방법 논문

셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

DOI:

10.3791/51317

⸱

2014년 7월 24일

1Laboratoire Matière et Systèmes Complexes, UFR de Physique, Université Paris Diderot, 2Institut Jean-Pierre Bourgin, UMR1318 INRA-AgroParisTech, INRA Centre de Versailles-Grignon

이 논문에서

요약

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원자력 현미경(AFM)을 사용하여 식물 조직의 기계적 특성을 매핑하는 방법을 설명합니다. 우리는 식물 발달 중 세포벽에서 발생하는 기계적 변화를 광시야 중간 규모로 기록하여 이러한 변화가 성장 및 형태 형성과 상관 관계가 있을 수 있도록 하는 방법에 중점을 둡니다.

초록

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우리는 JPK AFM 위해, 원자 힘 현미경 (AFM)의 마이크로 / 나노 만입를 사용 식물 조직의 표면의 기계적 성질을 측정하기 위해 최근 개발 된 방법을 서술. 특히,이 프로토콜에서 우리는 꽃 분열 조직, 배축, 뿌리의 × 100 μm의 최대 100 μM의 지역에 걸쳐 세포 내 해상도에서 세포벽의 겉보기 탄성 계수를 측정한다. 이 샘플의주의 준비, 마이크로 압자 및 압입 깊이의 올바른 선택이 필요합니다. 단, 측정 셀 plasmolyze 따라서 세포 팽압의 기여를 제거하기 위해 만니톨의 고농도 용액으로 수행되어 세포벽 특성을 고려하여.

다른 현존하는 기술과 대조적으로, 다른 덴터 및 압입 깊이를 사용함으로써,이 방법은, 동시 다중 스케일의 측정을 허용 그러나, 몇 가지 제한 사항이 남아 있습니다 방법은 (직경 100 μm의 정도) 만 외부 조직에 매우 작은 샘플을 사용할 수 있습니다; 이 방법은 조직의 지형에 민감하다; 그것은 조직의 복잡한 기계적 특성의 특정 측면을 측정합니다. 기술이 급속도로 개발되고 있으며 이러한 제한의 가장 가까운 미래에 해결 될 가능성이있다.

서론

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식물의 성장은 유기체의 각각의 셀을 둘러싸 강성 세포벽 코디 팽창에 의해 달성된다. 증거를 축적하는 것은 식물이 로컬이 확장을 제어하는​​ 세포 벽 화학의 변경을 나타냅니다. 팽창은 셀의 높은 팽압 기인 셀벽에 변형에 의해 주로 구동되는 것으로 생각된다; 팽압이 변형 응답은 셀 벽 (1)의 기계적 특성에 의해 지배된다. 약간은 이러한 기계적 특성으로 알려져 있으며, 그들이 개발하는 동안 변경하는 방법. 더욱이 작은 이러한 기계적 특성은 피드백 명백하게 조직에 걸쳐 조정되는 방식으로 셀 벽 화학을 변경할지 여부를 올릴 제어되는 방법으로 알려져있다. 우리는 화학 및 기계적 개발 중에 식물 세포벽의 변화, 그리고 궁극적으로 이러한 방법에 미세한 상호 작용을 제어하는​​ 발전소 사이의 연결을 이해하는 경우에의 거시적 성장, 세포 또는 조직 규모로 장기를 개발하는 셀 벽의 기계적 특성을 모니터링 할 방법이 요구된다.

원자 힘 현미경 (AFM) 방법은 마이크로 미터 또는 나노 미터 티슈 압박 또는 만입 부에 기초하는, 기재, 세포 이하의 해상도에서 동시에 장기를 개발하고 조직의 전 영역에 걸쳐 세포 벽의 기계적 성질을 측정하기 위해 정밀하게 개발되었다. 다른 방법이 하나 너무 낮거나 너무 높은 해상도 : 신율은 밀리미터 규모 2-4, 초기 이벤트를 측정하기에 너무 큰 예를 들어 인 규모로 전체 조직의 평균 기계적 특성을 측정하기 만 할 수있다 기관 형성; microindenter는 나노 미터 스케일에서 세포 이하의 해상도로 측정 할 수 있지만, 고립 된 세포가 아닌 세포 또는 장기 5-7의 그룹을 측정으로 제한됩니다. AFM으로는 필요D 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도는 8 ~ 10을 달성 할 수있다. 최근 여러 프로토콜도 11, 12을 사용할 수 식물 조직의 역학을 측정하기 위해 특별히 개발되었다.

우리는 명백 영률 (13)의 측정을 통해 조직의 탄성을 평가하는 방법을 여기에 제시한다.

영 모듈러스는 일반적으로 재료의 강성을 설명하는 데 사용된다. 작은 변형 중에 재료를 변형 시키는데 필요한 힘은 압입의 면적에 비례한다. 젊은 계수이 계수이다. 연속 균질 재료의 경우에는 동일 계수에 관계없이 압입 타입 (크기 및 형상)의 측정되지만 둘레의 속도로 변화 할 것이다. 식물 조직의 복잡한 구조의 경우에, 우리는 지금까지 힘이 판단을 허용하는 변형에 비례한다는 관찰우리가 "명백한 젊은 계수"의 이름을 비례 계수. 식물의 연속 MEDIAS에서 대조적으로,이 명백한 젊은 계수는 들여 쓰기의 크기에 민감합니다. 그것은 순수 세포벽의 젊은 계수에 대응하지 않는다. 그것은 최고의 조직의 세포 벽의 발판의 신축성을 설명합니다.

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프로토콜

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1. 샘플 장착 용 유리 슬라이드를 준비합니다

  1. 아가로 오스 매체 복제 인간의 DNA 준비 : 10 % 만니톨 (물)의 0.7 % 저 융점 아가.
  2. 강한 금속기구 (예를 들면 드릴 팁, 라임)을 사용하여 현미경 유리 슬라이드의 중심에 0.5 × 0.5 cm의 영역을 에칭. 또는 그 대신, 아랄 다이 접착제를 사용하여 유리 슬라이드에 유리 라멜라 (약 20 × 200 ㎛)의 작은 조각을 접착제. NOTE :이되도록하여 아가로의 부착을 용이하게하기 위해 표면을 거칠게하는 슬라이드 아가 미디어 스틱 또는 수정. 이 슬라이드는 재사용 할 수 있습니다.
  3. 유리 슬라이드의 에칭 지역에 아가로 오스 매체 복제 인간의 DNA의 약 20 μL의 방울을 배치합니다. 따라서, 아가 로스의 박막을 준다.
  4. 습기가 상자에 유리 슬라이드를 저장하고 아가 로스 미디어가 응고 될 때까지 기다립니다.

2. 분열 조직 샘플을 해부 및 설치

  1. 공 초점 이마 기위한 Microdissect 분열 조직NG : 초 미세 핀셋을 아래로 당겨서 줄기에서 꽃 봉오리 하나 하나를 제거합니다. 그것은 (P1 원기 14 즉) 꽃받침 잎을 나타내지 않는 꽃 봉오리에 모든 꽃 봉오리를 제거하는 것이 중요합니다.
  2. 면도날이나 핀셋의 끝 부분을 사용하여, 멀리 줄기에서 분열 조직을 잘라. 컷은 AFM으로 측정한다 분열 조직 표면의 영역에 평행해야한다. 얻어진 정점은 300 μm의 AFM 팁 아래에 맞게 높은 600 μm의 사이에 있어야한다.
  3. 단계 1.1.4에서 준비 아가로 오스 미디어의 영화로 정점을 밀어 넣습니다. 유리 슬라이드 / 아가로 오스의 위치를​​ 선택하고 분열 조직은 유리 슬라이드에 접촉 직접적이며, 아가로 오스에서 밖으로 돌출 부드럽게 등을 밀어 넣습니다. 그것은 줄기에서의 컷을 따라 몇 초 내에 아가로 오스의 분열 조직의 위치를​​ 매우 중요합니다. NOTE :이 건조로부터 분열을 방지하기 위해서이다. 이 단계에서, 분열 조직은 CRAC 서한다아가로 오스는 압력의인가시 골절 때문에 K.
  4. 그들은 같은 높이의이고 하나의 슬라이드에 서로 미만 500 μm의 위치하도록 제공하고, 여러 분열 조직에게 일괄 이미징이 방법을 준비합니다. 추가 샘플을 해부하는 동안 습기 상자에 준비 분열 조직을 유지.
    참고 : 교정에서 오는 변화를 제한합니다. 각 조건의 적 2 샘플을 준비하고 무작위로 측정 할 수있다. 지금까지 측정 (스트레스 유발 응답)에 배치 영상의 더 관찰 된 효과가 없습니다. 이 한천 및 / 또는 설치 솔루션 스트레스 신호 전달 분자의 희석에 대한 감사가 될 수 있습니다. 대안 적 스트레스 반응에 관계없이 제조 된 샘플의 양과 동일하다.
  5. 다음 단계로 이동하기 전에 분열과 꽃 봉오리의 경계가 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 완만하게 여과지를 사용하여 과잉의 물을 제거한다. 이것은 녹은 다음 단계에 방지해야아가로 인해 모세관 힘에 샘플을 홍수.
  6. 20 μL 피펫으로 충분히 추가 단계 1.2.3에서 생성 된 균열을 채우기 위해 아가로 오스 장착 녹아있다. 각 분열 조직을 둘러싸. 아가로 오스가 제거 된 꽃 봉오리 (primordium)의 흉터의 수준에 도달해야한다. 이것을 달성하기 위해서는, 균열의 각 단부에 아가 로스를 첨가 할 필요가있을 수도있다.
  7. 아가 로스를 첨가되면 신속 균열로 범람 할 것이다; 피펫을 사용하여, 분열 조직 슬라이드의 가장 높은 지점에 있는지 확인하는 아가로 오스 장착 용융의 일부를 빨아. 이 영상 중에 이동할 수 있도록이 분열을 해결합니다.

3. 설치 루트 또는 배축 샘플

  1. 뿌리와 배축의 경우, 절개가 필요하지 않습니다. 제조 된 유리 슬라이드에 아가로 오스의 박막에서 직접 유리에 에칭 위 또는 유리의 얇은 판을 따라 하나 홈을합니다. 그것과 접촉하는 것을 보장이 홈에 루트 또는 배축을 놓고그것의 전체 길이를 따라 유리.
  2. 다음 단계로 이동하기 전에 샘플 표면에 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 완만하게 여과지를 사용하여 과량의 물을 제거한다.
  3. 추가 단계 1.2.6에서와 같이 시료의 주위에 아가로 오스 장착 녹아있다.

4. AFM 준비 및 감도 교정 (JPK Nanowizard AFM 용)

  1. AFM의 캔틸레버를 탑재합니다. 캔틸레버는 둥근 모양 인 덴터에 장착해야합니다. 반경은 X, Y, Z의 해상도와 정확한 측정이 보관 될 수있는에 압입 깊이를 결정합니다.
    1. 표피의 표면에서 메조 나노 측정을 수행하려면, 50 nm의 반경 라운드 압자를 사용; , 중규모 측정을 0.5 μm의 반경 라운드 압자를 사용하는; (2 ~ 3 세포를 통해) 마이크로 측정을 위해, 2.5 μm의 반경 라운드 압자를 사용합니다.
  2. 캔틸레버의 끝에서 레이저의 위치. 중간에 레이저를 맞 춥니 다미러를 사용한 포획의.
  3. AFM에서 깨끗한 유리를 배치합니다.
    NOTE : 다음은 캔틸레버의 변형에 AFM 수용체에 레이저의 위치 신호를 변환하도록 설정하고, 강제로 번역하기 위해, 캔틸레버의 스프링 정수를 평가하는 것이다.
  4. 1 V.의 목표 힘 "세트 포인트"로 접근
  5. "힘 분광"를 선택합니다. 2 V에 최대 "상대 세트 포인트"를 설정하여 들여 쓰기를 수행, 40 μm의 / 초에 "속도를 확장", 5 μm의 "Z 길이".
  6. "교정 관리"메뉴에서 "적합 범위를 선택"버튼을 사용하여 감도에 맞게 앞으로 곡선의 선형 부분을 선택합니다. "상대 세트 포인트"는 "m"에 "볼트"에서 변형되어야한다.
  7. "교정 관리"메뉴에서 엘에게 평가하는 "스프링 상수"를 선택열적 변동을 이용하여 캔틸레버의 asticity. 캔틸레버의 스펙트럼 밀도 플롯을 얻기를 눌러 "실행". 가장 낮은 주파수와 공진 피크를 찾을 수 있습니다. "맞는 범위를 선택"버튼을 사용하여 장착합니다.
    주 1 :. 열 변동 조정에 대한 자세한 내용은 쿡 등 15 읽기
    NOTE 2 : 이것은 (알려진 또는 강성 소재) 참조 캔틸레버를 이용하여 캔틸레버의 탄성을 평가하는 직접적인 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 여기에 사용 된 하나 친절하게 테프 Asnacios (16)에 의해 기증되었다.
  8. 캔틸레버 끝에서 10 % 만니톨 용액 200 μl를 추가합니다. 미러를 사용한 포획의 중앙에 레이저를 재조정.
  9. 감도를 재 보정 : "교정 관리"메뉴에서, "알 수없는"버튼을 클릭; 반복 2.5을 통해 2.3 단계를 반복합니다.

. 5 데이터 수집 : 명백한 영률지도 제작

  1. AFM 아래에 장착 된 샘플의 위치를​​ 샘플에 10 % 만니톨 용액 500 μL 방울을 추가합니다. 만니톨 용액 분 이내에 세포를 plasmolyzes.
  2. 20 윈의 목표 힘 ( "지점을 설정")에 접근 ( "설정 포인트는"3 개 이상 V이어야한다)
  3. 200 윈의 "상대 세트 포인트"와 들여 쓰기, 40 μm의 / 초 "속도를 확장", 5 ㎛, "Z 길이".
  4. 캔틸레버 또는 1 μm의 / 5 μm의 장착 캔틸레버 0.5 μm의 장착 뉴 멕시코 200 100 ㎚의 들여 쓰기를 얻기 위해 "상대 설정치를"조정합니다.
  5. , 분열 조직을 위해, 해상도 64 X 64 ( "픽셀")와 70 μm의 X 70 μm의 "힘 매핑"모드에서 스캔 할 영역을 선택 배축과 뿌리, 64 X 64의 해상도와 100 μm의 × 100 μm의.
  6. 를 눌러 실험을 시작하기 위해 검사합니다. 출력을 저장합니다.

. 6 데이​​터 분석 : 명백한 영의 계수 계산

  1. 데이터 분석 소프트웨어로 데이터 파일을 연다.
  2. 단일 맵의 모든 곡선에 같은 분석을 적용하는 "일괄 처리"를 선택합니다.
  3. 그래서 압입 깊이를 추출하는 "캔틸레버의 휨의 높이를 수정"을 선택합니다.
  4. 힘이 들여 쓰기의 영역에 비례 가정합니다 "탄성 계수 맞는 기능"을 선택합니다. 들여 쓰기 형태가 포물선이라고 가정 할 포물선하기 위해 "팁 모양"을 설정합니다.
  5. 팁의 반경을 나타냅니다.
  6. 는 "확장"곡선보다 지형에 덜 민감하기 때문에 우선적으로 분석을위한 "후퇴"커브를 선택합니다. 프로브의 중요한 고집이 동안이 경우, "후퇴"고집에 민감하다 "확장"곡선을 사용합니다.
  7. 세트0.5 포아송 비. 눌러에서 분석하고 결과를 저장합니다.

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결과

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그림 1에서 우리는 꽃 분열 조직의 전형적인 젊은 계수 맵 (그림 1A 및 1B), 젊은이와 노인 배축 (그림 1C-F), 및 루트 분열 조직 (그림 1G 및 1H)를 제시. 모든 실험에서 압자는 반구형이지만, 다른 공간 해상도를 달성 할 수 있도록 그 반경이 다른 1C 및 1D는 메조 나노 압입 (50 nm의 깊이)과 메조 나노 인 덴터 (50 nm의 반경)에 대한 전형적인 결과를 보여준다.; . cartographs이 배축 표피 세포의 표면 세포 벽에있는 마이크로 이질성을 공개 1A, 1E, 그리고 1G 피규어 꽃 분열 조직, 배축 및 루트 중규모 톱니 (500 nm의 깊이)와 중규모 압자 (5...

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토론

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식물에서, 기계적 특성 변화는 성장 및 형태 형성을 연출에서 중요한 역할을한다. 현재까지이 식물 성장을 제어하는​​ 유전 및 화학 네트워크를 이루는에 큰 진전되고 있지만, 이러한 네트워크에 기여하고 기계적 특성의 변화에​​ 의해 영향을받는 방법에 대한 우리의 지식은 초보했다. 이 방법은이 공백을 채울 할 수있게해야하고, 그래서 식물의 성장이나 형태 형성의 모든 측면을 연구 과학자에 강한 관심을 끌 수있을 것입니다. 우리는 지금 문제 및 제한 방법, 그리고 미래의 전망을 요약합니다.

프로토콜에서 가장 어려운 단계는 샘플 준비입니다. 이 샘플은 단단히 아가로 오스와 유리 슬라이드에 고정해야하지만,이 아가 로스를 측정 할 수있는 샘플의 모든 영역을 커버하지 않아야합니다. 미묘 건조를 방지하기 위하여 조직의 손상을 방지하기 위해 한층 제제 (분 이내) 충분히 빠르게 완료 할 수있다 : 부상차 가뭄은 셀 벽 (18)의 기계적 특성에 돌이킬 수없는 변화로 이어질 것으...

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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우리는 많은 도움이 토론 이브 Couder에게 특별한 감사를드립니다. 우리는 캔틸레버와 토론의 교정을 위해 테프 Asnacios 감사합니다. 우리는 비판적 읽기 리사 윌리스, 엘리엇 Meyerowitz, 올리버 Hamant 감사합니다. 이 작품은 인간 프론티어 과학 프로그램 보조금 RGP0062/2005-C에 의해 부분적으로 투자되었습니다; 직원은 국립 드 라 공들인는 '' '' Growpec, ''과 '' Mechastem를 투영합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AFMJPKNanoWizard모든 3 세대는 동일한 사전 설정으로 작업을 수행 할 수 있습니다.
AFM 스테이지JPKCellHesion낮은 지형(11 &마이크로; 힘 스캐닝 영역에서 가장 낮은 지점과 가장 높은 지점 사이의 m).
AFM 광학JPK평면도 광학 샘플을배치하는 데 매우 중요합니다. 장거리 쌍안경이나 현미경으로 대체할 수 있습니다.
실체 현미경LeicaM125모든 유형의 실체 현미경이 할 수 있습니다.
150nm 장착 캔틸레버나노 센서 Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, SwitzerlandR150-NCL-10표피 표면의 세포벽만 측정합니다.
1 &마이크로; m 장착 캔틸레버나노 센서 Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, SwitzerlandSD-Sphere-NCH-S-10표피 표면에 직교하는 세포벽의 역학을 측정합니다.
팁리스 캔틸레버나노 센서 Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, SwitzerlandTL-NCH-20조직의 국소 역학을 측정하려면 (2-3 세포 넓이) 5 µ를 사용하십시오. M 장착 캔틸레버. 우리는 5 µ를 부착했습니다. m 붕규산 비드를 팁리스 캔틸레버로.
5 &마이크로; m 실리콘 미세구미립자C-SIO-5
AralditeBartik S.A. 77170 Coubet, France팁이 없는 캔틸레버에 비드를 고정하기 위한 Araldite.
저융점 아가로스피셔 사이언티픽 페어 잔디밭, 뉴저지 07410BP160-10034-45 ° C 겔화 온도
D-MannitolSigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USAM4125-500G
2 스테인레스 스틸 No. 5 핀셋Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland 
951199

참고문헌

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