인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

요약

직접 인체 조직에서 암 줄기 세포 (암줄 기세포)의 분리는 생물학적 특성 분석을위한 필수입니다. 또한 어려운 단계를 문제 해결에 대한 팁을 제공하면서이 원고는, 인간의 조직에서 전립선 암줄 기세포의 분리를위한 방법을 설명합니다.

초록

암 줄기 세포 (CSC) 모델은 상당히 지난 20 년간 재 방문하고있다. 이 시간 동안 암줄 기세포를 확인하고 직접 고립 된 인간의 조직에서 순차적으로 일반적으로 유동 세포 계측법에 의해 세포와 분별의 모집단의 항체 라벨링을 통해, 면역 결핍 쥐에 전파되었다. 그러나, 전립선 암의 유일한 임상 적 특징은 상당히 신선한 인간 종양 샘플에서 전립선 CSC 추가의 연구를 한정 하였다. 우리는 최근 자신의 HLA 클래스 I (HLAI) 음성 표현형의 미덕에 의해 직접 인체 조직에서 전립선 암줄 기세포의 분리를보고했다. 전립선 암 세포는 수술 표본에서 수확 기계적으로 분해된다. 세포 현탁액은 생성과 형광 복합 HLAI과 기질 항체가 표시되어 있습니다. HLAI 부정적인 세포의 모집단은 마지막으로 유동 세포 계수기를 사용하여 격리됩니다. 이 프로토콜의 주요 제한은 자주 현미경 및 다 초점 본성전립선 절제 표본의 기본 암. 그럼에도 불구하고, 고립 된 라이브 전립선 암줄 기세포는 면역 결핍 마우스에 이식하여 분자 특성 및 기능 검증에 적합하다.

서론

종양 내 이질 암 ^(1)의 특징으로 간주됩니다. 실제로, 종양 내 이성의 몇 가지 메커니즘이 유전자 변이와 미세 환경과의 상호 작용을 포함하여 기술되었다. 또한, 일부 암은 직렬 이식 분석 ^2-5 종양 개시 용량과 자기 갱신의 특성을 나타내는 암 줄기 세포 (암줄 기세포)의 모집단으로 셀룰러 계층 구조를 포함 할 수있다. 초기에 혈액 ^6, 유방 ⁷ 뇌 ⁸ 악성 종양에 설명, 암줄 기세포는 전립선 암 ^9-12뿐만 아니라 다른 종양 유형 ^2-5에서 연구되고있다.

암줄 기세포는 일반적으로 이종 인구 ^2-5 내에서 세포 부분으로 간주됩니다. 따라서 암줄 기세포의 기능 및 분자 특성은 대량 집단에서 자신의 농축에 달려있다. 따라서, 지난 20 년간 여러 가지 사항이 충족CSC 농축 hodologies는 일반적으로 유동 세포 계측법에 의해 표시 인구의 분리를 포함하는 고안되었다. 또한, 암줄 기세포의 연구에 중요한 고려 사항은 인체 조직의 계층 적 조직 등의 문화 또는 면역 결핍 생쥐의 일련 계대으로 실험 조작에 의해 중단 될 수 있다는 것이다. 그 결과, 인간의 조직으로부터의 직접적인 CSC ....

프로토콜

1. 수확 및 수술 표본에서 인간의 전립선 암 조직의 처리

1. 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 1640 배지 15 ㎖를 50 ㎖이 함유 폴리스티렌 원추형 튜브를 준비한다.
2. 병리학 서비스 담당자가 프로토콜을 승인 한 기관 심사위원회에서 각각 전립선 및 완화 수술 표본에서 기본 및 전이성 전립선 암 샘플을, 수확. 전이성 샘플 차 수술 중 림프절 해부에서 얻을 수 있습니다, 다른 사람의 사이에서 하나의 전이성 병변의 진단 제거, 동안 고식적 수술 척수 압축 해제 등의 절차, 폐 동안 척추.
   1. 단계 1.1에서 첫 번째 50 ML의 폴리스티렌 원뿔 관에 임상 진단을 위해 필요하지 초과 대량 조직을 수확, 4 ℃에서 바로 저장 harvesteD 조직은 적어도 지역 4 ~ 5 ^㎠의 두께에서 1-2 cm를 측정해야한다.
3. 연구소 직원은 세포 현탁액의 조직 학적 검사와 세대를위한 준비에 병리 서비스에서 얻은 대량 조직을 처리합니다.
   1. 대량 조직의 처리는 최대한의 세포 생존을 보장하기 위해 수술 적 절제에서 24 시간을 초과 할 수 없습니다.
   2. 멸균 메스와 집게와 생물 안전 캐비닛에서....

결과

그림 1. 인간의 전립선 암 종양의 수확과 인간 전립선 암의 특정 집단을 설명 줄거리 유동 세포 계측법. (A) 종양 결절 세포 현탁액을 생성하기 위해 수확. 처리 된 샘플의 종양의 콘텐츠는 종래의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 이용하여 확인된다. DAPI에 대해 긍정적으로 염색 (B) 세포는 생존 세포를 분리 제외됩니다. (C) HLAI 음성 게이트 제어 isotypic IgG의 ₁ κ-FITC와의 IgG _2A κ-PE 항체로 염색 된 세포를 기반으로 작성됩니다. HLAI .......

토론

이 프로토콜은 신선한 인간의 전립선 암 조직에서 암줄 기세포의 분리에 대해 설명합니다. 몇 가지 중요한 고려 사항은이 프로토콜의 성공적인 결과에 영향을 미친다.

가능한 전립선 암 세포의 높은 숫자의 회복 수술 견본 조심 총 평가에 의존한다. 거시적 종양 결절이 관찰 ^10을 처리 할 때 우리의 경험에서, 종양 형성 전립선 세포의 성공적인 분리가 가장 확실하다.

그러나, 전립선 표본에서 파생 된 요즘 차 질환은 자주 다 초점 현미경입니다. 이러한 경우에, 가능한 시료 처리가 수확 전립선 암 세포의 가능성을 증가시키기 위해 이전 임상 생검 결과로 통지되어야 할 때. 잘 훈련 된 실험실 직원이 배수에서 전립선 암줄 기세포의 성공적인 분리를 보장하기 위해 자주 프로토콜을 수행하기 위해 우리의 경험, 그것은 필요가있다iple 임상 전립선 샘플.

우리는 여기에 세포 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI	Gibco Life Technologies	11875-093
태아 소 혈청	Gibco Life Technologies	10437-028
페니실린 스트렙토마이신	Gibco Life Technologies	15140-122
PBS	Corning Cell Gro	21-031-CM
60 mm, 15 mm 세포 배양 접시	Corning	3295
35 & 마이크로; m 세포 여과기	BD Falcon	352340
50ml 원뿔형 튜브	Crystalgen	23-2263
15ml 원뿔형 튜브	Crystalgen	23-2265
적혈구 용해 완충액	Sigma	R7757
HLA 클래스 I (W6 / 32) PE 항체	Abcam	ab43545
CD31 FITC 항체	eBioscience	11-0319-42
CD45 FITC 항체	Abcam	ab27287
IgG2aκ PE 항체	BD Pharminogen	555574
IgG1κ FITC 항체	BD Pharminogen	551954
DAPI	Invitrogen	d3571
셀 스트레이너 캡이 있는 12mm x 75mm 폴리스티렌 튜브	BD Falcon	352235
Vortex Mixer	Crystalgen	CG-BV1000
10% 중성 버퍼 포르말린	Fisher	RBBP-0480