방법 논문

다중 약물 내성을 보여 결핵균 증폭 마이크로 어레이

DOI:

10.3791/51256

⸱

2014년 4월 25일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Akonni Biosystems, Inc.

이 논문에서

요약

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증폭 마이크로 어레이 크게 최종 사용자를위한 마이크로 어레이 플로 간소화 단일 챔버로 비대칭 PCR 증폭 및 마이크로 어레이 혼성화를 결합한다. 마이크로 어레이 워크 플로우를 간소화하는 것은 정기적으로 낮은 자원 환경에서 사용할 수있는 마이크로 어레이 기반의 진단 프로그램을 만들기위한 필요한 첫 번째 단계입니다.

초록

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마이크로 어레이 워크 플로우를 간소화하는 것은 정기적으로 낮은 자원 환경에서 사용할 수있는 MDR-TB 마이크로 어레이 기반의 진단 프로그램을 만들기위한 필요한 첫 번째 단계입니다. 증폭 마이크로 어레이는 단일 솔루션 내의 단일 마이크로 유체 챔버로 비대칭 PCR 증폭, 타겟 사이즈 선택 대상 라벨링 및 마이크로 어레이 혼성화를 결합한다. 일괄 처리 방법은 다중 약물 내성 결핵균 (MDR-TB)을 유전형에 대한 9 복잡한 비대칭 마스터 믹스 저밀도 젤 요소 마이크로 어레이와 함께 보여줍니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 6 시간에 완성 된 게놈 DNA의 적어도 1,000 셀 당량의 정확한 유전자형을 제공 할 수 있습니다. 온칩 세척 단계 통합하면 완전히 폐쇄 된 앰플 리콘 방법 및 시스템에 발생되는, 가능하다. 증폭 마이크로 어레이와 다중화의 범위는 궁극적으로 단일 마스터 m으로 결합 할 수있는 프라이머 쌍의 개수에 의해 제한된다IX 여전히 오히려 어레이에 고정화되는 프로브의 개수보다 원하는 민감도 및 특이도 성능 메트릭을 달성한다. 마찬가지로, 총 분석 시간은 구체적인 용도, 연구 문제 및 소망의 검출 한계에 따라 짧게 또는 길게 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 일반적인 접근은 상당히 노동 집약적 및 시간 소모적 인 처리 단계의 수를 줄임으로써 최종 사용자에 대한 마이크로 어레이 플로를 간소화하고, 일상적인 임상 사례로 마이크로 어레이 기반 진단을 번역을 위해 단순화 된 생화학 적 및 미세 유동 경로를 제공한다.

서론

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초기 증상 감지 및 신속한 치료가 결핵균 (MTB) 전송 1을 줄일 수있는 가장 효과적인 제어 전략으로 간주하고 치료 (POC) 또는 POC 시험 근처의 지점이 동시에 TB를 진단하는 TB 커뮤니티의 폭 넓은 합의가 지금이됩니다 및 약제 내성 (DR)가 필요합니다. 이러한 세 페이드의 GeneXpert 유용한 핵산 증폭 실험 같은 기술은 많은 TB 환자에 대한 진단 시간을 단축하고, 리팜핀 또는 다른 제 또는 제 2 라인 약물이 내성을 부여 선택된 돌연변이에 대한 내성을 나타내는 빠른 판독을 제공한다. 실시간 및 등온 핵산 증폭 검사가 MDR-TB 초래할 약물 내성 돌연변이를 식별하도록 설계되어 있지만, 그들이 검출 돌연변이 스펙트럼은, 환자의 약물 내성 프로파일에 대응하는 개별 약물 요법을 디자인하는 것이 부적절 및 관련 기술 제약광학적 크로스 토크 (cross-talk) 또는 증폭 및보고 케미스트리의 복잡성 3-7 유전자좌 또는 검출 된 돌연변이의 수를 제한 할 수있다. 따라서, 높은 다중 용량 감지 기술은 MDR-TB의 POC 진단에 알려진 격차를 해결하기 위해 필요합니다.

마이크로 어레이 및 WHO 승인 한 Hain의 라인 프로브 분석은 MDR-TB 8-29 진단의 "다중 유전자, 여러 변이"문제를 해결할 수 있습니다. 불행하게도, 이러한 하이브리드 기반의 멀티 플렉스 감지 플랫폼은 다단계, 복잡한 분자 기술에 상당한 훈련과 능력을 필요로 오픈의 증폭 프로토콜을 사용합니다. 증폭 마이크로 어레이 (30)는 이러한 마이크로 어레이 작업 흐름 및 운영 문제 중 일부를 해결하기 위해 설계되었습니다. 단순화 유체 원리는, 증폭 혼성화 및 단일 마이크로 유체 챔버 내 표적 핵산을 검출한다. 사용자는 핵산 증폭 MAS를 소개터가 피펫 유체 챔버에 혼합 및 열 순환 프로토콜을 시작합니다. 여기에 도시 된 배치 프로세싱 방법을 위해, 마이크로 어레이이어서, 벌크 용액으로 세척하고, 건조하고, 이미지화된다. 이 연구는 rpoB에 대한 MDR-TB 마이크로 어레이 검사 (30 돌연변이), katG (2 돌연변이), 인하대 (4 돌연변이), RPSL (2 돌연변이), embB (1 돌연변이), IS1245, IS6110를 사용하여 증폭 마이크로 어레이의 기능을 보여줍니다 , 및 내부 증폭 및 하이브리드 제어 할 수 있습니다. 마이크로 어레이 프로브 (야생형 (WT) 및 단일 염기 변이 (MU)) 중 적어도 하나의 일치하는 쌍은 그 각각의 돌연변이 포함되어 있습니다. 다중 약물 내성 M.보기에서 정제 된 핵산 결핵은 TDR 결핵 균주 은행 (31)이다. 그 밖에 32 바와 같이 젤 요소 마이크로 어레이 우리 polymeriz 각 프로브 4 % 단량체 및 0.05 ㎜를 사용하는 것을 제외하고, 본질적으로 공중합하여 유리 기판 상에 제조된다ATION 혼합물. 배열은 사용하기 전에 50 ㎖ 가스​​켓으로 둘러싸여 있습니다. 열 사이클링, 하이브리드 및 세척 단계 후, 증폭 마이크로 어레이는 Akonni 휴대용 분석기에 몇 군데 있습니다. 배경 보정, 통합 된 신호 강도가 원료에서 얻을 수 있습니다. 고정 원 알고리즘을 사용하여 TIF 이미지가. 각 겔 요소 잡음은 로컬 스폿 배경의 세 배의 표준 편차로 산출된다. 신호대 잡음비 (SNR)에 신호 ≥ 3 값 유전자 대상은 통상적으로 검출 가능한 것으로 간주된다. 각 유전자 또는 코돈에 특이적인 변이의 존재 여부를 결정하기 위해, 판별 비율 (WT-MU) / (WT + MU)로서 SNR 값으로부터 계산된다. 판별 비율 0 야생형 시퀀스를 표시한다 <비율 반면 0, 로커스에서 약물 - 내성 돌연변이를 표시한다>는.

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프로토콜

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보편적 인 PCR주의 사항을 준수 실험실의 경우, 여러 가지 증폭 마이크로 어레이 기판 당 가스켓을 포함하고 여기에 설명 된대로, 벌크 용기에 모두를 동시에 증폭 마이크로 어레이를 세척하는 운영 체제는 더 효율적입니다. 다른 30,33보고 소모품 형식은, 완전히 밀봉 폐쇄의 증폭 검사에서 사후 증폭 마이크로 어레이 세척 단계를 수행 할 수 있습니다.

1. 설치

  1. 추출하고 선택하는 방법과 적절한 바이오 안전성 조건에서 시료로부터 핵산을 정화. 요구 사항은 핵산 비대칭, 멀티 플렉스 PCR 증폭을위한 충분한 순도가 될 것입니다.
  2. 오염 제거 솔루션과 표면 및 장비를 닦아 작업 공간을 준비합니다.
  3. 얼음이나 차가운 블록을 증폭 시약을 놓습니다.
  4. 증폭 마스터 믹스에 대한 멸균 1.5 ML의 미세 원심 분리 튜브를 레이블 및 멸균 0.2 ML의 microfuge TU 레이블각 시료에 대한 수.
  5. 시약은 짧게 소용돌이를 해동 미니 원심 분리기 펄스 스핀 튜브의 바닥에 내용을 수집 한 후. DNA 형성 촉매 효소 와동하지 마십시오. 조심스럽게 혼합하고 미니 원심 분리기 펄스 스핀 따라 튜브를 가볍게.
  6. 표 1에 나타낸 당 샘플 반응 부피를 이용하여 증폭 마스터 믹스를 준비한다. 가능한 피펫의 부정확성을 고려하여, 처리되고있는 샘플들의 총 수보다 적어도 하나 더 반응 부피를 준비한다. 마스터 믹스 추가 DNA 형성 촉매 효소 이상과 muliplex PCR 버퍼와 함께 제공되는 것 이상을 포함합니다. 단지 다른 모든 시약이 결합 된 후 마스터 믹스로 증폭 / 억제 컨트롤을 추가하고, 주식 시약 튜브는 저장에 돌려 보냈다.
시약 별 샘플 볼륨 (μL) <강한> 결승 []
HotStar의 Taq 플러스와 Mulitplex PCR 버퍼 25 1X
소 혈청 알부민 (BSA) 0.55 0.6 ㎎ / ㎖
포름 아미드 3.8 7.6 %
추가 DNA 형성 촉매 효소 0.8 단위 / μL (4 대 총)
MDR-TB 프라이머 믹스 17,325 -
RNA 분해 효소가없는 H 2 O 2.1 -
증폭 / 억제 제어 1 5.0 FG / μL
합계 49

표 1. MDR-TB 증폭 마이크로 어레이 마스터 믹스 조성.

  1. 소용돌이 마스터 믹스와 미니 원심 분리기 펄스 스핀 튜브의 바닥에 내용을 수집합니다.
  2. 마스터 믹스 49 μL와 M.의 1 μl를 결합 위의 단계 1.4에서 샘플 튜브의 각 결핵 DNA. 외부의 경우, 템플릿 컨트롤 (NTC)는 M. 대신에 분자 생물학 등급 물 1 μl를 사용하지 결핵 DNA 샘플. 소용돌이와 펄스 스핀 완료 튜브 (들).

2. 증폭 마이크로 어레이를로드

  1. 마이크로 어레이 자체를 만지지주의하면서, 각각의 마이크로 어레이의 중심에 각 마스터 믹스 / 샘플의 48 μl를 추가합니다.
  2. 마이크로 어레이 챔버에서 공기 방울없는 함정에주의하면서, 마이크로 어레이 가스켓 및 씰의 상단에 커버 슬립을 놓습니다. 기포가 증폭 효율에 부정적인 영향을 미칠 수있다과 유물 또는 이후의 마이크로 어레이 이미지의 노이즈를 만들 수 있습니다.

3. 열 사이클링

  1. 일단 모든 마이크로 어레이는 평면 블록 열 자전거 타는 사람에 대한 샘플, 장소 기판으로로드됩니다. 가열 된 뚜껑 옵션이 "Off"로 설정되어 있는지 확인합니다. Akonni 생물계에서 얻은 장비는 이미 사용 prequalified됩니다. 그렇지 않으면, 평면 블록 열 자전거 타는 사람 (들)의 모든 마이크로 어레이 기판에 걸쳐 (들)을 균일하고 일관된 난방을 제공하는지 확인하는 것이 매우 중요합니다.
  2. , 열 자전거 타는 소프트웨어를 열고 해당 프로그램을 선택, 반응 볼륨에 대해 "50 μl를"입력하고 실행을 시작합니다. 여기에 설명 된 열 순환 프로토콜 구성
    열 순환 단계
    1 88 ° C 5 분
    2 88 ° C 30 초
    3 55 ° C 1 분
    4 65 ° C 30 초
    5 50 사이클 단계 (2-4)를 반복
    6 65 ° C 3 분
    7 55 ° C 3 시간
  3. 총 열 사이클의 수와 55 °의 C 포스트 증폭 대기 시간이 필요하거나 특정 실험에 적합한 사용자가 수정할 수 있음을 독립 변수입니다. MDR-TB의 마스터 믹스 비대칭 (주로 단일 가닥) 증폭 산물을 생성하기 때문에, 그렇지 않으면 기존의 지수 PCR 증폭 프로토콜에 활용 될 수있는 것보다 더 많은 열 사이클을 포함하는 것이 도움이됩니다.
  4. 열 순환 및 하이브리드 프로그램이 완료되면, 프로그램을 종료 증폭 마이크로 어레이를 제거 소프트웨어를 닫고 열 자전거 타는 사람 (들)을 끕니다.

4. 세척 및 건조

  1. 0.1 % 트리톤 X-100 세척 버퍼를, 적어도 250 ㎖의 탈 이온수 또는 밀리 Q 등급의 물을 각각 두 개의 컨테이너 - 동시에 24 기판까지 세척을 위해, 적어도 250 ㎖의 1X SSPE 준비합니다. 세척 버퍼는 사전에 제조 할 수있다.
  2. 조심스럽게 평면 엔드 집게를 사용하여 각 증폭 마이크로 어레이 실에서 커버 슬립과 가스켓을 제거합니다.이 단계는 물리적으로 손상 젤 요소 배열의 가장 큰 위험이되는 지점이다. 증폭 된 핵산의 확산을 방지하기 위해 적절한 PCR 오염 컨트롤을 사용하여 작업 환경에서.
  3. 조직학 슬라이드 홀더에 마이크로 어레이 기판을 배치하고 세척 버퍼를 포함하는 세척 함으로 모든 슬라이드를 놓습니다. 뚜껑이있는 용기를 커버.
  4. 부드러운 교반과 함께 실온에서 10 분 동안 마이크로 어레이를 씻으십시오.
  5. 마이크로 어레이 세 탈의 두 개의 연속 세척의 배 각각의 이상을 찍어밀리 Q 등급 물, 공기 건조.

5. 영상

비대칭 MDR-TB 프라이머 믹스를 Cy3 - 라벨 증폭 산물을 생성한다. 젤 요소 마이크로 어레이 이미지를 Cy3 할 수있는 표준 마이크로 어레이 이미 저와 이미지가 될 수있다. 다음 이미지를 만드는 절차가 Akonni에서 제공하는 MD​​R-TB의 마스터 믹스, Dx2100 필드 휴대용 화상 카메라 및 자동 분석 소프트웨어에 대한 특정이다.

  1. 이미 저에서 이더넷 케이블이 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인합니다.
  2. 열 화상 카메라의 전원을 켭니다. 전원 스위치는 기기의 후면 패널에 있습니다. 화상 카메라가 켜져있을 때 화상 카메라의 전면에 블루 LED가 점등됩니다.
  3. 컴퓨터를 켭니다.
  4. 컴퓨터 바탕 화면에서 두 번 자동 이미지 분석 소프트웨어를 실행하는 소프트웨어의 아이콘을 클릭합니다.
  5. 이미 저 카메라와 연결을 설정하는 소프트웨어를 기다립니다. 연결이 설정되면, 분석 단추를 사용할 수 있습니다, 그리고메시지 "성공적인 연결"화면의 왼쪽 하단 모서리에 표시됩니다.
  6. 마이크로 어레이는 사용자로부터 멀어 직면, 대물 렌즈 방향과 건조 증폭 마이크로 어레이 (microarray)를 삽입합니다. 마이크로 어레이는 부적절 렌즈 및 카메라에 대해 배향되는 경우, 자동 분석 소프트웨어는 형광 이미지 격자를 배치하는 데 실패 할 것이다.
  7. 액세스 도어를 닫습니다. 미리보기 이미지가 컴퓨터 화면에 사용할 수 있습니다.
  8. 드롭 다운 메뉴에서 MDR-TB 분석 스크립트를 선택하고 (밀리 초) 원하는 노출 시간을 입력합니다. 겔 소자 증폭 마이크로 어레이에 대한 전형적인 출발점 100-500 밀리 초이다.
  9. 포화 픽셀은 빨간색으로 미리보기에 표시됩니다. 개별 스팟 안에 포화 픽셀의 수를 최소화하기 위해, 노광 시간을 조정한다.
  10. 형광 이미지를 획득하고 분석하는 분석을 클릭합니다. 이 소프트웨어는 자동으로 배치됩니다이미지 위에 MDR-TB 분석 특정 그리드 통합 강도와 배경 값을 추출하고, 약제 내성 및 유전자형 결과를보고합니다. 자동 분석은 일반적으로 몇 초 정도 걸릴 것입니다. 흠집, 먼지, 형광 유물, 또는 마이크로 어레이 기능에 물리적 손상을 포함하는 도전적인 이미지의 소프트웨어는 분석을 완료하는 데 1 분까지해야 할 수도 있습니다.
  11. 분석이 완료되면 저장을 클릭 파일 이름에 대상 폴더 유형을 선택하고 확인을 클릭합니다. 원하는 경우 기본 마이크로 어레이 데이터가. xls 파일로 저장 및 오프 라인 내보낼 수 있습니다, 분석한다.
  12. 분석이 완료되면, 이미 저로부터 증폭 마이크로 어레이를 제거하고, 다음의 분석을 시작하기 위해 새로운 클릭.
  13. 데이터 수집이 완료되면 소프트웨어를 닫고 컴퓨터를 종료하고 화상 카메라를 끄십시오.

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결과

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정 성적 이미지 분석은 자동화 이미지 분석 소프트웨어에 의해 생성 된 데이터 테이블에서 식별되는 도전 실험 소음 또는 가변성의 소스에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 따라서, 1) 모든 젤 성분이 손상 및 손상되지, 2) 글로벌 배경 잡음 비율 (SNR) 값을 각각의 신호에 영향을 줄 수있는 형광 유물이없는 것을 확인 시각적으로 유용 할 수있다, 3)에 대한 증거는 없다 기포 형성 또는 불균일 증폭 / 혼성화 어레이에 걸쳐, 4) 소프트웨어가 정확하게 마이크로 어레이 이미지에서 모든 지점을 식별한다는. 예 MDR-TB 증폭 마이크로 어레이 이미지가 고품질 및 배열로 인해 열 사이클링 동안 물리적 손상이나 기포에 발생할 수있는 아티팩트를 나타내는,도 1에 나타낸다. 표준 마이크로 어레이 이미지 분석 소프트웨어는 일반적으로 격자를 배치하고 심지어 SH 불량한 품질의 이미지에서 적분 강도와 배경 데이터를 추출 할 수있다자신의 그림 1B에서, 수락 또는 추가 분석에서 마이크...

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토론

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증폭 마이크로 어레이와 다중화의 정도는 최종적으로 비대칭 멀티 플렉스 PCR의 효율 아니라 마이크로 어레이에 의​​해 결정된다. 우리의 경험에 의하면, 10-12 독특한 프라이머 쌍은 쉽게 증폭 마이크로 어레이 형식으로 다중화 될 수있다. 기존의 프라이머 및 프로브 설계 기준에 따라서 그 중 하나는 또한 솔루션 상 핵산과 고정 된 마이크로 어레이 프로브, PCR 버퍼에 열 열 자전거 타는 사람의 효율성 및 프로브 하이브리드 동작 사이의 잠재적 인 상호 작용을 고려할 필요를 제외하고, 새로운 분석에 적용되는도 PCR 프라이머 및 저 분자량 증폭 유물이 포함되어 있습니다. 이러한 전체 게놈 증폭으로 높은 멀티 플렉스 증폭 방법은 임의의 헥사과 고정 된 프로브 사이의 간섭, 긴, 이중 가닥 증폭 산물의 비효율적 인 하이브리드 등의 기술적 인 이유로, 다수의 단일 챔버 증폭 마이크로 어레이 프로토콜에 도움이되지 않습니다. 그곳에또한 개별 사용자가 사용자 정의 분석을 설계하거나 여기에 설명 된 MDR-TB 테스트를 사용할 때 고려해야 ...

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 부여 RC3의 AI089106에서 건강 (NIH)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

MDR-TB 핵산은 열대 질병 (TDR), 제네바, 스위스에서 연구와 교육을위한 국제 연합 아동 기금 / 유엔 개발 계획 / 세계 은행 / 세계 보건기구 (WHO) 특별 프로그램에 의해 제공되었다.

우리는 프로토 타입 분석에 포함 할 수있는 특정 유전자 돌연변이에 대한 지침에 대한 미국 질병 통제 예방 센터의 박사 톰 Shinnick 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MDR-TB 증폭 마이크로어레이, 적용된 개스킷 및 사전 절단 커버 슬립포함 Akonni BiosystemsInquire
Multiplex PCR 키트, HotStar Taq plusQiagen#206143
RNAse-free waterQiagen#206143 
포름아미드써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific, Inc.)#BP227-500
20 mg mL-1 비아세틸화 소 혈청 알부민(BSA)Sigma-Aldrich#3B6917
5X 농축 MDR-TB 프라이머 믹스Akonni BiosystemsInquire
500 fg uL-1 증폭 및 억제 제어Akonni BiosystemsInquire
20X SSPEThermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
트리톤 X-100써모 피셔 사이언티픽, Inc.#BP151-500
소독 스프레이 커런트 테크놀로지스, Inc.
70% 이소프로필 알코올Decon Labs, Inc.#8416
마이크로어레이 이미저, 자동 이미지 및 데이터 분석 소프트웨어포함 Akonni Biosystems100-20011
플랫 블록 인서트가 있는 열 순환기Akonni Biosystems100-10021
고처리량 세척 스테이션 및 슬라이드 홀더ArrayItHTW
해부 겸자Thermo Fisher Scientific, Inc.#10-300
미니 보텍서VWR#3365040
미니 원심분리기VWR#93000-196
에어브러시 압축기 키트중앙 공압#95630
Taq 중합효소가 포함된 2X PCR 버퍼 Qiagen#201207 #BRSPRAY128

참고문헌

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