신경 세포막 매매 동적 세포막 단백질 가능 크게 영향 신경 전달을 제어한다. 지금까지, 그것은 성인의 신경 세포에서 신경 세포 내 이입 매매를 측정하기 위해 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 발현 생체의 급격한 변화를 측정 할 수있는 매우 효과적인, 양적 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
레귤 이입 매매 동적 분의 시간 스케일에서 수용체, 이온 채널 및 전달체 세포 표면 프레젠테이션을 제어함으로써, neuromodulatory 다양한 이벤트를 용이 중앙 메커니즘이다. 개별 단백질의 세포 내 이입 매매를 제어 메커니즘의 폭 넓은 다양성이있다. 인신 분자 토대를 조사 연구는 주로 정량적 외인성 자극 및 유전자 조작에 응답하여 세포막 단백질의 표면 발현의 변화를 측정하는 표면 바이오 티 닐화에 의존했다. 그러나,이 방법은 주로 충실히 성숙한 신경 세포 재생에 중요한 생리 학적 기전을 반영하지 않을 수도 배양 된 세포로 국한되었다. 또한, 배양 세포의 접근은 인신 매매 메커니즘의 지역별 차이를 과소 평가 할 수 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각 준비에 세포 표면의 바이오 티 닐화를 확장하는 방법을 설명합니다. 우리이 방법은 성숙한 신경 세포에서 세포막 단백질 표면 수준의 급격한 변화를 측정하는 고 충실도 접근법을 제공한다는 것을 보여준다. 이 방법은 신경 세포 내 이입 매매의 분야에서 광범위한 유틸리티를 가질 가능성이있다.
서론
세포 내 이입 매매는 필수적인 막 단백질의 다양한 세포막의 프레 젠 테이션을 미세 조정 유비쿼터스 세포 메커니즘입니다. 엔도 시토 시스는 세포 내 환경 1에 필수 영양소를 제공하며, 수용체 활성화 2에 대한 응답으로 수용체 신호 둔감해진다. 확대 원형질막에 리사이클 이입은 별도로 세포 표면 (3)에 단백질 발현 수준을 증가시킴으로써 세포 신호 전달을 향상시킬 수있다. 또한, 멤브레인 인신 매매의 교란은 단백질의 세포 내 이입 매매를 제어하는 분자 메커니즘을 조사 할 필요성을 강조, 수많은 질병과 병적 인 조건 4,5에 연루되어있다. 많은 단백질이 지난 몇 년 동안 증거를 장착 고전 방 clathrin 의존 국제화 메커니즘을 사용하는 동안 여러 방 clathrin 독립적 인 세포 내 이입 메커니즘의 증가 배열의 세포 내 이입 가능성을 제어 것을 보여줍니다단백질 6,7. 따라서, 생리 관련 시스템에서 인신 매매를 촉진하는 세포 내 이입 메커니즘을 조사 할 필요가 상당히 성장했습니다.
뇌의 수용체, 이온 채널과 신경 전달 물질 수송의 세포 내 이입 매매는 시냅스 가소성 8-11 ....
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프로토콜
모든 동물 취급 및 조직 수확은 승인 된 프로토콜 번호를 A1506 (멜리 키앙, PI) 다음, 매사 추세 츠 의과 대학 기관 동물 관리 사용위원회의 대학 (IACUC)의 지침에 따라 수행 하였다.
필수 솔루션
인공 뇌척수 (ACSF) - 신선한 매일 확인
125 밀리미터의 NaCl, 2.5 밀리미터의 KCl, 1.2 ㎜의 NaH 2 PO 4, 1.2 mM의 MgCl2를 2.4 mM의 염화칼슘, 26 mM의 탄산 수소 나트륨, 11 mM의 포도당
참고 : 배 원액으로 ACSF을 준비, 탄산 수소 나트륨과 포도당을 제외하고. 신선한 탄산 수소 나트륨과 포도당으로 보충, 배 주식에서 매일 1X 작업 솔루션을합니다.
자당이 첨가 ACSF (SACSF) - 신선한 매일 확인
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결과
신경원 도파민 수송 체는 세포 라인 16-20에서 PKC의 활성화에 응답 내재화된다. 세포주 및 발현 시스템의 다양한 PKC 유도 DAT 표면 손실을 보여주는 많은보고에도 불구하고, 배양 도파민 뉴런 21-23에서 이러한 발견을 확인하기 위하여 도전되었다. 우리는 직접 DAT 성인 도파민 신경 세포에서 PKC의 활성화에 대한 응답으로 내면화 여부를 테스트하기 위해 마우스 선조체 조각을 사용했다. 슬라이스 준비 후, 슬라이스가 동일한 평면에서 정중선과 조각을 따라 hemisected했다가 37 ° C를 30 분 동안 1 μM 포르, 미리 스틴 산-13 아세테이트 (PMA) ± 처리 하였다 슬라이스는 급속히 냉각되었고, 표면 단백질은 바이오틴과 프로토콜에 기술로서 단리 하였다. 면역 블롯이 DAT 조사해서, 또한 티로신 수산화 효소 (TH)에 대한 한, 병렬, 바이오 티 닐화 시약은 도파민 신경 세포의 모든 세포 액세스를 얻고 여부를 측정합니다. 에서 보듯그림 1 .......
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토론
두뇌에 매우 영향 시냅스 신호 이입 매매, 그것은 양적으로 성인 신경 세포의 표면 단백질 발현의 변화를 측정하기 어려운 입증했다고 오랜 지식에도 불구하고. 이 작품에서 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 생체 레이블을 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을보고합니다. 그들은 시냅스 연결과 자신의 준비 시간 이후에 세포 생존을 위로 유지로 뇌 조각의 준비는, 전기 생리학 레코딩을위한 유틸리티의 오랜 역사를 가지고 있습니다. 또한, 슬라이스 전략은 관심의 다양한 뇌 영역 사이에 특정 시냅스 연결을 유지하기 위해 최적화 할 수 있습니다.
뇌 유래 준비에 신경 세포의 단백질 인신 매매를 조사하는 사전 작업의 대부분은 주로 synaptosomes 및 기본 배양 신경 세포에 의존하고있다. 급성 슬라이스 바이오 티 닐화 접근 방법은 일 중 하나를 통해 몇 가지 장점을 제공합니다양반 : synaptosomes 물리적 축삭에서 제거되.......
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공개 사항
저자는 재정적 이익에게이 작품과 충돌이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 HEM에 NIH 교부금 DA15169 및 DA035224에 의해 투자되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free 소 혈청 알부민 | Sigma | A3059 | |
| 진동 마이크로톰 섹터 | 다양한 | ||
| 쉐이킹 워터 배스 | 다양한 | ||
| 밀리셀 메시 바닥 삽입물 (8 & 마이크로; m 기공 크기) | Millipore | PI8P 012 50 | 손으로 세척하여 재사용 할 수 있습니다 |
참고문헌
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R.
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재인쇄 및 허가
