 이동합니다. 벌레가 응답하지 않는 경우, 죽은로 점수. 때때로, 웜은 뒤로 이동하지 않지만 약간 옆으로 머리의 움직임을 보일 수 있습니다. 기술적으로 죽은하지 않지만, 이러한 웜은 시간 이내에 만료 거의 확실하고, 죽음으로 채점한다. 하나는 웜 점수를하는 데 시간이 너무 오래 기다리는 경우, 자손의 내부 부화가 발생할 수 있으며, 이러한 "가방 - 중 - 웜은"매우 어려운 시체를 검출하고, 파열 할 수 있습니다.
그들이 중복 계산을 피하기 위해 계산 될 때 플레이트에서 모두 라이브와 죽은 벌레를 제거합니다. 라이브 웜 행동 분석을 수행하기 위해 별도의 플레이트로 이동 될 수있다. 전체를 기준으로 사는 벌레의 양이 남아있는 벌레의 %로 표시됩니다 (그림 1A ).

6. 응답 분석을 터치

이 프로토콜에 대한 자세한 설명은 하트 앤 C., ED에 제시되어 있습니다. 동작 (2006년 7월 3일), WormBook, 에디션. C. elegans의 연구 커뮤니티, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
1. 터치 반응에 대한 점수를하기 위해 이동하고 가볍게 속눈썹 선택 (그림 3)과 (인두의 중간 부분 근처) 웜의 머리의 측면을 터치하는 웜을 식별합니다.
2. 웜이 뒤로 이동하는 경우 같은 응답 점수를, 그렇지 않은 경우 (그림 1B)로 응답하지 않는 점수. 10 초 간격으로 각각의 벌레에 대해이 단계 10 - 15 배를 반복합니다. 정확한 데이터를 가지고 각 그룹에서 최소 10 벌레를 조사. 동일한 분석은 후부 체벽에 가볍게 누르고 다음 순방향 locomotory 변화를 평가하기 위해 사용될 수있다. 이 별개의 행동을 자극하기 때문에 웜의 머리 또는 꼬리에 닿지 않도록해야합니다.
3. 마지막으로,에기업 유전자 제어 계통 [네거티브에 대한 긍정적, 멕 (mechanosensory) 돌연변이에 대한 N2 브리스톨 야생 형 - 예를 들어, CB1338 MEC-3 (e1338) IV] 벌레를 터치로 힘을 보정한다. 자극이 너무 가혹한도 조금 야생형 N2 컨트롤에 효과를 유도하지 않습니다, 멕 돌연변이의 행동 반응을 유도 할 것이다.

7. 신경 수정

의 연결을 수정 AS 포스트를 시각화 터치 응답 멕 신경 ^4,5에 GFP를 표현하는 변형을 사용합니다. 이 신경 세포는 신체의 벽을 따라 실행하고 쉽게 형태 학적 이상 득점하는 긴 과정이있다. 또, 형태 학적 정보는 전술 한 바와 같이, 신경 기능의 행동 대책과 통합 될 수있다. 이 목적을 위해 사용될 수있는 하나의 균주 C.에서 사용할 TU2583이며 엘레 유전학 센터 이리저리 GFP를 표현 uIs25 통합 형질 전환 유전자를 포함통합 MEC-3 :: GFP 융합을 포함하는 MEC-18 프로모터, 또는 대안 TU2562을 해요.
아가로 오스 패드를 준비합니다.
1. 물에 10 배 주식으로 M9을 배일 가지고, 70 ℃에서 솔루션을 유지 아가로 오스 2 %를 용융
2. 자신의 바닥면에 테이프의 한 조각이 각각 다른 두 슬라이드 사이에 배치 된 유리 슬라이드 (X 75mm 25mm)에이 솔루션의 드롭 (~ 20 μL)을 놓습니다.
3. 2 % 아가로 오스 솔루션의 맨 첫 번째에 수직 최종 유리 슬라이드를 배치하고, 실온에서 냉각 할 수 있습니다. 이는 테이프의 두께 패드를 형성한다.
4. 상단 슬라이드를 제거하고 벌레를 무력화합니다 0.1 % tetramisole를 포함하는 M9의 10 μl를 추가합니다.
2 % 아가로 오스 슬라이드에 벌레를 사는 일부 (~ 10)로 이동합니다. 그들에 커버 슬립을 놓고 적절한 조명과 100X 목적에 따라 형광 현미경을 이용하여 GFP를 시각화.
손상된뉴런은 프로세스 (그림 2B) 깨진 것으로 나타 세포질 막 여러 누점 (그림 2A)로 구성 과정에서 진주 패턴의 문자열, 및 / 또는 이상을 보여줄 것이다. 적어도 10 벌레의 총을 사용하여 각 웜 모두 신경에있는 눈물 점 이상을 계산합니다.

8. 실험실에서 만든 저산소 챔버

유리 섬유 복합 재질의 스타일, 밀봉, 밀폐 용기는 무산소 챔버로 개조 할 수있다. 가능한 한 작은 컨테이너를 선택하는데주의를 기울여야. 작은 컨테이너는 빠른 저산소 환경을 생성하고 (그림 4) 물을 욕조에 맞게하는 것이 더 쉽습니다.
뚜껑에 두 개의 구멍이 (드라이버 또는 집게를 가열하고 뚜껑에 강제로 수행 할 수 있습니다) 확인하고 튜브 (그림 5A)을 맞는 플라스틱 또는 금속 커넥터를 삽입합니다. 물에 배치 할 수있는 접착제를 사용하고, 또한 운동을 피하고, 건조 후 힘들어커넥터 따라서 누설의 가능성 (도 5b)을 감소시킨다.
그것이 (도 4) 완전히 잠기도록 용기는 수조에 배치되어야한다. 용기를 체험하기 위해, 병의 중량 다이빙 무게를 사용합니다.
관 연결 중 하나는 가스 혼합물을 도입하고 다른 튜브 용기가 외부 환경 (도 4)로부터 밀폐 차단되도록 따라서는 물 아래 두어야, 압력 완화 역할을 사용한다.
공기 조성물 주문품 가스 질량 흐름 제어기 또는 원하는 가스 혼합물 어떠한 장치를 사용하여 변조 될 수있다. 높은 유동은 과도한 증발을 만들 수있는 가스 유동이 제어되어야한다. 예를 들어, 250 ml의 용기에 가스를 100 ㎖ / 분 웜 좋은 공간과 적절한 유량을 제공 할 것입니다.
그들은 가스, 투과 될 수있는 튜브의 길이는 최소로 유지되어야llowing O _2의 입구. 이러한 물질이 가스 교환에 투과성으로 실리콘을 사용하지 않도록하는 것이 중요하다, 타이곤은 관. 우리는 폴리 프로필렌 또는 나일론 튜브를 선호합니다. 유리 또는 금속 튜브가 아니라 가스를 유지뿐만 아니라 작업하기 어렵습니다.

결과

C.를 쓰는 사용자 지정 연구실 만든 배양 챔버에서 AS에서 26 ° C의 20 시간에 elegans의 설명 (3.6.2 절)가 중요한 사망률 (그림 1A)의 결과로 ^5. 생존자의 GFP 표지의 연결 과정에서 눈물 점과 휴식의 후속 형광 이미징은 형태 학적 이상 소견의 존재 (그림 2) 확인했다. 생존자는 가벼운 몸 벽 터치 (그림 1B)에 제대로 대응했다. 이 모델은 유전 적 소인, 제약의 개입, 그리고 신진 대사 가소성이 AS 따라 결과 ^{4-6,8,9,12,13에} 미치는 ^영향을 연구하기 위해 여러 그룹에 의해 사용되고 있습니다.

figure-results-1
그림 1. C. elegans의 생존과 터치 반응 후24 시간 후 AS 생존을 전시 웜의 AS.) 비율입니다. N2 균주는 야생형 유전자 배경, 그리고 KWN85는 C. 생활의 자극을 터치하는 GFP. B와 멕 뉴런 레이블 통합 유전자) 응답을 포함 AS 후 엘레 (N2 균주). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2. 이러한 고통스러운 과정 및 휴식 (A) 또는 프로세스 (B)에서 GFP의 집계 축적 한 후 신경 세포의 수정을 누릅니다. 터치 신경을 (PLML 및 PLMR) 이상이 생존에 감시했다 C. 마취 eleg ANS AS 후.

figure-results-3
그림 3. 속눈썹 선택. 조립 속눈썹 선택. 삽입에 속눈썹의 세부 사항 이쑤시개 나무에 붙어.

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그림 4. 실험실에서 만든 수조 내부에 저산소 실. 실험을 시작할 준비가 밀폐 용기. 화살표는 가스 입구와 출구 및 부동에서 보관하는 데 사용되는 병의 무게를 나타냅니다.

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그림 5. 용기 뚜껑의 내부와 외부 측면의 세부 사항. 이전에 만들어진 구멍에 연결된 튜브 커넥터를 나타내는 이전에 만들어진 구멍. B) 용기 뚜껑의 외측에 부착 된 튜브와 커넥터를 나타내는 용기 뚜껑의 A) 외측.

토론

널리 C.에 사용 된 AS IR 부상을 모델로 엘레. 몇 가지 주요 포인트는이 프로토콜에 대한 강조해야 C. elegans의이 시스템을 사용하여 죽음을 달성하기 위해 3 수반하는 모욕 (열, 기아와 산소 결핍)의 필요성을 정당화, 상해의 다양한 배열에 저항. 단독 무산소 시간이 ^14이 창에 벌레를 죽이지 않습니다. 또한, 온도 상승은 추가적인 응력이므로 밀접하게 모니터링하는 것이 중요하다. 엄밀히 말하면, 기아 라기 ^{7 관찰} 치사율의 정도에 크게 기여하지 않지만 실험 복제물 사이 변동을 줄이기 위해 나타난다. 일상에서 중요한 변화가있을 수 있음을 감안할 때, 그것은 샘플을 병렬로 직접 실행할 비교하고, 여러 일 동안의 실험을 반복하는 것이 매우 중요합니다. 일반적으로, 결과는 50 ~ 100 웜의 세 개의 판 / 실험 조건을 측정하고 이들은된다N 평균과 하나의 실험적인 복제로 간주. 일반적으로, 일곱 사이에 아홉 개의 반복 달성 또는 통계적 유의성을 배제하기에 충분한 것으로 보인다.

실험에 사용 된 웜의 발달 단계는 손상이 크게 변화한다 ^15,16 신중에 다른 단계의 감수성으로 모니터링 할 필요가있다. 젊은 성인의 사용은 표준이며, 애벌레 단계 (L3 및 L4) 웜은 AS (게시되지 않은 데이터)의 손상 효과에 강한 것으로 보인다.

이 프로토콜은 실험을 수행하는 두 가지 방법, 시판의 ^4,6 저산소 ^챔버를 사용하고, 다른 (타파웨어 형 용기 및 가스 입력 ^(11)을 사용하여) 랩으로 만든기구를 사용하여 하나를 제시한다. 그 밖에 ^13,17 바와 같이 무산소는, 산소를 소비하는 다른 수단에 의해 달성 될 수있다. 저산소 환경을 만들 수있는 대체 기술의 사용이 필요 AS 배양 시간을 변경할 수 있습니다죽음의 원하는 금액을 만들 수 있습니다. 80 %는 AS의 해로운 영향을 악화 개입 유사 이상적입니다 동안 ~ 20 %의 생존율을 대상으로하는 것은, 보호 개입 공부를위한 이상적인 출발점입니다. 또 다른 중요한주의해야 할 점은에서 관찰자 점수 살아 / 죽은 벌레의 시간입니다. 분석 시간이 24 시간 이상으로 확장되면 죽은 벌레가 식별 할 점점 더 어려워지고 있기 때문에, 데이터는 오해의 소지가있을 수있다. 이는 웜의 시체가 시간이 지남에 따라 상대적으로 투명 해지고에있을뿐만 아니라, 수정 된 배아가 시체의 내부 자손 사후에 개발하고 그들이 등장으로 그들을 방해 할 수 있다는 사실에있다.

신경원 형태의 분석은 단백질 발현 패턴 ^(18), 핵 분열 ⁴ 및 해당 부호화 유전자 마커를 발현하는 웜 균주 대체하여 다른 파라미터들 ^{(19)을보고하기} 위해 수정 될 수있다. 마지막으로주의 할 점은 그의 시각화신경 프로세스는 슬라이드에 벌레를 배치 한 후보다 30 분을 수행해야합니다. 긴 기간은 AS 독립적 인 손상을 나타낼 수에 대한 동물 슬라이드에 마취 유지. 그들을 추적하고 분석하는 데 필요한 시간에 따른 슬라이드 당 동물의 양을 조정한다.

공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

그림 1과 2는 이전에 유리기 생물학과 의학 (Queliconi 등. ^5)에 게시 및 엘스 비어가 보유한 저작권을 가지고 있었다. 이 작품은에 의해 지원되었다 Fundação 데 앰 파로 à Pesquisa 에스 타도 데 상파울루 (FAPESP), INSTITUTO 나시 오날 데 Ciência 전자 Tecnologia 데 Processos 산화 환원 EM Biomedicina, Pesquisa 데 Processos 산화 환원 EM Biomedicina, USPHS NS064945 (KN) à Núcleo 드 Apoio 및 USPHS GM087483 (KN을 ). BBQ는 FAPESP의 교제가 지원하는 박사 과정의 학생입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
N2 변형	CGC		와일드 타입 변형률. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)	CGC	TU2583	통합 형광 이식유전자는 터치 뉴런을 라벨링하는 데 사용됩니다. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
CB1338 mec-3 (e1338)IV	CGC	CB1338	표준 mec-3 돌연변이. 터치에 민감하지 않습니다. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
마이크로 원심분리기 튜브	Eppendorf	0030 120.086
Nikon Eclipse TE2000-U 현미경	니콘 미국	TE2000-U
저온 인큐베이터	Sheldon Manufacturing Inc.	모델 2005
속눈썹 픽			속눈썹 픽은 나무 이쑤시개에 속눈썹을 부착한 다음 이쑤시개를 유리 파스퇴르 피펫에 부착하여 준비할 수 있습니다(<강>그림 3).
Hypoxic Chamber	Coy	8307030	팔라듐 촉매와 CO₂ 컨트롤러가 장착된 저산소 글로브 박스.

참고문헌

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