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방법 논문

해마 조각에서 CA1 핵 농축 분획의 분리는 Synapto 핵 메신저 단백질의 활동에 의존하는 핵 가져 오기를 공부합니다

11.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51310

⸱

2014년 8월 10일

 ,  ,  ,  , 
1RG Neuroplasticity, Leibniz Institute for Neurobiology, 2Department of Cell Biology, Utrecht University

이 논문에서

요약

우리의 해마 CA1 영역과 슬라이스 tetanized 영역으로부터 핵 농축 분획의 분리 이후에 장기간 상승 작용의 유도에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 방법은 활성보기 학습 및 기억의 세포 모델에 의존하는 핵 단백질 수입을 결정하기 위해 사용될 수있다.

초록

학습 활동에 따라 단백질 발현, 세포 내 전위 또는 인산화는 시냅스 가소성의 기본 세포 메커니즘을 이해하는 것이 필수적이다. 장기 증강 (LTP) 및 급성 해마 조각에 의한 장기적인 우울증 (주)는 널리 학습과 기억의 세포 모델로 허용됩니다. 활동에 따라 단백질 역학을 시각화하는 라이브 세포 이미징 또는 면역 조직 화학 염색 방법을 사용하여 많은 연구가있다. 그러나 이러한 방법은 하나의 신경 세포에서 형광 표지 된 단백질의 면역 세포 또는 과발현에 대한 항체의 적합성에 의존하고 있습니다. 단백질의 면역 블로는 연구 결과의 독립적 인 확인을 제공하는 다른 방법이다. 개별 tetanized 해마 조각에서 세포 내 분수의 준비의 첫 번째 제한 요소는 재료의 낮은 금액입니다. 둘째로, 처리 절차는 중요 리터 심지어 매우 짧고 작은 조작 인해슬라이스를 iving하는 특정 신호 폭포의 활성화를 유도 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 쥐의 뇌에서 급성 해마 슬라이스의 CA1 영역에서 충분한 순도의 핵 농축 부분의 충분한 양을 얻기 위해 최적화 된 워크 플로우를 설명합니다. 대표적인 예로서 우리는 synapto 핵 단백질 메신저의 ERK1 / 2의 인산화 형태 야곱이 적극적으로 LTP의 유도에 따라 핵에 옭 및 CA1 신경 세포에서 핵 농축 분획에서 검출 될 수 있다는 것을 보여줍니다.

서론

시냅틱 N-메틸-D-아스파 테이트는 수용체 (NMDARs)는 시냅스 가소성 및 세포 생존이 신경 퇴행 및 세포 사멸을 유발할 수 extrasynaptic NMDARs 반면 시그널링의 활성화에 결정적인 역할을한다. 이러한 변화는 엄격하게 제어 / 규제 활동에 따라 유전자 발현에 의존하므로 활성화 시냅스 또는 수상 돌기 및 핵 7 사이의 지속적인 통신을 필요로한다. MAP는 ERK1 / 2 신호를 시냅스 NMDARs의 다운 스트림 이펙터하고 extrasynaptic NMDAR를 통해 시그널링 없거나 ERK1 / 2 활성 8,11에 대한 억제 효과가있는 반면, NMDAR 활성화에 의한 유전자 발현에 관여하지 않음을 키나아제.

원위 수상 돌기와 핵 사이의 셔틀로 표시되었습니다 단백질의 여러 가지가 있습니다. 이들 단백질의 대부분은 핵 이행 시그널을 포함하고 적극적으로 핵 6,9 네인과 임포 의존적으로 microtubuli을 따라 수송된다. InterestinglY, 특정 시냅스 자극에 대한 응답으로 핵이 사자의 일부는 교통. 예를 들어, 사이 클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질이 (CREB2)의 역행 수송 화학 LTD 아니라 LTP (12)에 의해 유도된다. 지역화 NMDAR 종속 시냅스 자극 장기 해마 가소성 4에서 포함되는 핵 전좌 프로세스로 CREB 조절 전사 보조 활성화 (CRTC1)를 구동한다. 그것은 최근에 단백질 메신저 야곱이 모두 후 핵 시냅스와 extrasynaptic NMDAR 활성화에 옭 및 CREB 따라 유전자 전사 5를 조절 것으로 나타났다. 신호의 시냅스 또는 extrasynaptic 원점은 야곱의 번역 후 변형에 인코딩된다. 시냅스 활동이 주​​ 해마 문화의 핵 이후의 전위에 대한 필수입니다 위치 180 (pJacobS 180)에서 중요한 세린에서 야곱의 ERK1 / 2 의존 인산화를 유도한다. 또한, 전N CA1의 샤퍼 담보 LTP 후 핵 급성 해마 조각 pJacobS 180 옭의 뉴런하지만은 1,10 LTD. pS180 야곱은 가소성 관련 유전자의 발현 증가로 연결이 유전자 발현은 시냅스 기능에 피드백. extrasynaptic NMDARs의 활성화가 Ser180 인산화되지 않고 원인이 핵에 다른 단백질 복합체와 연관 될 수 있습니다 후 핵 옭 대조적으로, 야곱에서 'CREB는 차단'와 연접 (10)의 후퇴.

synapto 핵 단백질 메신저의 핵 수입에 출판 된 대부분의 연구는 해리의 연결을 기본 문화에서 수행되고있다. 신경 세포의 연결 및 기능이 매우 잘 보존 된 곳 따라서 이러한 연구 결과는 해마 조각을 사용하여 생리 학적 관련성 조건에서 재현 할 수 있는지 흥미로운 일이 될 것이다. 여기에서 우리는 LTP 드를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 제시면역 블로에 의해 단백질 메신저의 핵 전좌 매달린. 이 방법은 조 핵 분획 단백질의 활성에 의존 인산화 분석에 적합하다. 구체적으로는, 현재 프로토콜은 급성 CA1 해마 슬라이스, 유도, 및 LTP의 기록의 준비를 포함한다. 다음에, CA1 영역 현미경 자극 영역을 분리 해부된다. 우리는 결합 조 및 동료 (17)에 의해 도입 된 변경 CellLytic 핵 추출 키트에서 제공하는 핵 분리를위한 프로토콜을 수정했습니다. 최적화 과정은 세포 부종과 핵의 분리를 허용 저장성 버퍼 해부 CA1 영역의 용해를 포함한다. 세포 용해 및 핵의 형태를 현미경 검사에 의해 결정될 수있다. 핵 농축은 짧은 원심 분리 단계에 의해 달성된다. NeuN 및 NSE​​2 핵 또는 세포질 분획 특정 마커에 대한 항체로 면역 블 롯팅 분석을하는 것은이 방법은 고속으로 사용될 수 있음을 나타낸다재생 가능한 프로토콜은 이러한 세포 내 분수를 분리하고 단백질 인산화와 같은 매우 불안정한 번역 후 변형을 연구. 또한,이 방법은 해마 슬라이스 해부 CA1 영역으로부터 도출 작은 조직 샘플에 유리하고 해마 슬라이스에 면역을 조합하여 사용할 수있다.

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프로토콜

성인 쥐의 뇌에서 급성 해마 조각의 1 준비

  1. 이소 플루 란 쥐를 마취. 주의 : 폐쇄 exicator를 사용하여 절차를 수행, 이소 플루 란을 흡입하지 않습니다. 동물이 완전히 마취되어 있는지 확인합니다.
  2. 신속하게 쥐의 목을 벨 뇌를 분리하고, precarbonated (95 %, O2 / 5 % CO 2 가스 혼합물) 얼음처럼 차가운 밀리미터의 Gey의 솔루션 (구성에 젖어 : (130)의 NaCl, 4.9의 KCl, 1.5 염화칼슘 2 · 2H 2 O를 0.3 황산 4 · 2H 2 O, 11 MgCl2를 · 6H 2 O, 0.23 KH 2 PO 4, 0.8 나 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 포도당 · H 2 O, 25 HEPES, 22 탄산 수소 나트륨, 산도 7.32) 30 분 1,2,10,16합니다.
  3. entorhinal 피질의 소뇌 부분을 제거합니다. 다음의 내측 표면에 각각의 반구를 배치, 중간 시상 컷 대뇌 피질 반구를 분리합니다. 그 후 확인각 반구 (13, 14)의 지느러미 가장자리를 따라 50 ~ 70 ° 컷 (50 ~ 70 °의 횡 방향).
  4. 절편 시스템의 슬라이스 플랫폼에서 갓 잘라 표면과 각 반구를 붙인다. 이 플랫폼은 precarbogenated 얼음처럼 차가운 Gey의 솔루션이 적용되어야한다.
  5. z 축 진동을 최소화하기 위해 조정 된 vibratome를 사용하여 다른 쪽면 후부하기 위해 전방에서 350 μm의 50 ~ 70 ° 횡단면을 잘라. 해마 형성 subicular 및 entorhinal 피질뿐만 아니라 해마에있는 dorsolateral을 피질 13,14 실험에 사용 슬라이스의 일부가 될 것이다.
  6. U 모양 및 침수 형 인큐베이터에 해마 슬라이스를 전송하고 carbogenated 인공 뇌척수액 (ACSF (단위 : mm) 포함 32 ° C에서 적어도 2 시간 동안 품어 : 2H 2 O, 1.5 황산 · 110 염화나트륨, 2.5의 KCl, 2.5 염화칼슘이 4 · 2H 2 O, 1.24 KH 2 PO 4, 10 포도당 · H 2O, 27.4 탄산 수소 나트륨, 산도 7.3) 1,2,10,16.

2 전극의 위치, 기준 기록 및 LTP의 유도

  1. 현미경 장착 침수 타입의 기록 챔버에 해마 슬라이스를 전송합니다. 32 ° C에서 최소 30 분 동안 carbogenated ACSF로 (6-7 ml / 분)를 관류.
  2. (팁 저항 MΩ 3-5 인) ACSF 가득 유리 모세관 미세 전극을 준비합니다.
  3. 자극과 fEPSP의 CA1 지층 radiatum 기록 1,2,10 (그림 2)에서 CA1 샤퍼 담보 섬유에 ACSF 가득 유리 미세 전극을 배치합니다. 전극 사이의 거리는 약 300 μM이어야한다.
  4. 3-4 V.의 범위에서 이상성 직사각형 전류 펄스 (200 밀리 초 / 극성)와 샤퍼 담보 섬유의 자극에 의​​해 필드 흥분성 시냅스 후 전위 (fEPSPs)를 보여주고 있습니다
  5. INP을 측정함으로써 최대 자극 검사를 수행UT 출력 관계가 얻어 fEPSP 최대 슬로프 값의 40 %의 자극 강도를 정의하고 실험 내내 일정하게 유지.
  6. 최대 자극 검사 후 최소 15 분 동안베이스 라인 녹음을 시작합니다. 실험을하는 동안 모든 분을 자극 테스트 응답을 측정한다. 저주파 자극과베이스 라인 녹음을 수행합니다.
  7. 적어도 30 분 동안 기준선을 기록합니다.
  8. 늦은 LTP 유도를 들어 고주파에게 5 분 intertrain 간격으로 100 Hz에서 세 1 초 자극 열차로 구성된 100 Hz에서 tetanization을 적용합니다. CA1 지역 5 μM의 bicuculline 내 자극의 필드를 증가시키기는 tetanization 전에 2 분 세척 할 수 있으며, 즉시 마지막 tetanization 후에 세척해야한다.

LTP와 스냅 동결 유도 후 조각의 3 컬렉션

  1. 정지 LTP는 2 분이나 늦게 LTP를 유도 파상풍의 자극 세 열차 후 30 분을 기록.
    2. 전극을 제거하고 신속하게 드라이 아이스에 배치 precold 금속 플랫폼에 슬라이스를 전송합니다. U 모양의 인큐베이터에 보관 제어 슬라이스에 대해이 절차를 반복합니다. 주의 : 장갑 드라이 아이스와 함께 작업하는 동안.
  2. -80 ° C에서 1.5 ML 튜브 및 저장소에있는 각 조각을 수집합니다.

해마의 CA1 지역에서 핵 농축 분획의 4 격리

  1. -80 ° C에서 냉동 슬라이스로 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브를 타고 얼음에 보관하십시오.
  2. 추가 튜브에 신선한 차가운 TBS 버퍼를 포함하는 단백질 분해 효소 (PI) 및 포스 파타 아제 (PS) 억제제, 0.5 ml의. 2 ~ 3 분 동안 품어 실체에 전송합니다. 주의 : 보호 장갑과 PI와 PS 작업하는 동안 실험실 코트.
  3. 두 바늘을 사용하여 해마의 CA1 지층 pyramidale 영역을 해부하다. 실체와 CA1 영역의 절단 초 바늘 아래 슬라이스를 유지하기위한 하나의 바늘을 사용한다.
  4. 해부 CA를 수집50 ㎕의 용해 완충액을 함유하는 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 (각 그룹에 대해) 5 조각에서 한 지역 (mm 단위 함유 저장성 용해 완충액 1x에서 10 HEPES를, 1.5 MgCl2를, 10의 KCl, PI 및 PS으로 pH 7.9). 소재의이 금액은 2 ~ 3 immunoblots을 실행하기에 충분한 있습니다.
  5. 아래주의 피펫 위로에 의해 수집 된 조직을 균질화. 200 μL 피펫을 사용합니다. 세포가 팽창 할 수 있도록 5-7 분 동안 얼음에 해물을 품어.
  6. , 해물의 2 μl를 가지고 현미경 슬라이드를 삭제하고 밝은 필드 현미경으로 세포의 부종을 시각화. 세포의 적절한 팽창으로 핵은 원형 그대로 구조를 나타납니다.
  7. '균질 부분'등 신선한 1.5 ML 튜브에 샘플의 20 μl를 수집합니다. 배 SDS 샘플 버퍼를 변성의 8 μl를 추가합니다.
  8. 1 분 동안 11,000 rpm에서 원심 분리 잔류 해물.
  9. 조심스럽게, 그럴 상단 ( '세포질 부분')에서 상층 액을 수집ansfer 새로운 튜브에 넣고 4 배의 샘플 버퍼의 20 μl를 추가합니다.
  10. 저장성 버퍼의 60 μL에 펠렛을 재현 탁하고 배 샘플 버퍼의 20 μl를 추가합니다. 이 분획을 '핵 농축 분획'라 칭한다.
  11. 균질, 세포질 및 핵 농축 분획 또는 -80 나중에 면역 블로에 대한 C ° -20 ° C에서 저장 될 수있다.

Synapto 핵 단백질에 대한 5 반 정량적 Immunoblotting 방법

  1. 샘플을 Defreeze 95 ° C에서 5 분간을 끓인다.
  2. 각 부분에서 5 μl를 타고 아미 검정 시험 또는 BCA 시험에 의해 단백질 농도를 결정한다.
  3. SDS-PAGE에 균질에서 단백질 시료의 같은 양의 세포질과 핵 농축 분획을로드합니다. 제어 및 LTP의 조각에서 샘플을 직접 비교를 위해 동일한 겔에 배치해야합니다.
  4. 표준 서구 블로 팅 절차를 수행 (젖은 전송 권장).
  5. t으로 막을 프로브그는 선택의 항체의. 특정한 뉴런 enolase2 (NSE2)과 핵 마커 - - NeuN 및 로딩 대조군으로서 액틴 항체이어서 동일 롯 (또는 병렬로 실행 동일한 샘플) 세포질 마커를 탐색 할 수있다.

(6) 데이터 분석

  1. LTP 유도의 효율 Clampfit 소프트웨어에 의해 분석 될 수있다. 기준선 기록의 평균 기울기 tetanization 후 경사면 양방향 ANOVA, P를 사용하여 비교 하​​였다 <0.05는 유의 한 차이로 간주 하였다. fEPSP 기울기 값은 SEM 평균 ±로 다이어그램에 묘사 된
  2. immunoblots의 정량, 방사 법적 필름 중 하나를 스캔 Licor 시스템 ImageJ에 또는 형광 단백질 밴드에 의한 대역의 집적 밀도를 분석한다. 면역 밴드의 값은로드 및 블로 팅 제어를 정상화해야합니다. 컨트롤의 비교 및​​ LTP 그룹의 경우 nonparametrical 맨 - 휘트니 U 테스트를 사용할 수 있습니다.
버퍼의 이름 시약 농도 (㎜) 금액 댓글 / 설명
Gey의 솔루션 (산도 : 7.4 ~ 7.3) 염화나트륨 130 7.6 g 멸균 여과
1000 ML 의 KCl 4.9 0.37 g
염화칼슘 2 · 2H 2 O 1.5 0.22 g
황산 4 · 2H 2 O 0.3 0.0739 g
MgCl2를 · 6H 2 O 11 2.24 g
KH 2 PO 4 0.23 0.0313 g
나 2 HPO 4 · 7H 2 O 0.8 0.2145 g
포도당 · H 2 O 5 0.9909 g
HEPES 25 5.96 g
탄산 수소 나트륨 22 1.85 g
ACSF (산도 : 7.4 ~ 7.3) 염화나트륨 (110) 6.428 g 멸균 여과
1000 ML 의 KCl 2.5 0.1865 g
염화칼슘 2 · 2H 2 O 2.5 0.368 g
황산 4 · 2H 2 O 1.5 0.370 g
KH 2 PO 4 1.24 0.169 g
포도당 · H 2 O 10 1.9817 g
탄산 수소 나트륨 27.4 2.3 g
1 배 저장성 완충액 (pH : 7.9) HEPES 10 0.23 g
100 ml의 MgCl2를 · 6H 2 O 1.5 0.0304 g
의 KCl 10 0.07455 g

표 1 버퍼.

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결과

우리는 이전에 synapto 핵 단백질 메신저 야곱이 LTP의 유도하지만 LTD 한 다음 핵에 축적 것으로 나타났습니다. 또한, 시냅스 자극 후 야곱의 전위는 Ser180 (그림 1)에서 MAPK ERK1 / 2의 활성화와 야곱의 인산화가 필요합니다. 인산화 야곱은 임포 의존적으로 핵에 옭 및 인산화 상태는 15 αinternexin 중간 필라멘트와 관련하여 (그림 1)에 의해 장기간에 걸쳐 보존 할 수 있습니다. 야곱의 인산화 상태는 활동에 의존하는 유전자와 세포 생존의 발현에 중요합니다. 흥미롭게도, extrasynaptic NMDARs의 활성화는 핵으로 야곱을 구동하지만,이 경우에는 야곱은 Ser180에서 인산화되지 않고 핵 축적이 CREB을 유도 5,10을 '차단'. 상기 결과에 의해 수득 하였다 protoco우리의 최근의 연구에 설립 된 LS (참조 Karpova 등. ...

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토론

위의 프로토콜에 설명 된 단계는, 해마 급성 젊은이나 성인 쥐에서 슬라이스 준비 슬라이스의 자극 영역을 유도하고 기록 LTP가 신속하게 해부하고, 활동에 따라 단백질 역학을 공부 핵 농축 분획을 준비하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이러한 접근 방식은 서로 독립적으로 사용되는 몇 가지 상이한 방법의 조합으로부터 도출한다. 우리는 워크 플로우를 최적화 LTP의 유도에 따라 단백질의 세포 내 재배포을 연구하기 위해 자신의 실험을 설정하는 초보자를위한 충분한 세부 사항을 제공합니다. 예를 들어 우리는 LTP의 후반 형태 S180의 핵 축적이 야곱을 인산화 유도하는 것을 보여줍니다. 주어진 단백질의 기존 풀 핵의 인산화 활성 시냅스 후의 인산화 형태의 전좌를 구별하기 위해,이 방법은 핵 농축 분획에 관심 단백질의 전체 수준에 대한 제어와 결합 될 수있다. 또한, 전기 및 전자 테스트LTP의 유도 후 서로 다른 시간 점 이상 NG 샘플은 단백질의 활성화 / 비활성화 또는 핵 매출의 시간 과정을 연구하는데 매우 통찰력이있을 수 있습니...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP 보조금 (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK 및 SB)의 지원을 받았으며, MM은 European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) 및 Marie-Curie IEF의 수혜자입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Equipment
CED 1401 AD/DA 컨버터Cambridge Electronics Design, UK
a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">StereomicroscopeLeica S4E, 독일
VibrotomeLeica VT1000S, 독일
절연 펄스 자극기AM 시스템, 미국모델 2100
원심분리기Thermo Scientific
SDS-PAGE 시스템Biorad
쿨러Julabo
명시야 현미경Nikon Eclipse TS100
세포 배양 인큐베이터Thermo Electron Corporation
Micromanipulator루이그 & Neumann, SM-5, 독일
블로팅 챔버 및 전력 공급업체 Hoefer Scientific Instruments, 샌프란시스코, CA
수중 유형 녹음 챔버맞춤형 U
-형 및 수중 유형 인큐베이터 맞춤 제작
작은 수술용 가위
메스
얇은 주걱
플라스틱 파스퇴르 피펫
플라스틱 문화 접시 
분젠 비커
주사기
Reagents
NaClRothArt.-Nr.3957.1≥ 99.5 %, P.A., ACS, ISO
KCL로스Art.-Nr.6781.1≥ 99.5 %, P.A., ACS, ISO
CaCl2· 2H2OMerck1.02382.0500프로 분석
MgSO4· 2H2OMerck5886.05프로 분석
MgCl2· 6H2OAppliChemCAS-NO: 7791-18-6; EC-NO 2320946:분자 생물학
KH 2 < / sub>PO 4 < / sub>Merck12034.025분자 생물학
Na2< / sub>HPO4< / sub>· 2H2OMerck1.06574.1000엑스트라 퓨어
글루코스&미드도트; 분자 생물학을 위한 H2ORothArt.-Nr.6887.1
HEPESRothArt.-Nr.9105.4PUFFERAN, ≥ 99.5%, 아빠
NaHCO3Merck1.06329.1000프로 분석
프로테아제 억제제 칵테일Roche
PhosphostopRoche
BicucullineTocris Bioscience
IsofluraneBaxter
항체
1차 항체회사카탈로그 번호종
pJac-s180Biogenes,rabbit (diluted 1:100)
NeuNMiliporeMAB377mouse (diluted 1:1,000)
NSECell SignalingD20H2rabbit (diluted 1:1,000)
Beta-actinSigmaA-5441mouse (diluted 1:5,000)
Secondary antibodies회사카탈로그 번호종
IgG HRP conjugatedDAKO염소 안티 마우스 (1 : 5,000)
IgG HRP 활용NEB염소 안티 토끼 (1 : 5,000)
<: : , :

참고문헌

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핵 농축 분획CA1 영역LTP 유도웨스턴 블롯 분석시냅스-핵 단백질인산화된 Jacob 검출저장성 용해 버퍼조직 절단단백질 전이
해마 조각에서 CA1 핵 농축 분획의 분리는 Synapto 핵 메신저 단백질의 활동에 의존하는 핵 가져 오기를 공부합니다
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