합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

Summary

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

Abstract

이차원 전기 영동 (2DE)는 잠재적으로 다른 생리적 또는 병리 적 조건과 관련 프로테옴 수정 사항을 발견 할 수있는 강력한 도구입니다. 기본적으로,이 기술은 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 제 1 단계에서 그들의 등전점에 따라 단백질을 분리하고, 둘째 그 분자량에 따른에 기초한다. 이 보고서에서 인간의 사후와 마우스 뇌 조직의 작은 금액에 대한 최적화 된 샘플 준비 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 두 개의 차원 형광 차이 겔 전기 영동 (2D-DIGE) 미니 2DE의 면역 블롯을 수행 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식의 조합은 하나의 질량 분석 검출과의 호환성 발현 덕분에 새로운 단백질 및 / 또는 단백질의 변형을 찾을뿐만 아니라 수 있지만, 또한 마커 검증에 새로운 통찰력. 따라서, 미니 2DE은 포스트를 확인하고 검증하기 위해 서부 블로 팅 허가에 결합번역 후 수정, 단백질 이화 작용과 다른 조건 및 / 또는 치료 사이에 질적 인 비교를 제공합니다. 여기서, 우리는 아밀로이드 - 베타 펩티드와 알파 synuclein으로 AD와의 Lewy 몸 치매에있는 단백질 집합체의 구성 요소를 공부하는 방법을 제공한다. 우리의 방법은 이와 같이 프로테옴의 분석을 위해 적응 될 수 불용성 단백질은 인간의 뇌 조직 및 마우스 모델에서 추출한다. 병렬에서는 퇴행성 신경 질환뿐만 아니라 잠재적 인 새로운 바이오 마커 및 치료 표적에 관련된 분자 및 세포 경로의 연구를위한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다.

Introduction

정신 및 신경 장애는 질병의 글로벌 부담의 13 %를 나타냅니다, 병태 생리 학적 메커니즘, 위험 요소 및 구성 (prodromal) 바이오 마커와 같은 새로운 도전 ¹ 탐구해야합니다. 이 목적에 부합하는, 인간의 뇌의 단백질 체학 연구는 생리에 대한뿐만 아니라 병적 인 조건뿐만 아니라 메모리, 행동, 감정과 예를 들어 신경 세포의 가소성, 같은 프로세스에 관련된 분자 경로를 발견하기 위해 필수가됩니다. 따라서, 동물 모델의 사용 및보다 구체적으로 형질 전환 마우스는 인간의 신경 퇴행성 질환의 ^병인이 모방하는 광범위한 가능성을 가져온다.

프로테오믹스 방법은 신경 과학 분야에서 이러한 새로운 관점을 달성하기 위해 요즘 사용할 수 있습니다. 이차원 전기 영동 (2DE)는 시료의 넓은 범위의 프로테옴을 비교할 수 유력한 것으로 간단한 방법이다. 또한,도식별하기 위해 복잡한 혼합물로부터 단백질을 분리하고 추가로 질량 분석법에 의해 분석하기위한 강력한 방법. (IEF)을 isoelectrofocusing하여 자신의 등전점 (PI)에 따라 1) 단백질의 분리 :이 기술은 기본적으로 두 개의 연속적인 단계로 구성되어 있습니다. 보다 정확하게는, 전위의 pH 구배 구비 immobiline 아크릴 아미드 스트립을 가....

Protocol

1. 균질화 및 인간과 쥐의 뇌 조직에서 총 단백질 추출

1. 뇌 조직 균질화. (인간의 샘플) 도공 유리 또는 (쥐 샘플) 테플론 균질화를 사용하여 뇌 조직의 10 % (W / V) 8 M 요소에, 2 M 티오 및 W / V SDS 버퍼 (UTS) 1 % 균질화한다. 60 Hz에서 전체 조직의 분해 ^{(13, 14)에} 0.5 초를 적용하는 초음파 발생기 (30) 펄스에서 초음파 처리.
   1. 표준으로 BSA를 사용하여, 브래드 포드 분석과 단백질 농도를 결정합니다. 이 버퍼 추출만큼 해물이 의해 carbamylation ^(15)을 방지하기 위해 가열 오버하지 않기 때문에 하나의 차원 SDS-PAGE와 완전히 호환되는 UTS.
   2. 1 %를 추가 (W / V) 앰버의 실온에서 10 분 동안 부드러운 혼합으로 품어. 그 후 0.22 μm의 주사기 필터로 필터링하고 마지막 요소 / 티오 우레아 용액에 SDS를 추가합니다. 이 단계는 equilibr에 요산 및 이소시 산의 양을 감소시킨다솔루션의 요소와 IUM 및 분해를 촉진한다.
2. 클로로포름 / 메탄올 단백질 침전. (독립적으로 IEF를 수행하기 위해 선택한 pH 범위에) 18 센티미터 사람을 위해 11cm IPG 스트립과 1.5 밀리그램....

Results

제공된 이상적인 버퍼 단백질의 100 %, 특히 막 - 연관 또는 세포 골격 단백질을 복구하기 위해 존재하지 않기 때문에 뇌 조직에 프로테오믹스 도전 남아있다. 실험의 첫 번째 세트는 단백질의 대형 패널을 복구 할 수 있도록 두 개의 접근법과 호환 적합한 용해 버퍼의 검색에 집중 하였다. 따라서, 세 용해 버퍼는 가장 적절한 하나를 결정하기 위해 분석 하였다. 첫째, 그것은 1 %와 10 밀리미터 (W / V) SDS (그림 1A)에서 공통의 생화학 및 분자 생물학 버퍼 트리스 - 염산 ^(20)를 사용 하였다. 또한, 트리스 - 염산은 폴리 아크릴 아미드 및 아가 로스 젤에 대한 전기 영동 버퍼와 같은 강력한 응용 프로그램이 있습니다. 다른 두 용해 버퍼는 UTS (그림 1B)와 2DE 하나 있었다. 트리스 SDS는 가난한 해상도를 얻을 수 및 지점의 수는 상당히 높은 자리 분리, 아니 distorsion과 FA UTS, 관찰 프로파일과의 비교 <.......

Discussion

단백질의 병리학 적 발현 변화를 발견, 생체에 대한 검색 및 약물 표적에 대한 잠재적 인 경로의 변조 neuroproteomics의 목적 중입니다 ^(30)에 접근한다. 새로운 도구 가운데, 2DE 필드는 유망한 expectative을 추가합니다. 그럼에도 불구하고, 합의 변동을 최소화하고 실험의 재현성을 높이기 위해 도달되어야한다. 이 아이디어의 라인에서 2D-DIGE (그림 2)와 모노 차원 면역 블롯과 완벽하게 호환 인간과 생쥐의 뇌 조직에 대한 후속 2DE의 면역 블롯 (그림 3)을 수행하는 표준화 된 프로토콜은 여기에 대한 상세한 설명되어 있습니다.

단백질 체학에서 가장 큰 딜레마 중 하나는 가용화 버퍼 선택입니다. 그것이 IEF 완전히 호환 때문에 다른 접근법들 사이의 재현성을 높이기 위해, UTS가 선택되었다. 또한, UTS 추출 완충액은 PELLE를 산출하지t 또는 12,000 XG에.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Reference pH 간격/크기
IPG 버퍼 기능, pH X-X	GE Healtcare		Reference 원하는 pH 간격
기능 AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1	GE Healtcare	551797N
드라이스트립 커버 유체 IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	수동 재수화를 위한 플라스틱 상자
MILLEX GS 필터	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)	Bio-Rad		Reference in the MW의 기능에서
IPGphor III 등전 초점 장치	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix 대형 전기영동 시스템	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm	젤 컴퍼니	P2D1.5