순차 생체 내 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

요약

골절 치료에 뼈 전구 기능의 정량적 측정은 고해상도 시리얼 이미징 기술을 필요로한다. 여기에, 프로토콜은 이미지를 순차적으로 골절을 수리하는 과정에서 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이동, 증식과 분화를 정량화의 intravital 현미경과 osteo-혈통 추적을 사용하여 제공됩니다.

초록

뼈는 지속적으로 반전 높은 재생 부상을 따르고있다. 골 형성 줄기 / 전구 세포가 오랫동안 존재하는 가설이 있지만, 이러한 세포의 생체 내 데모 최근에 달성되었습니다. 여기에, 생체 이미징 기술 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 역할 (OSPCs)과 뼈 수리에 자신의 자손을 조사하기 위해 제공됩니다. 모델과 두 개관 뼈 유도 미세 균열의의 intravital 이미징을 추적 osteo-계보 세포를 사용하여, OSPCs 직접 초기 수리 과정에서 중요한 이벤트가 발생하는 부상 후 처음 몇 일 동안 관찰 할 수있다. 상해 사이트는 순차적으로 OSPCs가 부상으로 옮겨 놓을 수가 증가하고 뼈 형성하는 조골 세포로 분화 드러내는 이미지가 될 수있다. 이러한 방법은 뼈 재생 및 수리를위한 줄기 세포의 내장과 외부의 분자 규제의 역할을 조사하는 수단을 제공합니다.

서론

퇴행성 뼈 질환 및 골다공증 성 골절의 위험이 높은 선도 연령과 관련된 뼈 손실은 공중 보건의 ^1의 주요 과제가되고있다. 뼈의 유지 보수는 뼈가 형성 조골 세포와 뼈 resorbing 파골 세포에 의해 제어된다. 뼈 형성 세포의 결함은 연령과 관련된 뼈 손실 및 퇴행성 뼈 질환 ^2,3의 주요 원인입니다. 광범위한 연구는 골절 치료의 개선에 집중되었지만, 안정적인 약물의 발견은 뼈 퇴행성 질병을 치료 및 골다공증 성 골절의 약점을 취소하는 것은 중요한 문제가 남는다. 따라서, 골 재생 및 수리의 골 형성 세포 및 그 제어 메커니즘의 근원을 연구하면 골격 재생을 높이고 골 손실 질환을 반전하는 신규 한 통찰력을 제공한다.

골수에있는 다 능성 간엽 세포의 존재는 클론 원성 개체군의 식별에 기초하여 제안되었다 수 있었고 상이한골 형성에 늦었, 지방 형성과 연골 계보는 생체 ^4. 최근, 여러 연구는 골격 / 중간 엽 줄기 세포 (SSC가 / 엽 줄기 세포)는 조골 세포의 자연적인 원천 및 골 교체, 개조, 및 파괴 수리 ^5,6에 중요한 것으로보고있다 . 또한, 우리의 혈통 추적 연구는 성숙한 조골 세포가 예기치 않게 짧은 반감기 (~ 60 일)이 지속적으로 정상 항상성과 골절 수리 조건 ⁶ 모두 자신의 줄기 / 전구 세포에 의해 보충되는 것으로 나타났다. 그러나, 생체 내 줄기 세포의 정체성과 어떻게 이러한 세포는 부상 골절과 뼈 형성 세포가 불분명 공급하는 반응. 따라서, 생리적 상황에서 이주, 증식 및 내인성 개의 SSC / 엽 줄기 세포의 분화를 분석 할 수있는 방법을 개발하는 것이 중요하다.

골절 수리 복잡한의 배열에 의해 규제 다세포과 역동적 인 과정이다사이토 카인과 성장 ^{7 요인.} 골절 연구에 가장 인기있는 방법은 긴 뼈 골절 동물 모델을 사용하여 뼈 절편 및 면역 형광 기법 ^8-10로 뼈를 분석하는 것이다. 이 복구 프로세스는 마이크로 - CT ^(11), 근적외선 형광 ⁽¹²⁾ 및 화학 발광 영상 ^(13)을 포함하여 다수의 영상 기술로 모니터링 할 수있다. 그러나 각 기술은 특정 제한 사항이 생체 내에서 세포 수준에서 SSC가 / MSC 기능을 모니터링하는 효과적인 방법이 없었다. 최근에, 공 초점 / 이광자의 intravital 현미경이 개발 및 동물에게 ¹⁴ 리빙 심지어 단일 셀 해상도 그들의 골수 미세 환경의 컨텍스트에서 이식 된 암세포 및 조혈 줄기 세포를 검출하기 위해 사용되어왔다. 계보 추적 모델 시리즈 기술을 결합함으로써, 우리는 골 형성 줄기 / 전구 세포는 유전자 변이 (AC)에 의해 표시 될 수 있음을 정의 할 수 있었다믹소 바이러스 저항 -1 (MX1) 발기인 및 MX1 유도 조상의 tivation 시간이 지남에 성숙한 조골 세포의 대부분을 유지할 수 있지만, 성인 마우스 ^(6)에 연골 세포의 생성에 참여하지 않습니다. 또, MX1-표지 OSPCs은 골절 치료 ⁶ 새로운 골아 세포의 대부분을 공급하는 것을 보여 주었다.

여기에, osteo-혈통 추적 모델과의 intravital 현미경을 사용하여, 프로토콜은 골절 수리 MX1 ⁺ 골 형성 줄기 / 전구 세포의 생체 역학을 정의하기 위해 제공됩니다. 이 프로토콜은 골절 사이트에 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이전 및 초기 수리 과정에서 osteoprogenitor 확장의 정량적 측정을 추적하기 위해 순차적으로 영상을 제공합니다. 이 접근법은 골 수선을 향상시키는 치료 후보의 평가를 포함한 여러 상황에서 유용 할 수있다.

프로토콜

1. 마우스 및 전처리

참고 : 모든 마우스는 무균 상태로 유지하고, 모든 프로토콜은 매사 추세 츠 종합 병원에서 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 모든 수술은 오토 클레이브 멸균 장비를 사용하여 무균 조건 하에서 수행되어야한다. MX1-크레 ¹⁵ Rosa26는 -에 loxP 스톱에 loxP - EYFP (로사 - YFP), 및 Rosa26 -에 loxP는 스톱에 loxP-tdTomato (로사 토마토)이었다 잭슨 연구소에서 구입. 오스테오칼신-GFP 마우스 박사 헨리 KRONENBERG에 의해 제공되었다. 생체 내에서 OSPC의 이동과 증식의 정량적 분석을 위해, MX1-크레 ⁺ 로사 - YFP ⁺ (단일 색상 기자) 마우스를 사용 하였다. 오스테오칼신 ⁺ 성숙한 조골 세포로 분화의 자세한 추적을 위해, 우리는 사용 trigenic MX1-크레 ⁺ 로사 - 토마토 ⁺ OCN-GFP ⁺마우스.

1. , 생체 내에서 MX1 ⁺ 세포에 라벨을 멸균 PBS 용액에 polyinosinic-polycytidylic 산 (PIPC, 2.5 ㎎ / ㎖)을 준비하고 20 MX1-크레 ⁺ 기자 마우스의 G 복강 한 번 10 일 동안 매일 200 μl를 주입합니다.
2. 주민 MX1 ⁺ 조혈 세포를 제거하기 위해, 9.5 Gy의 단일 용량으로 쥐를 조사. 정맥 ¹⁶ 조사, 이식 야생형 골수 세포 (1 × 10 ⁶ 세포 / 마우스)의 24 시간 후. 주 : MX1 - 유도 세포가 조혈 세포 및 조혈 유래 파골, MX1 ⁺ 조혈 세포의 제거 MX1 ⁺ 조골 세포의 이미징 품질 및 정량을 개선을 포함하기 때문이다.
3. 골수 이식 후 공여자 골수 세포의 성공적인 다시 채우기를 달성하기 위해 4-6주위한 동물을 모니터링한다.

2. 모준비에게 사용

1. IACUC 승인 절차를 사용하여 케타민 / 자일 라진 (100 ㎎ / ㎏, 자일 라진 12 ㎎ / ㎏ 체중)의 50 μL의 복강 내 주사로 마우스를 마취. 참고 : 효과 지속 시간이 케타민 / 자일 라진의 추가 투여에 의해 연장 될 수있다.
2. 마우스가 완전히 발가락 및 / 또는 꼬리 핀치에 대한 응답의 부족에 의해 마취되어 있는지 확인합니다. 마우스를 마취하는 경우 (선택), 테이핑하여 코를 통해 이소 플루 란 가스 마스크를 고정합니다. 동물이 완전히 진정되어 있는지 확인하기 위해 이소 플루 란의 레벨을 조정합니다.
3. 전기 트리머 또는 작은 가위를 사용하여 두피 머리를 클립. 머리 조각을 제거하고 70 % 알코올 면봉으로 노출 된 피부를 소독. 각막 탈수를 방지하기 위해 눈물 젤을 적용합니다.

3. 미세 균열 부상

1. 동물이 완전히 진정되고 확인한 후, 두피의 피부를 열 수있는 하나의 역 L 자형 절개를합니다. 요약하면, 제 1의 가로 절개 (1cm 미만) starti을다른 귀 하나 귀에서 겨. 60 ° ~ 켜고 ~ 멀리 코에서 2-3mm 때까지 코를 향해 절개를 계속합니다. 주 :이 절개 묘화되는 영역 위에 흉터 조직의 형성을 최소화한다.
2. 집게로 양쪽으로 잡아 당겨 피부 플랩을 분리합니다. 모두 정면 뼈와 시상 및 관상 봉합의 교차점 명확하게 노출되어야합니다.
3. 모든 잔여 머리카락이 제거 될 때까지 멸균 PBS 및 멸균 거즈 또는 면봉과 부드러운 닦아로 세척하여 열린 표면을 청소합니다.
4. 개관에 미세 균열을 생성하려면, 한 손으로 마우스의 머리와 다른 손으로 30 G 바늘을 개최합니다. 부드러운 압력으로 30 G 바늘의 끝 부분을 삽입하고 운동을 왜곡하여 시상 ​​및 관상 봉합의 교차점 왼쪽 정면 뼈의 미세 구멍 (<1 mm 깊이와 ~ 0.2 mm 직경의 상처)를 확인합니다. 주의 :함으로써 bleedi 최소화 뇌로 관통 바늘을 피하기 위해 중요NG 및 조직 손상.
5. 큰 바늘 (20 또는 25 G)로 전환하고 바늘 (~ 0.5 mm 직경)을 왜곡하여 구멍 구멍을 넓혀.
6. 반대측 정면 뼈에 두 번째 구멍을 생성하는 단계 3.3-3.5를 반복합니다.
7. 출혈이 멈출 때까지 PBS의 연속 낙하에 의한 부상 반점을 닦습니다.
   주 : 골절 사이트에 출혈이 적절한 영상을 방해하고 흉터 형성을 유도 할 것이다.
8. 건조를 방지하기 위해 두개골에 멸균 생리 식염수 또는 2 % 토셀의 드롭을 적용합니다. 참고 : 이미지 선명도를 줄일 수있는 두개골 표면이 건조하지 않도록하십시오. 이 영역을 커버하는 젤 또는 식염수의 충분한 양을 사용하는 것이 중요하다.

4.의 intravital 이미징

1. (선택 사항) 촬영하기 전에 일부 마우스는 혈관을 시각화하는 혈관 염료로 주입된다. 비 대상 Qtracker 705 80m에 희석 (50 mM의 붕산 버퍼에 2 μM 용액) 20 ㎕와 함께 복고풍 궤도 주입PBS의 L. 시약의 낭비를 최소화하기 위해 인슐린 주사기를 사용합니다. 신호가 충분히 밝지 않은 경우, 추가적인 양이 요구 될 수있다.
2. 스캐너의 전원을 켭니다. 참고 : 다각형 기반의 레이저 스캐너 비디오 속도로 동시 다중 채널 이미지 수집 (초당 30 프레임)을 할 수 있습니다. 비디오 속도 스캐닝 라이브 동물 이미징을위한 매우 중요합니다.
3. (: 사파이어 레이저 펨토초 티타늄) 다 광자 레이저의 전원을 켭니다. 880 nm의 파장을 설정하고 뼈의 두 번째 고조파 발생의 영상 (440 NM)의 전원을 조정합니다. GFP 및 tdTomato 여기를 들어, 491 ㎚, 561 nm의 고체 레이저의 전원을 켭니다.
4. PMT 각 신호 (광전자 증 배관) 검출기를 켭니다 (두 번째 고조파 발생에 대한 435 ± 20 nm의 대역 통과 필터, GFP의 528 ± 19 nm의 대역 통과 필터 및 tdTomato 590 ± 20). (선택 사항) Qtracker보기 (705)의 신호를 검출하도록 695 ± 27.5 nm의 대역 통과 필터와 638 nm의 헬륨 - 네온 레이저 및 PMT를 사용한다.
5. PLACXYZ 축 동력 현미경의 무대에서 동물을 전자. (이것은 동물 손실의 위험을 감소시킨다)의 체온을 유지할 수 있도록 전기 가열 패드를 가장 편안한 위치에 마우스를 유지한다. 촬영하는 동안 움직임을 최소화하기 위해 가능한 한 수평으로 몇 군데 지역을 유지하기 위해 마우스를 잡고 테이프를 사용합니다.
6. 건조를 방지하기 위해 두개골에 따뜻한 2 % 메틸 셀룰로오즈 겔 또는 생리 식염수 용액의 방울을 적용한다. 이미징 영역에 커버 글래스를 넣어. 덮개 뼈를 스캔 (0.9 NA로 30 배 물 침지 목적) 낮은 배율의 렌즈를 사용합니다.
7. XYZ 축 제어기를 사용하여 뼈 SHG 신호를 검출함으로써 덮개 뼈의 표면을 발견하고 시상 봉합과 관상 봉합의 교점으로서 중요한 랜드 마크의 위치를​​ 식별한다. 이미지를 획득하고 XYZ 좌표를 기록한다.
8. SHG 형광 신호를 관찰하여 손상의 위치를​​ 검색하기 위해 계속합니다.
9. 부상 사이트 또는 지역 오 때F 관심이 발견되어, 그 세포로부터 SHG 형광 신호를 포함하는 최적 초점 평면의 이미지를 획득. 저장 XYZ 좌표와 시상 및 관상 봉합의 교차점까지의 거리 이미징의 다음 라운드를 위해 자신의 정확한 위치를 정의 할 수 있습니다.
10. 골절 부상의 3D 세포 및 뼈 구조를 수집, Z-스택으로 이미지를 기록 - 내막 뼈 표면에서 ~ 100 μm의 깊이 (5 μm의 간격). 부상의 한쪽의 촬상 종료 후, 다음 부상 사이트에 대한 촬영 처리를 반복한다.

5. 포스트 운전 설정

1. 촬상 후, 두개골에서 메틸 셀룰로오스 겔을 제거 멸균 식염수로 촬상 사이트를 헹군다. 멸균 면봉을 사용하여 표면에 트리플 항생제 연고 묻혀. 피부 플랩 커버 및 수술 봉합하여 두피를 다시 닫습니다. 이것은 저자 극성 봉합사 (흡수 polyglactin 스와 함께 할 수있는진짜야)와 5-0 크기 봉합 바늘. 주의 : 좋은 봉합 기술은 흉터 형성을 최소화한다.
2. / kg 부 프레 노르 핀 48 시간마다 12 시간이 수술 후 0.05 ~ 0.1 밀리그램의 IP 주입과 모든 동물을 치료. 그들은 충분한 의식을 되 찾을 때까지 따뜻한 복구 실에서 동물이 오지 않게하십시오. 3~5일 후 봉합을 다시 및 골절 치료시 세포의 변화를 추적 할의 intravital 이미징 단계를 반복합니다.

결과

안정화 된 긴 뼈의 골절 모델은 골절 연구에 인기가있다. 그러나, 긴 뼈의 골절 또는 큰 모델은 여러 조직의 손상을 야기하기 때문에, 뼈 세포 기능의 양적 측정에 제한이있다. 우리는 바늘 드릴링 (그림 1A-1C)와 두 개관 정면 뼈에 최소 침습 부상 (경막에없이 또는 최소한의 침윤 미만 mm 직경)를 개발했다. 이 뼈는 (다른 조직의 간섭없이 맑은 부상 뼈의 영상, 뼈 세포 및 혈관을 허용, 골수와 평평하고 얇은 뼈 구조를 가지고 있기 때문에 우리는 미세 균열의 생체 라이브 영상의 두 개관 정면 뼈의 평면도를 선택했다 그림 1C). 우리는이 미세 균열이 무기물 증착 및 새로운 골 형성 (데이터 미도시) 다음에 부드러운 캘러스 형성을 포함한 대규모 파괴 부상의 많은 특성을 되풀이되었습니다 것을 관찰했다.

MX1 ⁺ 골 형성 줄기 전구 세포의 생체 내 이미징 "&g...

토론

골격 줄기 세포의 조절은 골 재생을 달성하기 위해 더 나은 방법을 정의하기 위해 매우 중요 할 수있다. 세포 수준에서 정량 및 연속 촬영은 기술적으로 도전하고있다. 마우스 긴 뼈의 골절 모델이 널리 사용되는 생체 역학적 연구 ^(17)에 적합하였으나, 그 깊은 조직의 위치, 고르지 골절의 크기, 연부 조직 손상, 및 안정화 fixators의 응용 프로그램이 순차의 intravital 이미징을 제한했다. 여기서, 공 초점 / 이광자 현미경의 intravital 및 마우스 두 개관 골절 모델의 조합에 의해 이러한 한계를 극복하기위한 방법이 제공된다. 골 형성 줄기 / 전구 혈통 추적이 방법은 골절 수리 골 형성 줄기 / 전구 세포의 생체 내 이미징에서 실시간에 대한 능력을 보여줍니다.

이 방법에서 중요한 기술적 문제는 시간이 지남에 일관된 고품질의 화상을 얻을 수있다. 고품질 임최대 촬상 깊이와 나이는 형광성 리포터 및 이미징 영역의 조직 상태의...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6J (H-2B)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664
케타민 염산염 주입	Bionichepharma	67457-001-10	바이알 크기: 10ml(50mg/ml)
자일라진 멸균 솔루션	Lloyd Inc.	NADA# 139-236
부프레노르핀 Hl	BEDFORD LAB	NDC 55390-100-10	바이알: 0.3 mg/ml, 용량: 0.05-0.1 mg/kg
DPBS, 1X	CORNING cellgro	21-031-CV
알코올 준비 패드 (70% 이소프로필 알코올)	Kendall WEBCOL	5110
Fine Surgical Scissor	F.S.T	14568-09
Extra fine Forceps	F.S.T	11150-10
VICRYL*Plus Suture	Ethicon	VCP490G
Qtracker 705 비표적 양자 점	Invitrogen	Q21061
Methocel 2%	OmmiVision
pIpC (폴리이노신-폴리시티딜산)	시그마	P0913-50MG	100 μ l (PBS에서 2.5 mg / ml) 마우스
Mai Tai 조정 가능한 초고속 레이저	스펙트럼 물리학
듀얼 칼립소 491 + 532 nm DPSS 레이저	코 볼트 AB
반경 -635 HeNe 레이저	코 히런트