방법 논문

입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

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DOI:

10.3791/51302

⸱

2014년 6월 10일

 ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

입자 추적 microrheology은 비파괴 정량 및 공간적 차원 종양 모델에서 세포 외 기질 (extracellular matrix) 기계적 성질의 변화를 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

기계 미세 자체가 리모델링 복잡한 양방향 mechanosensitive 상호 작용의 한 부분으로서 수정 종양의 성장 동작 및 신호의 중요한 규칙, 역할을 보여왔다. 생물학적으로 중요한 3D 종양 모델의 개발은 종양 성장에 대한 매트릭스의 레올 로지에 미치는 영향에 대한 역학적 연구를 촉진하고 있지만, 종양에 의해 유도 된 기계적 환경 매핑 변화의 역 문제는 도전 남아있다. 여기, 우리는 종 방향으로 현장에서, 종양 미세 환경의 물리적 변화를 모니터링하기위한 강력하고 실행 가능한 접근 방법의 일환으로 췌장암의 3D 모델과 함께 입자 추적 microrheology은 (PTM)의 구현을 설명합니다. 여기에 설명 된 방법론과 형광 표지 프로브가 균일하게 포 배포 모델 세포 외 기질 I 콜라겐 유형의 (ECM) 지지체에 포함 체외 3D 모델을 준비하는 시스템 통합구성비와 표본 전체에 시간에 따른 microrheology은 측정. 체외 종양 도금 및 멀티 웰 이미징 플레이트를 사용하여 병렬 상태에서 조사됩니다. 정해진 방법에 그리기, 추적 조사의 움직임 동영상은 복잡한 주파수 의존 점탄성 전단 계수, G * (ω)를보고하는 일반화 된 스톡스 아인슈타인 관계 (GSER)를 통해 변환됩니다. 이 방법은 이미지를 기반으로하므로, 기계적 특성도 동시에 3D 종양의 크기와 표현형의 질적 변화를보고 큰 투과광 공간 필드에 매핑됩니다. 현지화 침입에 의한 매트릭스 저하뿐만 아니라 시스템 교정과 관련된 하위 지역에 기계 응답을 대조 보여주는 대표적인 결과는 검증 데이터가 제공됩니다. 일반적인 실험 오류와 이러한 문제의 문제 해결에서 바람직하지 않은 결과도 제시된다. 이 프로토콜에서 구현 된 96 - 웰 배양 판 3D 포맷는 C치료 심사 분석 또는 기계적 미세 환경에 대한 치료 또는 생화학 적 자극의 영향에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 분자 이미징 microrheology은 측정의 상관 관계에 onducive.

서론

그것은 암 세포가 아닌 악성 포유류의 상피 세포에서와 같이, 주변의 세포 외 기질 (ECM) 및 기타 미세 환경의 구성 요소 1-9의 기계 및 생물 물리학 적 특성에 매우 민감하다는 문헌 기록의 성장 몸에서 분명하다. 우아한 기계론의 연구는 악성 성장의 행동과 형태 형성 2,3,10,11을 조절하는 복잡한 mechanosensitive 신호 파트너로 세포 강성의 역할에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 작품은 생물학적으로 관련 조직의 구조를 복원하고 조정할 수있는 기계와 발판 재료의 성장 및 광학 현미경 12-19으로 영상화 할 수있는 시험 관내 종양 모델에서 3D의 개발에 의해, 특히 촉진하고있다. 그러나, 종양 차례로 암 세포가 자신의 주변의 레올 수정 통해 미세 사이 mechanoregulatory이 대화의 다른 쪽은, 다소 남아공부하기가 더 어렵다. 예를 들어, 침략 과정에서, 종양의 주변에서 세포 차례의 mechanosensitive 성장의 행동에 영향을 미치는 ECM 20-22의 지역이 저하 될 그 중간 엽 전이 (EMT)로 상피를 거쳐 매트릭스 메탈로 (MMPs의)의 발현을 증가시킬 수 있습니다 다른 근위부 종양 세포. 생화학 다양한 공정을 통해 암 세포는 지속적으로 다른 시간에 서로 다른 프로세스에 맞춰 상하 그들의 환경의 로컬 강성 다이얼. 여기에서 설명하는 방법은 3D 종양 모델과 통합 문화를 종료하지 않고 생화학 적 표현형의 변화와 종 방향으로 상관 관계가 될 수있다 성장하는 동안 강성과 ECM의 준수 로컬 변경 사항을보고 분석 도구의 필요성에 의해 좌우된다.

이러한 맥락에서 구현하는 적절한 기술의 검색, 입자 추적 microrheology은 (PTM)가 강력한 후보로 나온다.이 방법은, 메이슨과 바이 츠 (23, 24)에 의해 처음 개척, 마이크론 길이의 비늘에서 주파수에 의존하는 복잡한 점탄성 전단 계수, G * (ω)을보고하기 위해 복잡한 유체에 포함 된 추적 프로브의 움직임을 사용합니다. 이러한 일반적인 접근 방식은 부드러운 응축 물질, 콜로이드, 생물 물리학 및 고분자 물리학 25-31에서 다른 응용 프로그램에 적합한 여러 변화와 함께 개발되었습니다. 지역 점탄성의 판독이 문화를 작성할 당시 통합과 성장의 확장 된 기간 동안 그 자리에 남아있다 화학적으로 비활성 추적 프로브의 비파괴 비디오 영상에 의해 제공되기 때문에 PTM은 다른 방법에 비해 어떤 장점이 있습니다. 이것이 반드시 문화의 종단이 필요하고 복잡한 3D 종양 microenvir 내의 포인트 측정보다는 샘플의 벌크 거시적 레올보고 진동형 전단 대량 레오 미터, 금 표준 측정 대조적이다일어나는 장소. 실제로 다수의 연구는 세포의 이동 (32), 확장 구형 (33), 세포 내 레올 로지 (34, 35)에 의해 유도 된 기계적 스트레스와 관련된 변형을 측정하는 또는 암 또는 비 암 세포 주위에 추적 프로브의 움직임 측정을 해석하는 유틸리티를 설명하고있다 기계적 응력과 변형 설계 조직 36, 기공 크기 및 침입 속도 (37) 사이의 관계를 매핑하는 방법. 예컨대 원자력 현미경 (AFM) 등 microrheology은 적합한 다른 기술들이 구현 될 수 있지만, 주로 또한 시료 표면에 점을 프로빙하고 대한 길이 측정 38을 복잡 배양 무균 문제를 일으킬 수있다.

여기에서 우리는 확실하게 공간을 매핑하기위한 비디오 입자 추적 및 분석 방법에 대한 포함 된 형광 프로브와 ECM에 전송하기에 적합한 3D 종양 상체의 성장을위한 방법을 포괄하는 종합적인 프로토콜을 설명문화 시간에 microrheology은 변화. 본 구현, 3D 종양 모델이 형식에 도움이되는 다른 전통적인 분석 (예를 들면, 세포 독성)와 microrheology은 측정의 결합으로 볼 수있는 멀티 웰 형식으로 재배하고 있습니다. PANC-1 세포를 사용하여이 방법의 우리 배양 시험관 차원 상체의이 대표적인 그림에서, 상체 (39) 만, 본원에 기재된 모든 측정을 형성하기 위해 알려진 확립 췌장암 세포주 세포주의 다양한 사용하여 고형 종양 연구 광범위하게 적용될 수있다 3D 문화에 적합합니다. 이 방법은 본질적으로 이미징을 기반으로하기 때문에 그것은 이상적으로 세포의 성장, 이동 및 표현형의 변화를보고보기의 큰 투과광 필드 고해상도 microrheology은 데이터의 공동 등록에 적합합니다. PTM의 구현은 현미경 스테이지 WH 재현성 위치 결정을 가정 이와 같이 투과광 현미경과 통합무형 문화 유산은 모터 상업 위드의 표면 형광 생물 현미경에 일반적으로 사용할 수 있습니다. 아래 개발 된 프로토콜은 합리적으로 장착 된 자동 형광 생물 현미경으로 구현 될 수있다. 이는 오프라인 처리를위한 디지털 비디오 현미경 기가 바이트의 데이터의 획득을 필요로하는 본질적으로 데이터 집약적 인 방법이다.

다음 프로토콜에서, 프로토콜 한 아가 로스 오버레이를 사용하여 여기에 설명되어 있지만, 이러한 매달려 드롭 40, 또는 41 회전 배양 기법과 같은 다른 다양한 방법으로 치환 될 수있는 종양 상체의 초기 제제에 관한 것이다. 프로토콜 2는 다른 방법으로, 체외 3D 종양 캡슐 또는 재 부유 세포의 매립 ECM 12,15에있는 것이 아니라 하나의 미리 형성된 비 부착 상체로 성장 할 수 있지만 콜라겐 지지체에 상체를 포함하는 프로세스를 설명합니다. 후속 프로토콜은 O를위한 절차에 대해 설명합니다각각의 비디오 현미경 데이터를 획득 및 처리하여 시간 분해 microrheology은 측정 btaining. 데이터 처리 (참조 http://www.physics.emory.edu/, MATLAB을 사용하여 원래 광범위하게 다양한 소프트웨어 플랫폼을 위해 개발 된 크로커와 그리어 (42)에 의해 설명 된 알고리즘을 기반으로 PTM을위한 오픈 소스 루틴의 활용 설명 ~ 주 / IDL /).

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프로토콜

1. 배양 종양 상체

  1. 1 % 아가로 오스 용액을 얻었다 아가 로스 0.1 g과 함께 세포 배양 등급의 물 10 ㎖를 혼합한다.
  2. 96 - 웰 플레이트에 잘으로 아가로 오스 솔루션의 40 μl를 분취하기 전에 70 ° C 이상 (표준 전자 레인지 나 가열 플레이트를 사용하여 약 14 초)에 열 아가로 오스 솔루션입니다.
  3. 표준 기술을 사용하여 세포를 수확하는 동안 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
  4. 세포 현탁액의 농도를 결정하기 위하여 hemacytometer를 사용한다.
  5. 1,000 세포 / ml의 세포 현탁액을 희석하고 잘 경화 아가로 오스 침대를 포함하는이 희석 100 μl를 추가합니다.
  6. 37 ° C와 5 % CO 2로 설정 배양기에서 하룻밤 진탕 샘플을 놓습니다.
  7. 통에서 샘플을 제거하고 세포 배양 배지 100 μl를 추가합니다.
  8. 원하는 직경에 도달 할 때까지 상체를 품어. 예를 들어, 후 구일, SPheroid는 직경이 약 450 μm의 수 있습니다. 이 시간 동안 신선한 성장 배지를 웰에 첨가 할 수 있지만, 이것은 구형 체의 제거를 초래할 것이기 때문에 흡인 피해야한다.

2. ECM에 포함 된 3D 종양 상체를 준비

  1. 층류 후드 안쪽 필요한 재료와 워크 스테이션을 준비한다.
  2. 25 부 멸균 수로 2 부 주식 프로브 (2 % 고체)를 추가하여 카르 복실 레이트 - 수정 1 μm의 직경 형광 추적 프로브의 희석 된 혼합물을 준비합니다.
  3. 냉장고에서 3.1 ㎎ / ㎖ 소 콜라겐의 병을 제거하고 얼음에 놓습니다.
  4. 나누어지는 125 빈 2 ㎖ 유리 병에 콜라겐 μL.
  5. 프로브를 배포 짧게 콜라겐과 소용돌이가 들어있는 유리 병에 희석 추적 프로브 솔루션의 50 μl를 추가합니다.
  6. 적절한 세포 배양 매체 (41)의 전체 볼륨에 대한 페놀 레드 (황색으로 변합니다)를 포함하는 235 μl를 추가합니다간단히 205 ㎖ (반 전체 볼륨)를 제거하고 새로운 2 ㎖ 유리 병에 배치하기 전에 0 ㎖의 소용돌이. 바이알 1은 종양 타원체를 포함하고 약병 2 제어 혼합물 일 것이다.
  7. 중성 pH (페놀 레드를 포함하는 배양 배지가 빨간색으로 돌려 보내야한다)에 다시 솔루션을 가지고 1 바이알에 1 M NaOH를 1 ~ 2 μl를 추가합니다. 이 혼합물은 얼음에 보관하지 않을 경우 치료 시작이되지 않습니다. 혼합하는 소용돌이 짧게, 즉시 얼음 선반으로 돌아갑니다.
    참고 : 회전 타원체 문화와 아가로 오스 침대에서의 제거 9 일 이후 섬세한 작업은 육안으로는 거의 볼 수 있습니다. 해부 현미경의 사용은 일부 사용자에게 도움이 될 수 있습니다. 전송하는 동안 회전 타원체의 무결성을 유지하는 것은 매우 중요합니다.
  8. 넓은 입 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 잘 종양 구형을 포함에서 미디어의 40 μl를 제거합니다. 다음 단계를 수행하는 동안이 40 μl를 유지합니다.
  9. 볼을 잘 선택하면 구형이전 단계에서 제거되었습니다. 그것이 인 경우, 1 바이알에 구형을 포함하는 40 μl를 추가합니다.없는 경우에, 우물에 40 μl를 배치하고 이전 단계를 반복합니다.
  10. 조심스럽게 96 - 웰 플레이트의 세 개의 우물에 60 μl의 부분에 혼합물을 전송하기 전에 (이 구형 손상을 줄 수 있습니다, 소용돌이로 교반 위험을 감수하지 않는) 유리 병 1 저어. 잘 회전 타원체를 포함하는 결정 혼합물을 추가 한 후 현미경으로도 각을 검사합니다.
  11. 추가 1 ~ 2 ㎕의 1 M NaOH를 40 유리 병 2 세포 배양 배지의 μL 및 제어와 같은 96 - 웰 플레이트 및 표시가 잘 빈에이 혼합물의 60 μl를 aliquotting 전에 소용돌이.
  12. 적어도 1 시간 동안 치료하기 위해 37 ° C의 배양기에서 접시를 놓습니다.

3. 샘플 포인트의 그리드를 구축하고 각 지점에서 비디오를 가지고

  1. 현미경 단계로 인큐베이터에서 샘플 플레이트를 전송합니다. 샘플의 10 분은 equil 할 수 있도록 허용가열 단계를 사용할 수없는 경우 실내 온도와 ibrate.
  2. 확실히 그것은이 손상 및 이미징을위한 준비가되어 있는지 확인하기 위해 저전력 대물 렌즈를 이용하여 시료를 관찰합니다. 잘 내 종양의 위치를​​ 확인합니다.
  3. 하는 방법을 많은 샘플 포인트를 결정합니다. 일반적으로 구형의 주위에 동심원에 분산 각 웰에 20 샘플 포인트는, 충분히 자세한 결과를 생성합니다.
  4. 각각의 원하는 위치로 무대를 이동하고 x 및 y 좌표 (또는 소프트웨어의 인터페이스은 사용할 수없는 경우 기록을 수동으로 조정)를 기록하기 위해 현미경 인터페이스 소프트웨어를 사용합니다.
  5. 높은 전원 대물 렌즈 (일반적으로 100 배)에 현미경을 전환하고 추적 프로브의 여기 파장에 대한 적절한 필터 큐브를 선택합니다. 그리드의 첫 번째 지점으로 이동하는 단계 3.4에서 만든 점의 목록을 사용합니다.
  6. 우물의 바닥을 찾을 수 있도록 초점을 조정 한 후 (FOV) 몇 가지에 초점 TRAC을 포함하는보기의 필드를 찾아 이동프로브 어.
  7. 강도 히스토그램을 관찰하고 이미지가 포화되지 않는 것을 보장하면서 최대의 동적 범위에게 수를 제공하기 위해 노출 강도와 시간을 조정합니다.
  8. 프레임 당 20-30 밀리의 프레임 레이트로 비디오 시퀀스를 획득 (약 800 프레임 길이가 16 ~ 24 초는 각각의 공간 격자 점에서 획득 시간을 최소화하기위한 요구와 균형을 강력한 MSD 계산 충분한 통계 자료를 제공하는 추천) 적절한 규칙을 사용하여 저장합니다. 촬영하는 동안, 현미경 또는 테이블을 만지지 마십시오.
  9. 반복 그리드의 각 샘플 포인트에 대해 3.9 3.6 단계를 반복합니다.
  10. 반복 실험에서 각 웰에 3.10로 3.3 단계를 반복합니다.

4. 각 샘플 포인트에서 유변학 적 특성을 계산하기 위해 비디오 데이터 분석

  1. (아마도 다른 컴퓨터에) 분석 폴더에있는 모든 비디오 데이터를 복사합니다.
  2. MATLAB로 가져 오기 이미지 데이터 또는 다른 분석 소프트웨어.
    NOTE : 여기에 채택 된 MATLAB 입자 추적 루틴의 설정에 관한 광범위한 설명서에서 확인할 수 있습니다 http://people.umass.edu/kilfoil . 다른 위치에서 여러 파일의 처리를 자동화하는 사용자 지정 호출 기능을 사용하는 것이 좋습니다.
  3. 적절 프로브 중심의 위치를​​ 식별하기위한 선택 및 거부 파라미터 (크기, 대역 통과, 등)를 결정하기 위해 비디오의 몇 프레임을 분석하여 소프트웨어를 보정. 이러한 중요한 단계에 대한 광범위한 배경은 크로커와 그리어에 의해 설명되어 있습니다.
  4. 자동으로 모든 비디오 프레임에 대한 각 프로브의 위치를​​ 확인하고 궤도에이 위치를 연결하는 소프트웨어를 사용합니다.
  5. 등 특정 대물 렌즈, 어떤 픽셀 비닝위한 적절한 공간 교정 계수 (픽셀 당 μM)을 적용해야되고, 지연 시간의 함수로서 평균 제곱 변위 (MSD)를 계산하기 위해 궤도 정보 데이터를 사용하여 (전형적 실시메타 데이터).
  6. 특정 샘플 24,28,43에 대한 GSER의 적용의 한계가. 또한, 사용자가 단순히 전원 법 스케일링, 고원을 비교하여 MSD에서 직접 ECM의 특성을 해석 할 수 있습니다 고려 일반화 된 스톡스 - 아인슈타인의 관계를 이용하여 G의 *를 (계산 이질 또는 다른 매개 변수의 값, 지수.
  7. 반복 실험의 각 화각에 4.6을 통해 4.2 단계를 반복합니다.
  8. 관심의 특정 주파수에서의 점탄성 modulii과 3.4 단계에서 위치 데이터를 공동 등록 할 수 있습니다. 사용되는 현미경의 제조사에 따라,이 단계는 현미경 메타 데이터 나 위치 데이터가 수동 표로 수를 판독 지정 루틴에 의해 촉진 될 수있다.
  9. ECM의 공간적 레올 맵을 생성하는 3 차원 보간 함수를 사용한다.

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결과

G * 복잡한 모델 종양 미세 환경 내에서 지역화 된 위치에서 (ω) 측정의 유효성을 확인하기 위해 두 개의 초기 유효성 검증 실험을 실시 하였다. 첫째, 우리는 대량 진동 전단 레오 메타의 "황금 표준"에 대한 우리의 측정을 검증하기 위해 노력했다. 우리는 1.0 ㎎ / ㎖ 콜라겐의 농도 (전지 제외) 콜라겐 매트릭스의 동일한 샘플을 준비했습니다. 이러한 샘플은 ( "(이 프로토콜에 걸쳐 같은 매개 변수를 사용하여) 및 G의 결과 측정 '(ω)와 G 대량 레오 미터 (40mm 평행 판 구조를 사용하여 TA 인스트루먼트 AR-G2)으로하고 PTM으로 프로빙 된 ω ) (그림 2A)를 비교 하였다. 우수한 계약은 두 측정 사이에서 발견되었다. 둘째, 우리는 1.0 ㎎ / ㎖ 콜라겐 매트릭스 및 임베디드 추적 구슬을 준비 ECM의 레올 로지 포인트의 변화를 측정하는이 프로토콜의 기능을 설정합니다. 시료를 처리 하였다빠르게 콜라겐을 소화...

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토론

이 프로토콜에서 우리는 세로 방향으로 3D 종양 모델에서 ECM의 강성 로컬 변경 사항을 추적하기위한 강력하고 광범위하게 적용 전략을 소개합니다. 우리는이 방법은 종양의 성장과 침략 과정에서 매트릭스 리모델링에 연루 mechanosensitive 행동에 관심이 암 생물학 및 생물 물리학 자에 의해 채택 될 수 있다는 구상. 행렬 분해 반응 속도의 정확한 정량화 직접 매트릭스 리모델링에 연결되어 3D 종양 모델에서 매트릭스 메탈로, 리실 산화 효소 또는 다른 관련 생화학 종의 활동을 연구하는 사람들에게 특히 도움이 될 수 있습니다. 3D 종양 모델에 응용 프로그램이 여기에 설명을 넘어, 하나 더 시간이 지남에 따라 매트릭스의 레올 로지의 수정이 중요한 역할 (46, 47)을 담당하는 다른 질병 모델 시스템과 함께이 방법의 구현을 상상할 수 있었다. 이 방법의 유틸리티 소프트웨어 개선을 통해 향상 될을 지속적 더 자동과정을 전자 및 처리량을 증가시켜 연구를 허용한다. 이 다 잘 형식으로 사용하기 위해 동시에 많...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

우리는 기꺼이 (마리아 Kilfoil에서 제공하는 MATLAB 입자 추적 코드의 오픈 소스 공유 인정 http://people.umass.edu/kilfoil/ )를, 존 C. 크로커와 에릭이 제공하는 이전의 IDL 코드와 광범위한 설명서와 함께 R.의 주. 이 작품은 국립 암 연구소 (NCI / NIH), K99CA155045 및 R00CA155045 (: JPC PI)의 자금 지원에 의해 가능하게되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 유형 1 콜라겐BD Biosciences, San Jose, CA354231
PANC-1American Type Cell Culture, Manassas, VACRL1469또는 기타 적절한 세포 유형
형광 마이크로 스피어Life Technologies, Carlsbad, CA906906
MatrigelBD Biosciences, Bedford, MA354230
AgaroseFisher Bioreagents, Waltham, MAC12H18O9
NaOHFisher Bioreagents, Waltham, MANC0480985
96-well Imaging platesCorning Inc., Corning, NY3904
DMEMHyclone, Waltham, MASH30243.01또는 적절한 세포 배양 배지
Zeiss AxioObsever MicroscopeZeiss, Oberkochen, Germany고속 카메라가 포함되어 있습니다. 및 이미징 소프트웨어
MATLAB 소프트웨어The Mathworks, Natick, MA
에는

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