본 연구실은 더 세포 기능에 티슈 강성 변조의 효과를 이해하는 DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔, 하이드로 겔 동적 시스템을 개발했다. 여기서, 우리는 이러한 하이드로 겔을 제조하기위한 회로도, 설명, 및 프로토콜을 제공한다.
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이 논문에서
요약
초록
제어 공학은 세포 형태와 기능을 연출 물리적 신호의 중요한 역할을 해결하는 새로운 과학 분야이다. 조직 경화 질병, 개발 및 부상으로 변조하기 때문에 예를 들어, 세포 기능에 조직 탄성 효과는 제어 공학 연구의 중요한 영역이다. 세포가 일단 도금 강성을 변경할 수없는 고정 조직 모방 재료, 또는 재료는 주로 세포의 기능에 대한 조직의 강성의 영향을 조사하기 위해 사용된다. 정적 스터디에서 수집 된 정보는 가치가 있지만, 이러한 연구는 생체 내에서 세포 미세 환경의 동적 특성을 나타내는 것은 아닙니다. 더 세포 기능에 동적 강성의 영향을 해결하기 위해, 우리는 DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔 시스템 (DNA 젤)을 개발 하였다. 다른 동적 기판과 달리, DNA 겔이 감소 또는 자극없이 제조 후 강성도를 증가시키는 능력을 가지고있다. DNA 젤은 DNA의 crossl 구성폴리 아크릴 아미드 백본으로 중합 잉크. 추가 및 단일 가닥 DNA의 전달을 통해 가교를 제거하는 것은 시간, 공간, 겔 탄성 가역 제어 할 수 있습니다. 우리는 DNA 젤 탄성 동적 변조 섬유 아세포와 신경 세포의 행동에 영향을 미치는 것을 이전 보고서에 표시했다. 이 보고서와 비디오에서 우리는 준비 DNA 젤에서 DNA 겔 가교 메커니즘과 단계별 지침을 설명하는 회로도를 제공한다.
서론
정적 및 동적 기질은 세포의 기능에 조직 탄성 또는 강성의 영향을 연구하기 위해 개발 된 생체 물질의 두 가지 범주이다. 정적 기판은 세포가 도금 및 / 또는 일단 제작 된 후 물리적 속성을 변경할 수 없습니다. 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔은 제어 공학 조사 5,17 위해 합성했다 제 이차원 정적 기판이었다. PA 젤은 다용도, 저렴, 쉽게 준비하고, 탄성 계수의 넓은 범위로 제조 될 수있다. 이 기술의 장점은 PA가 일반적으로 적용 기판 젤하게하지만, 정적 기판은 생체 내에서 세포 외 기질 (ECM) 및 주변 세포 환경의 동적 특성을 나타내는 것은 아닙니다. 예를 들면, ECM은 상해, 현상, 또는 질병의 결과로서 강성 변화를 겪는다. 동적 기판 따라서 제어 공학 연구에서 조직을 흉내 낸 기판 모델로 선호 22,24,25.
수많은 합성은 자연적인, 이차원, 삼차원, 정적 및 동적 생체 재료는 티슈 1,3,6,16,23,26 강성을 모방하기 위해 개발되어왔다. 몇몇 기판들은 동적 기계적 특성을 변경 2,4,7,8,12,15,16 열, UV, 전류, 이온, 및 pH 변화를 필요로하지만, 이들 자극은 하이드로 겔의 생체 응용을 제한 할 수있다. DNA 가....
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프로토콜
참고 : 셀 처리 젤 준비에서 전체 프로토콜은 육일의 최소 소요됩니다. 젤 준비를위한 예상 시간은 8 시간 플러스 O / N 배양이다. 젤 고정 및 DNA 어닐링에 대한 예상 시간은 8 시간 플러스 O / N은 헹굼 단계입니다. 젤 작용에 대한 예상 시간은 2 시간이다. 셀 도금 및 성장을위한 시간은 문화 유형 및 응용 프로그램에 의존하지만, 사일의 최소 필요합니다.
DNA 젤의 1 준비
참고 : 세 가지 단계로 DNA 젤을 준비합니다. 첫째, 개별적으로 PA 백본에 SA1과 SA2 ssDNA를 중합. 이러한 솔루션은 SA1 중합 용액 중합 SA2 솔루션, 각각라고 (§1.1). 둘째, 가교제, 가역적 가닥 및 제어 ssDNAs을 녹인다. 동결 건조 된 L2 ssDNA를 (가교제)을 녹인다. 이것은 L2 용액 100 %라고하고 100 % 겔 (§1.2)를 제조하는데 사용된다. 백퍼센트 L2 용액의 분취 량을 희석80 %. 이것은 L2 용액 80 %라고하고 80 % 겔을 제조하는데 사용된다. §4에 사용하는 동결 건조 R2 (양면 가닥) 및 제어 ssDNA를 녹인다. 각각 100 % 및 80 % 겔을 형성하기 위해 10 : 6 (L2 SA1 : SA2) 제 10의 비율로 중합 용액보기 SA....
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결과
우리의 연구에 앞서, 세포 ECM 상호 호환 생체 물질은 정적 또는 동적 비가역 단방향 기판 상에 관찰되었다. 이 기판은 정확하게 세포 미세 환경의 동적 특성을 반영하지 않습니다. 우리의 작업은 연화에 세포 ECM 상호 작용을 공부하고 동적 생체 재료를 보강하기위한 더 많은 생리 학적 모델을 제공함으로써 기존의 기술 패러다임을 이동합니다. 이전 연구에서, 우리는 이러한 젤에 다양한 세포 모폴로지 및 표현형을 조사하여 세포에 동적 기판의 효과를 분석 하였다. 일 예시에서는, 동적 DNA 젤에 섬유 모세포 형태를 평가함으로써, 섬유 아세포에 기판의 보강 효과를 판정. L929 세포, 마우스 유래의 섬유 아세포 세포주는 80 %와 100 %의 겔 (도 3) (11) 상에 도금 하였다. 이틀 후 도금, 20 % 추가 L2 액 가교 100 % (80 → 100 %, 센터 패널 젤 완고 80 % 겔에 첨가 하였다 매체). 백퍼센트 젤 80 % 젤의 또 다른 정적 (오른쪽과 왼쪽 패널 각각.......
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토론
DNA 겔의 능력은 연화 시키거나 세포 접착 그들에게 세포 기능의 동적 강성 조직의 역할을 연구하는 이상적인 모델을 만든다 전후 완고. 세가지 설계는 기계적 및 생물학적 연구에 사용되었다. 그러나, 모든 세 개의 디자인 가교 길이는 DNA 겔 탄성 (표 2)에 영향을주지 않는 나타내는 각종 비율로 가교 유사한 탄력성이있다. 대조적으로, 아크릴 아마이드 농도는 탄성에 영향을 미친다. 이러한 디자인은 겔 붕괴 경향 때문에 가교 반응 속도에 따라 다를 수 있고, 또는 젤의 경향 미디어 또는 버퍼에 용해, 가교 결합의 길이가 증가함에 따라 감소한다. DNA 젤에 그러나 운동 정보는 제한되어 있지만, 우리는 가교의 추가 30 % 이일 50 %의 DNA 젤 11 L2 전달 후 발생 알고있다. 그럼에도 불구하고, 겔 연화 경직에서 팽창과 수축의 힘의 발생을 각각 분리하고 피할 수 없다18,21. 더 많은 에너지가 ssDNA를 18 세 스탠드 사이의 결.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
저자는 감사의 말씀을 프랭크 박사 지앙 박사 데이비드 린 박사 버나드 Yurke 박사 우다이 Chippada을 DNA 겔 기술을 개발에 대한 자신의 기여에 대한; 박사 노넬 Hadzimichalis, SMIT 샤 킴벌리 피터 맨, 자신의 의견이 원고의 편집 로버트 Arter; 척수에 뉴저지위원회 연구 (그랜트 # 07A-019-SCR1, NAL)와 뉴저지 신경 과학 연구소 (MLP)을 포함하여 자금 출처; 및 조직 공학 출판사, 부품이 권한은 그림 3을 다시 인쇄 할 수있는 권한에 대한 그림 2와 그림 4와 생체 재료를 다시 인쇄 할 수.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ssDNA | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com | ssDNA를 소용돌이치지 마십시오. 바이알 및/또는 피펫 용액을 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. | |
| 칼슘과 마그네슘 | 모든 브랜드. | ||
| 100x Tris-EDTA 완충액 (TE 완충액) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com | T9285 | |
| 10x Tris-Borate-EDTA 완충액 (TBE 완충액) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | 93290 | TBE는 생식 독소입니다. |
| 40% 아크릴아마이드 용액 | Fisher Scientific(펜실베이니아주 피츠버그 | BP14021 | 아크릴아마이드는 독소입니다. |
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| 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) | 시그마-알드리치(St. Loius, MO) | T9281 | TE 완충액에 20% 용액을 준비합니다. TEMED는 가연성, 부식성 및 독소입니다. |
| 직경 12mm 원형 커버 글라스 | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com | 12-545-82 | |
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| Sulfo-SANPAH | ProteoChem 또는 Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com 또는 thermofisher.com | C111 또는 22589 | 사용 직전에 물에 0.315mg/ml 용액을 준비합니다. 37 °에서 용해; C와 여과기는 살균합니다. 필터에서 용해되지 않은 sulfo-SANPAH가 관찰되는 것은 정상입니다. Sulfo-SANPAH는 빛에 민감하므로 자외선에 노출될 때까지 빛으로부터 보호해야 합니다. |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | P6407 | 물에 0.2 mg/ml 용액을 준비하고 여과하여 살균합니다. |
| Collagen Type I | Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com | 13813 | 0.2 N 아세트산에 0.2 mg/ml 용액을 준비합니다. 용액은 중합을 피하기 위해 항상 차갑게 유지되어야 합니다. 아세트산은 가연성, 독성 및 부식성입니다. |
| 22 x 60 커버 유리 | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 12-544-G | |
| Positive-displacement pipette | Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com | F148504 | |
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| 질소 가스 | GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/ | NI 5.0UH-R |
참고문헌
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
- Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A.
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재인쇄 및 허가
