신경 세포막 매매 동적 세포막 단백질 가능 크게 영향 신경 전달을 제어한다. 지금까지, 그것은 성인의 신경 세포에서 신경 세포 내 이입 매매를 측정하기 위해 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 발현 생체의 급격한 변화를 측정 할 수있는 매우 효과적인, 양적 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
레귤 이입 매매 동적 분의 시간 스케일에서 수용체, 이온 채널 및 전달체 세포 표면 프레젠테이션을 제어함으로써, neuromodulatory 다양한 이벤트를 용이 중앙 메커니즘이다. 개별 단백질의 세포 내 이입 매매를 제어 메커니즘의 폭 넓은 다양성이있다. 인신 분자 토대를 조사 연구는 주로 정량적 외인성 자극 및 유전자 조작에 응답하여 세포막 단백질의 표면 발현의 변화를 측정하는 표면 바이오 티 닐화에 의존했다. 그러나,이 방법은 주로 충실히 성숙한 신경 세포 재생에 중요한 생리 학적 기전을 반영하지 않을 수도 배양 된 세포로 국한되었다. 또한, 배양 세포의 접근은 인신 매매 메커니즘의 지역별 차이를 과소 평가 할 수 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각 준비에 세포 표면의 바이오 티 닐화를 확장하는 방법을 설명합니다. 우리이 방법은 성숙한 신경 세포에서 세포막 단백질 표면 수준의 급격한 변화를 측정하는 고 충실도 접근법을 제공한다는 것을 보여준다. 이 방법은 신경 세포 내 이입 매매의 분야에서 광범위한 유틸리티를 가질 가능성이있다.
서론
세포 내 이입 매매는 필수적인 막 단백질의 다양한 세포막의 프레 젠 테이션을 미세 조정 유비쿼터스 세포 메커니즘입니다. 엔도 시토 시스는 세포 내 환경 1에 필수 영양소를 제공하며, 수용체 활성화 2에 대한 응답으로 수용체 신호 둔감해진다. 확대 원형질막에 리사이클 이입은 별도로 세포 표면 (3)에 단백질 발현 수준을 증가시킴으로써 세포 신호 전달을 향상시킬 수있다. 또한, 멤브레인 인신 매매의 교란은 단백질의 세포 내 이입 매매를 제어하는 분자 메커니즘을 조사 할 필요성을 강조, 수많은 질병과 병적 인 조건 4,5에 연루되어있다. 많은 단백질이 지난 몇 년 동안 증거를 장착 고전 방 clathrin 의존 국제화 메커니즘을 사용하는 동안 여러 방 clathrin 독립적 인 세포 내 이입 메커니즘의 증가 배열의 세포 내 이입 가능성을 제어 것을 보여줍니다단백질 6,7. 따라서, 생리 관련 시스템에서 인신 매매를 촉진하는 세포 내 이입 메커니즘을 조사 할 필요가 상당히 성장했습니다.
뇌의 수용체, 이온 채널과 신경 전달 물질 수송의 세포 내 이입 매매는 시냅스 가소성 8-11 궁극적으로 신경 세포의 흥분성 시냅스 반응에 영향을 남용 12-15의 약물에 반응을 수립 기본 역할을하고 있습니다. 신경 세포의 인신 매매의 대부분의 연구는 이종 발현 시스템 또는 양식 기본 뉴런 하나에 의존하는 현재까지, 어느 것도 확실하게 성인 신경 세포 재생의 메커니즘을 반영 할 수있다. 여기, 우리는 양적으로 성인 설치류에서 파생 된 급성 뇌 조각의 표면 단백질의 수준을 측정하는 표면의 바이오 티 닐화를 사용하는 방법을보고합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 마우스 선조체 도파민 수송 체에 재 빠르게 내부화 입증 자료를 제시포르 볼 에스테르 - 매개 단백질 키나제 C (PKC)의 활성화에 sponse.
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프로토콜
모든 동물 취급 및 조직 수확은 승인 된 프로토콜 번호를 A1506 (멜리 키앙, PI) 다음, 매사 추세 츠 의과 대학 기관 동물 관리 사용위원회의 대학 (IACUC)의 지침에 따라 수행 하였다.
필수 솔루션
인공 뇌척수 (ACSF) - 신선한 매일 확인
125 밀리미터의 NaCl, 2.5 밀리미터의 KCl, 1.2 ㎜의 NaH 2 PO 4, 1.2 mM의 MgCl2를 2.4 mM의 염화칼슘, 26 mM의 탄산 수소 나트륨, 11 mM의 포도당
참고 : 배 원액으로 ACSF을 준비, 탄산 수소 나트륨과 포도당을 제외하고. 신선한 탄산 수소 나트륨과 포도당으로 보충, 배 주식에서 매일 1X 작업 솔루션을합니다.
자당이 첨가 ACSF (SACSF) - 신선한 매일 확인
250 ㎜의 SUC2.5 밀리미터의 KCl, 1.2 ㎜의 NaH 2 PO 4, 1.2 mM의 MgCl2를 2.4 mM의 염화칼슘, 26 mM의 탄산 수소 나트륨, 11 mM의 포도당을 증가
참고 : 배 원액으로 SACSF을 준비, 탄산 수소 나트륨과 포도당을 제외하고. 신선한 탄산 수소 나트륨과 포도당으로 보충, 배 주식에서 매일 1X 작업 솔루션을합니다.
설포-N-hydroxysuccinyl-SS - 비오틴 (설포-NHS-SS-비오틴, 피어스 케미칼)
주식 솔루션은 DMSO 200 ㎎ / ㎖하고 여러 동결 / 해동 사이클에 저항해야한다. 분액 -20 ° C.에 저장됩니다 숙시 닐 에스터 급속 수용액에서 가수 분해되므로, 작업 해법 전에 슬라이스에 적용 즉시 준비되어야한다.
슬라이스 담금질 솔루션
ACSF 100 mM의 글리신과 보충
RIPA 용해 BuffeR
10 mM 트리스, pH 7.4의 150 mM의 염화나트륨, 1.0 mM의 EDTA, 1 % 트리톤-X-100, 0.1 % SDS, 1 % 나 콜산
프로테아제 억제제와 RIPA (RIPA / PI) - 신선한 매일 확인
RIPA는 1 μM의 류 펩틴, 1 μm의 펩 스타틴, 1 μM의 아프로 티닌, 1 밀리미터 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드로 보충.
1. 뇌 조각을 준비한다
- 신선한 1X의 SACSF 및 1X ACSF을
- 작은 비커에 얼음에 SACSF을 풀어. 이 갓 수확 된 마우스의 두뇌를 유지하는 데 사용됩니다.
- 95 % / 5 % O 2 / CO 2, 얼음에 20 분 버블 링에 의해 산소와 ACSF 및 SACSF 포화.
- P30-38 마우스는 최적의 조직의 생존을 위해 사용되어야한다. 자궁 경부 전위와 잘린 동물을 희생하고 빠르게 prechilled, 산소 SACSF에 머리를 제거합니다.
- 진동 마이크로톰을 사용하여, 그 지역에서 300 μm의 뇌 부분을.
- 원하는 경우, 조각은 더 특정 뇌 영역 또는 별도 오른쪽으로 각각 제어 및 실험 슬라이스로 사용할 왼쪽 반구에 풍부하게 복구 이전 해부 할 수 있습니다.
- 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 24 - 웰 플레이트에 설정 챔버 바닥 메쉬에 조각을 전송합니다.
- 슬라이스가 계속, 부드러운 버블 링, 산소 ACSF에서, 40 분 동안 31 ° C를 복구 할 수 있습니다.
2. 약물 치료 (해당되는 경우) 및 슬라이스 바이오 티 닐화
- 복구 후, 예비 가온 (37 ° C), 산소 ACSF의 버블 링에서 지속적으로 95 % / 5 % O 2 / CO 2 조각을 씻어 배.
- 시험 물질을 추가하고 지속적으로 산소와 부화.
- 편의를 위해, 10 배 농축 된 약물의 1 / 10 번째 볼륨을 추가하고 부드럽게 반전 섞는다.
- 온화하게 원하는 온도에서 수욕 플레이트를 흔들어.
- 다음 약물 치료, 급속차가운 얼음 ACSF에 배를 세척하여 냉기의 조각.
3. Biotinylate 표면 단백질
- 바로 전에 라벨에 차가운 얼음 ACSF의 준비 1.0 ㎎ / ㎖ 설포-NHS-SS - 비오틴.
- 슬라이스 설포-NHS-SS - 비오틴 825 mL를 넣고 얼음, 45 분에 슬라이스를 품어.
- 얼음에 차가운 얼음 ACSF에서 10 분 동안 배양 한 다음, 얼음 차가운 ACSF 빠르게 조각을 세 번 씻으십시오.
- 차가운 얼음 조각 끄다 버퍼 조각을 세 번 세척하고 무료 설포-NHS-SS - 비오틴을 종결 825 ㎖의 슬라이스 급냉 버퍼와 얼음에 두 번, 25 분을 품어.
4. 조직 해물을 준비
- 차가운 얼음 ACSF의 조각을 세 번 세척하고 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 microcentrifuge 관에 각 조각을 전송합니다.
- 부드럽게 200 XG, 1 분 조심스럽게 대기음 나머지 ACSF을 원심 분리하여 슬라이스를 펠렛.
- 400 μL 차가운 얼음 RIPA / PI를 추가로 pipetting하여 조직을 파괴하고 아래로 한 번 P200 핍을 통해ETTE.
- 전송 신선한 튜브 조각 / RIPA를 분해 및 용해를 완료하기 위해, 회전, 30 분, 4 ° C를 품어.
- 원심 분리하여 세포 파편 펠렛, 18,000 XG, 15 분, 4 ° C.
- 표준으로 소 혈청 알부민 (BSA)와 BCA 단백질 분석법을 사용하여 용 해물의 단백질 농도를 결정한다.
5. 바이오틴 단백질을 분리
- 비드 / 총 단백질 비율을 최적화합니다.
주 : 개별 단백질 발현 수준은 다른 뇌 영역에 걸쳐 광범위하게 변할 수있다. 조직 파쇄물의 주어진 양에서 바이오틴 단백질 모두가 캡처하지 않는 한, 정확하게 표면 발현의 잠재적 인 변화를 감지 할 수 없다. 따라서, 경험적 전에 새로운 슬라이스 바이오 티 닐화 연구 착수시에 특정 단백질 / 뇌 영역에 대한 최적의 비드 / 전체 단백질의 비율을 결정하기 위해 필수적이다.- 증가 금액으로 25 ㎕의 스트렙 타비 딘 아가로 오스의 구슬을 품어, 세척 및 용출 단계를 바인딩 그런 다음 아래의 설명에 따라 조직 용 해물 (대략적인 범위 25 ~ 200 μg), 그리고의 진행.
- 그 결과 면역 반응 대역을 정량화하고 그 증가 또는 단백질의 표면 발현을 감소 하나의 정확한 정량화를 허용합니다 바인딩의 선형 범위의 비드 / 해물 비율을 선택합니다.
- 스트렙 타비 딘 - 아가로 오스의 구슬을 준비
- 모든 샘플에 필요한 총 비드 볼륨을 결정합니다. 25 μL / 샘플 = 100 μl의 구슬 + 하나 추가 = 125 μl의 구슬에 그 금액에 대한 충분한 비드 볼륨을 더한 추가 (즉, 4 샘플을 준비합니다.
- 소용돌이 스트렙 타비 딘 구슬 주식 및 피펫 밖으로 볼륨을 원하는. P200 피펫을 사용하면, 방해 또는 구슬의 손상을 방지하기 위해 팁 단부를 잘라.
- 객실 성질에서 18,000 XG, 1 분을 원심 분리하여 방부제, 각 RIPA 추가 후 소용돌이로 교반 및 세척 사이에 수집 구슬을 제거하기 위해 0.5 ~ 1.0 ㎖의 RIPA / PI에 구슬을 3 회 세척ature.
- 진공 플라스크에 부착 된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 세척 사이의 버퍼를 대기음. 흡입시 유리 파스퇴르 피펫의 단부에 부착 플라스틱 P200 팁은 미세한 제어를 제공한다. 이 피펫으로 흡입 비즈 위험으로는, 우선이 세척 절대적 모든 버퍼를 제거 할 필요가 없다. 최종 세척 후 구슬을 흡입하지 않고 가능한 한 많은 여분의 버퍼를 제거합니다.
- 과에 resuspend 아래로 피펫 팅, 다시 원래 볼륨으로 구슬을 가지고 RIPA / PI를 추가합니다. 비즈 튜브 벽에 붙어있는 바와 같이,이 시점에서 소용돌이로 교반을 피하십시오.
- 끝으로 P200을 사용하여 마이크로 원심 튜브로 나누어지는 비즈 차단. 구슬이 균등하게 중단과 튜브 사이에 분산 남아 보장하기 위해 다운 샘플링 사이에 몇 번을 피펫.
- 구슬을 스트렙 타비 딘에 바인딩 바이오틴 단백질
- 아가로 오스 비즈가 들어있는 튜브에 세포 용 해물을 배포합니다. 실험에 갔지 여러 샘플을 비교되고 다시 정확한 비교를 위해 각 샘플에 대해 동일한 양의 단백질을 사용해야합니다.
- 200 ㎕의 최소한의 볼륨에 샘플을 가지고 추가 RIPA / PI를 추가합니다. 이 샘플을 배양하는 동안 적절하게 혼합하고 또한 샘플에 걸쳐 단백질 농도를 통합 할 확신합니다.
- 관 회전 장치에 튜브를 넣고 4 ℃에서 하룻밤 혼합
- 별도의 튜브에 각각의 샘플에 사용되는 다운로드 용 해물 부피의 등가 분배. 샘플 볼륨이 높은 경우에 대안 적으로, 전체 용해질 부피의 분획을 SDS-PAGE 겔에 최대 부하 볼륨을 수용하기 위해, 대신에 할당 될 수있다. 이들은 총 단백질의 양을 표면 발현을 정상화하는 데 사용됩니다.
- 같은 배의 볼륨이나 배의 SDS-PAGE 샘플 버퍼 1 / 5 볼륨과 하나의 샘플을 분석 할 때까지 -20 ° C에서 비드 샘플, 또는 매장과 동시에 4 ° C, 부화 하나를 추가합니다.
- 실온에서 18,000 XG, 2 분 원심 분리하여 구슬 펠렛.
- 기음 뜨는 세척 구슬 825 ㎖의 RIPA 3 회. 비드 손실을 최소화하기 위해, 세척 간 비즈 상기 버퍼의 작은 머리 부피를 남긴다. 최종 세척 후, 비드 펠렛을 방해하지 않고, 가능한 한 많은 RIPA를 제거합니다.
- 이황화 결합을 감소시켜 스트렙 타비 딘 비즈에서 바이오틴 단백질을 용출. 샘플 버퍼, 소용돌이도를 감소 25 μL 2X SDS-PAGE를 추가하고 샘플 30 분, 실내 온도를 돌립니다.
참고 : 대부분의 막 단백질이 심각 그들의 전기 영동 이동성을 손상, SDS-PAGE 샘플 버퍼에 삶은 때 집계 높은 경향이있다. 이 조사되고 단백질 경우라면, 가열 샘플을 피하고, 대신에, 실온에서 서서히 용출. 비등 (병렬로 평가 다른 단백질이 비등을 필요로하는 경우 예) 절대적으로 필요한 경우, SAMPLE 버퍼는 응집을 최소화하기 위해 2 M 우레아 (최종 농도)로 보충 될 수있다. 어떤 경우에는 응집을 감소시키는 효과가 있지만, 요소는 종종 밴드의 모습을 타협. - 면역 블롯에 의해 샘플을 분석합니다.
- 다운로드 용 해물 샘플을 해동하고 비드 샘플, 30 분간 실온에 평행하게 회전한다.
- SDS-PAGE 젤에 별도의 단백질.
- 면역 블로 그 단백질 (들)을 확인합니다.
- 밴드가 적절한 정량 검출의 선형 범위에서 검출되어 있는지 확인하십시오.
- 바이오 티 닐화 시약이 손상 / 손상 세포를 통해 세포 내 단백질에 대한 액세스 권한을 얻게되지 않았 음을 보장하기 위해. 이것은 가장 조사되는 세포 유형에 특정한 세포 내 단백질을 위해 평행으로 면역 블에 의해 수행된다.
- 밴드 밀도를 정량화 총 단백질 발현 수준의 비율로 상대 단백질 표면 밀도를 산출한다.
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결과
신경원 도파민 수송 체는 세포 라인 16-20에서 PKC의 활성화에 응답 내재화된다. 세포주 및 발현 시스템의 다양한 PKC 유도 DAT 표면 손실을 보여주는 많은보고에도 불구하고, 배양 도파민 뉴런 21-23에서 이러한 발견을 확인하기 위하여 도전되었다. 우리는 직접 DAT 성인 도파민 신경 세포에서 PKC의 활성화에 대한 응답으로 내면화 여부를 테스트하기 위해 마우스 선조체 조각을 사용했다. 슬라이스 준비 후, 슬라이스가 동일한 평면에서 정중선과 조각을 따라 hemisected했다가 37 ° C를 30 분 동안 1 μM 포르, 미리 스틴 산-13 아세테이트 (PMA) ± 처리 하였다 슬라이스는 급속히 냉각되었고, 표면 단백질은 바이오틴과 프로토콜에 기술로서 단리 하였다. 면역 블롯이 DAT 조사해서, 또한 티로신 수산화 효소 (TH)에 대한 한, 병렬, 바이오 티 닐화 시약은 도파민 신경 세포의 모든 세포 액세스를 얻고 여부를 측정합니다. 에서 보듯그림 1 ...
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토론
두뇌에 매우 영향 시냅스 신호 이입 매매, 그것은 양적으로 성인 신경 세포의 표면 단백질 발현의 변화를 측정하기 어려운 입증했다고 오랜 지식에도 불구하고. 이 작품에서 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 생체 레이블을 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을보고합니다. 그들은 시냅스 연결과 자신의 준비 시간 이후에 세포 생존을 위로 유지로 뇌 조각의 준비는, 전기 생리학 레코딩을위한 유틸리티의 오랜 역사를 가지고 있습니다. 또한, 슬라이스 전략은 관심의 다양한 뇌 영역 사이에 특정 시냅스 연결을 유지하기 위해 최적화 할 수 있습니다.
뇌 유래 준비에 신경 세포의 단백질 인신 매매를 조사하는 사전 작업의 대부분은 주로 synaptosomes 및 기본 배양 신경 세포에 의존하고있다. 급성 슬라이스 바이오 티 닐화 접근 방법은 일 중 하나를 통해 몇 가지 장점을 제공합니다양반 : synaptosomes 물리적 축삭에서 제거되...
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공개 사항
저자는 재정적 이익에게이 작품과 충돌이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 HEM에 NIH 교부금 DA15169 및 DA035224에 의해 투자되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free 소 혈청 알부민 | Sigma | A3059 | |
| 진동 마이크로톰 섹터 | 다양한 | ||
| 쉐이킹 워터 배스 | 다양한 | ||
| 밀리셀 메시 바닥 삽입물 (8 & 마이크로; m 기공 크기) | Millipore | PI8P 012 50 | 손으로 세척하여 재사용 할 수 있습니다 |
참고문헌
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