3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

마이그레이션 및 개인 또는 집단 세포의 침윤 암의 두 가지 특징입니다, 암세포 ^1-4의 전이성 확산에 필요합니다. 전이를 개시하는 암 세포의 능력은 이주 및 세포의 기저막을 저하 invadopodia를 사용하여 인접 조직으로 침입하는 그들의 능력에 달려있다. Invadopodia 행렬 분해하는 프로 테아 제 ^5의 출시를 통해 세포 외 기질의 분해를 가능하게 동적 말라 풍부한 매트릭스 분해 돌출부이다. 암 세포 침윤은 암 세포의 이주 다음 행렬의 저하를 수반하고이를 3 차원 (3D) ^행렬이 환경의 재구성을 수반한다. 따라서, 매트릭스를 통해 침투, 세포는 그 모양을 변형하고, 세포 외 기질 (ECM) ^2와 상호 작용해야합니다.

유방 조직의 무결성을 유지 단단히 관제사,에 따라 달라집니다세포-ECM과 세포 - 세포 접착 접합 유전자 발현 및 상피 극성의 중단에 영향을 미치는 때문에 D 조직 구조는 암 ^6-10의 발병으로 이어질 수 있습니다. 그러나, 트랜스 웰 챔버 분석이나 상처 스크래치 분석 등 대부분의 생체 외 마이그레이션 및 침입 분석은 2 차원 (2D)이며, 따라서 이러한 세포와 그 인접 환경 ^3,6,8,11-14 사이의 복잡한 상호 작용을 무시. 세포 형태의 변화, 세포 분화, 세포 매트릭스 유착과 유전자 발현 패턴을 포함하여 상당한 형태 학적 및 기능적 다양성은 일반적으로 ^2,6,8,11을 분석 차원에서 부족한 3D 배양 세포를 배양하여 검출되었다. 따라서, 진료소 ^6-10에 기초 연구에서 획기적인 연구 결과의 더 나은 번역을 선도, 3D 분석의 생체 내 조건에서 더 많은 생리를 recapitulating에 크게 도움이됩니다 사용합니다. 그러나, 주목해야, 3 차원 배양을 이용하여 얻은 많은 장점에도 불구하고,이 모델은 다양한 세포 유형을 포함 생체 내 종양 미세 환경의 복잡성 모두를 캡처 할 수있다. 그러나, 3D 모델로 간질 세포를 포함 할 수있다 (예를 들어, 섬유 아세포, 백혈구 및 대 식세포) 암 세포 부착 및 침윤 ^15-17에서 종양 - 기질 상호 작용의 효과를 연구한다.

이러한 라미닌 및 콜라겐 ECM 단백질이있을 때 문화의 유방 상피 세포가 가장 효율적으로 성장한다. 이 알려진으로, 상업적으로 이용 가능한 매트릭스 혼합물 Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 쥐의 종양에서 파생되어 리겔 기저막 매트릭스 ^2,8로 알려져있다. 기술의 수는 기저막 매트릭스 ^2,8 차원의 식민지로 상피 세포 성장하기 위해 설립되었다. 3D 기저막 행렬 모델은 악성 및 비 악성 둘 유방암 세포를 확립하기위한 효과적인성장, 생체 내 환경 ^{(18, 19)에서} 발생되는 것을 닮은. MCF10A 세포는 비 악성 유방 상피 세포이다. 기저막 매트릭스에서 성장하는 경우, 이들 세포는 정상적인 유방 세포의 생체 내 특성의 전시 및 세포 증식, 세포 편광 및 루멘 공간 ^8,12,20을 확립 아폽토시스를 조절 겪는다. 또한, 3 차원 배양을 형성 MCF10A 꽈리 세포의 세포 핵의 외관은 더 가깝게 조직 유선 상피 세포들 ^(21)에서 단층 배양에 비해 유사. 비셀 및 동료에 의해 연구는 악성 세포가 매우 무질서 표현형을 표시하기 때문에, 라미닌이 풍부한 환경에서 성장 확산을 증가, 감소하면 악성 유방 세포가 아닌 악성 유방 세포에서 분화 될 수 있다는 것을 나타 내기 위해 최초로 세포 - 투 - 세포 부착, 증가 간충직 마커의 발현 및 침입 구조 수의 증가는 ^{3,6,2 형성된}2.

셀 환경의 이상이 종양 형성 ^{(20)에 영향을} 미칠 수있다. 3D 배양법 효과적으로 종양 세포와 그 주변 환경 사이에서 발생하는 통신을 연구하는 방법과이 단백질의 발현에 영향 같은 통신 ^{14,20,21,23를} 결정하는데 사용될 수있다. 이 ^{문서에서는,} 침입을 분석하는 3 차원의 문화에서 MDA-MB-231 유방암 세포 성장을, 그리고 상피 마커 라미닌, 세포 기저막 ^18,19,24의 구성 요소를 사용하여 상피 형태의 손실을 연구하는 자세한 방법을 제공합니다 ^25. 자세한 절차는 정확하고 재현성있는 침습성 암 세포에 의해 방사상 (침습) 구조의 형성을 정량화하고 MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 또는 T47D 같은 일반적인 유방암 세포주 (에 제한되지 않는 기능을 제공한다 ). 따라서,이 분석은 방법으로 단백질의 세포에서 발현 또는 치료를 평가하기위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다 프로 또는 안티 -침략 화합물은 하나 또는 여러 개의 세포, 세포 외 기질의 분해를 조절한다.

지하 막 매트릭스에있는 유방암 세포의 1. 입체 문화 (매립 기술)

1. 취급 리겔 기저막 매트릭스 : 4 ℃에서 하룻밤 얼음 해동 기저막 매트릭스는 저온에서 액체이지만, 실온에서 고체화. 얼음 (그림 1A-B)에 지하 막 매트릭스를 유지합니다.
2. 나선형 패턴 (그림 1C)에서 P-200 Pipetman의 끝 부분을 사용하여 확산 매트릭스에 의한 기저막 행렬의 50 μL와 공 초점 1 번 유리 바닥 접시를 커버. 기포의 형성을 피하기 위하여 기저막 매트릭스 확산 때는주의. 마찬가지로, 메 니스 커스의 형성을 방지하기 위해 유리 바닥 접시의 테두리에 닫 행렬을 확산하지 마십시오. 미숙 한 처리 기저막 행렬은, 다음 얼음에있을 수 있습니다 요리, P-200 Pipetman과 피펫을 예비 냉각하는 경우 (또는 4 ° C에서 냉장고에 하룻밤 왼쪽). 이 단계 제공응고하기 전에 지하 막 매트릭스를 확산하기위한 추가 시간. (그림 1D)를 응고 기저막 행렬을 사용하려면 적어도 30 분 (5 % CO _2와 37 ° C에서) 세포 배양 인큐베이터에서 접시 (들)를 놓습니다.
3. 행렬이 응고가 진행되는 동안, 세포의 70 ~ 80 % 년 합류 100 mm 플레이트를 Trypsinize. 세포는 플레이트의 리프트 오프 시작한 후에 트립신 (도 1E)를 불 활성화, 10 % (v / v) 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 RPMI 1640 배지 10 ㎖에서 그들을 재현 탁. 그런 다음 15 ML 원뿔 관 (그림 1 층)에 재현 탁 세포를 전송합니다.
4. 전용 세포 배양 원심 분리기 (그림 1G-H)의 3 분 100 XG에서 (원뿔 튜브에 존재) 세포를 스핀.
5. 세포가 아래로 회전하는 동안, 1 ML의 microcentrifuge 관 (참고로 나누어지는 행렬의 50 μl를 각 유리 바닥 요리는 하나의 microcentrifuge 관을 할당, 따라서, 경우실험은 3 접시를 필요로 다음)는 3 마이크로 원심 튜브뿐만 아니라 필요한 것을 다음, 다음 얼음 (그림 1B)에 튜브를 배치합니다.
6. (그림 1I) 방해받지 펠렛을 떠나는 동안, 단계 1.4에서 원뿔 튜브에서 매체를 대기음. 를 Resuspend 세포는 FBS 첨가 된 RPMI 배지 (그림 1J) 1 ㎖에 (아래로 회전되어 있는지).
7. 세포를 마이크로 원심 튜브에 혈구 (도 1K), 또는 세포 입자 계수기 분취 액 2.5 × ¹⁰⁴ 세포를 사용하여 계산하고 50 μL (도 1L)의 총 부피를 얻도록 적절한 매체를 사용하여 그 위에되면.
8. 1:1 비율의 단계 1.5 매트릭스 함유 microcentrifuge 관으로 단계 1.7 (50 μL에서 25,000 세포)에서 세포를 혼합; 최종 부피는 100 μL (그림 1M)입니다.
9. 의에 단계 1.8에서 세포 혼합물을 부드럽게 매트릭스의 100 μl를 접시단계 1.2 (그림 1N)에서 olidified 기저막 매트릭스 코팅 접시. 세포 기저막 매트릭스에 내장 될 수 있도록이를 허용한다.
10. (5 % CO _2와 37 ° C에서) 세포 배양 인큐베이터에 접시 (들)를 전송하고 매트릭스 수 : 세포의 혼합물은 적어도 30 분 동안 응고.
11. 매트릭스는 일단 : 세포 혼합물을 응고, 접시 (그림 -10)에 FBS 첨가 된 RPMI 매체의 2 ㎖를 추가하고 실험 (그림 1 P)의 나머지 저장 될 인큐베이터를 접시를 철회.
12. (분석 필요에 따라 또는, MDA-MB-231 세포에 대한 분석의 기간은 길이 5 일) 오일의 기간 동안 매일 미디어를 변경합니다.
13. 광학 현미경을 사용하여, 미분 간섭 대비 지하 막 매트릭스 (그림 3A)에 현탁 MDA-MB-231 식민지의 (DIC) 이미지를 가지고. 이미지 20 대표 지역 10X 목적에서 하루에 한 번오일은 식민지 형태 형성 (그림 3C)을 결정하는 데 필요한 권한입니다.
14. 세포 식민지 별 모양의 형성 (그림 3B)를 결정하기 위해 맹목적으로 이미지를 분석합니다. 콜로니 셀 타원체에서 하나 이상의 돌출부가 인식되는 경우에 방사상으로 간주된다. 침략 별 모양의 식민지의 비율을 결정하는 인수 이미지 당 세포 식민지의 총 개수로 별 모양의 식민지의 수를 분할 한 다음 매일 20 개의 이미지의 별 모양의 식민지 비율을 평균.

도 1. 기저막 매트릭스 (매립 기술)에서 MDA-MB-231 유방암 세포의 3 차원 배양을. AB) 흄 후드에서 수행 된 실험 장치 () 코팅 유리 바닥 요리. C) 우물의 개략도기저막 행렬의 50 μl를 적어도 30 분 동안 응고 행렬을 허용하기 위해 5 % CO _2)와 37 ° C에서 (세포 배양 인큐베이터에 배치. D) 접시 (들)와 함께. E) 세포를 트립신. F에게 ) 세포는 원뿔 튜브에 존재. GH) 세포 ()가 조직 문화 원심 분리기에서 3 분 100 XG에 스핀 다운 된 15 ML 원뿔 관에 재현 탁 하였다. I) 세포 펠렛 스핀 다운되었습니다. J) 세포 () FBS 보충 된 RPMI 배지 1 ㎖ 중에 재현 탁 하였다. K) 세포는 혈구. L을 이용하여 계산 하였다) 마이크로 원심 관에 분주하고 50 ㎕의 총 부피를 얻도록 적절한 매체를 사용하여 얹어 2.5 × ¹⁰⁴ 세포. M ) 1:1 비율의 단계 1.5 매트릭스 함유 microcentrifuge 관과 단계 1.7 (50 μL에서 25,000 세포)에서 세포를 혼합; 최종 부피는 100 μ 될 것입니다.. 세포 혼합물을 응고에 FBS 첨가 된 RPMI 매체의 2 ㎖를 추가 행렬이되면) 단계 1.2에서 응고 매트릭스 코팅 접시 O에 8 단계에서 세포 혼합물 :; L N)을 조심스럽게 매트릭스의 100 μl를 접시 요리. P)은 실험의 나머지 저장 될 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.

면역 형광와 3D 문화의 형태 형성의 특징 2. 시험

1. 접시 (들)를 복용하기 전에 (그림 2A), 80 % 메탄올 (정착액 솔루션), 3 % 소 혈청 알부민 (차단 솔루션 BSA) : 얼음 트레이, 차가운 인산 완충 용액 (PBS), 20 % 아세톤을 설정 인큐베이터에서.
2. 얼음 트레이와 대기음 미디어의 요리 (들)를 배치하고 차가운 PBS 2 ㎖ (그림 2B)와 3 배를 세척한다.
3. 마지막 PBS 세척이 흡입되면, 20 % 아세톤 2 ㎖를 추가 요리 (들) (그림 2C에 80 % 메탄올 용액 (그림 2D)에서 20 분 동안 세포를 고정합니다.
4. 고정의 20 분이 종료되면, 상온에서 음식을 다시 가져 정착액을 대기음, 이후 PBS로 3 회 세척한다. 최종 PBS 세척을 흡입하면, 실내 온도 (그림 2E)에 적어도 30 분 동안 차단 요리 (들)에 3 % BSA 2 ㎖를 추가합니다.
5. 블로킹주기 동안 차단 완충액 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 용해 된 (적절한 희석) 차 (라미닌의 V 1:100) 및 이차 항체의 희석액을 제조. 세포 혼합물 : 'BSA + 차 항체'솔루션 μL 400 ~ 500 행렬에 직접 추가해야합니다 유의하십시오.
6. 차단의 30 분이 만료되면, 기본 항체를 추가하고 실내 온도 (그림 2 층)에서 적어도 1 시간 동안 배양한다. 더 PBS 세척은 30 분 렸네 다음 수행되지 않도록주의하시기 바랍니다G 기간.
7. 2.6 단계가 완료되면, 'BSA + 차 항체'솔루션을 제거하고, PBS로 3 회 세척한다.
8. 직접 행렬에 (적절한 희석) 3 % ​​BSA에 용해 차 항체를 추가 세포 혼합물, 요리를 커버하고 실내 온도 (그림 2G)에서 1 시간 동안 배양한다.
9. 'BSA + 이차 항체'솔루션을 제거하고 PBS로 3 회 세척한다.
10. 핵 염색을 위해 PBS에 용해 훽스트 33258 (1:10,000) 2 ㎖를 추가하고, 알루미늄 호일에서 5 분 동안 품어 (또는 광표백을 제한하는 불투명 한 용기 커버) (그림 2H).
11. 헥스의 3만3천2백58톤와 배양의 5 분이 만료 한 후, PBS로 (들) 배를 접시를 씻으십시오.
12. 직접 행렬에 설치 매체를 추가 공 초점 접시에 세포 혼합물 기저막 마트에서 식민지의 무결성에 어떤 혼란을 유도 방지하기 위해주의 깊게 유리 커버 슬립 커버X : 세포 혼합물 (그림 2I).
13. 요리 (들)은 실내 온도 (그림 2I)에서 하룻밤 (또는 24 시간)을 건조 할 수 있습니다. 일단 건조, 요리 (들)은 -20 ° C에 저장 될 수 있지만, 그것은 매우 그들은 가능​​한 한 빨리 군데 것이 좋습니다.
14. (그림 3D-E) 사용하는 항체의 적절한 레이저 파장 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득.

면역에 의해 3D 문화의 그림 2. 시험. .) 실험 장치의 개략도 B) 접시 (들) 얼음 지대에 놓인 미디어는 흡입; .이어서 세포를 냉 PBS 2 ㎖ C) 2 ㎖의 20 % 아세톤으로 3 회 세척 하였다 :. 80 % 메탄올 용액 D)을 위해 세포를 수정 접시 (ES)에 첨가4 ° C에서 (어느 얼음에, 또는 냉장고에서) 20 분. E)은 3 % BSA의 2 ㎖를 실온에서 적어도 30 분 동안 차단 요리 (들)에 추가됩니다. F) 30 분의 일단 차단이 만료, 기본 항체를 추가하고 실온에서 1 시간 이상 동안 품어 G)는 () 적절한 희석에 3 % BSA에 용해 차 항체는 기저막 행렬에 직접 추가되었습니다. 세포 혼합물; .이어서 요리 덮고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션 H) 훽스트 2 ㎖ (1:10,000; PBS에 용해) 알루미늄 호일하에 5 분 동안 인큐베이션 dishe (ES) 세포에 첨가 I) 실장 배지에 직접 첨가. 매트릭스에 : 공 초점 접시와 접시에 세포 혼합물을 유리 커버 슬립으로 덮여있다. 접시 (들)은 실온에서 하룻밤 (또는 24 시간)을 건조 왼쪽.

3D 행렬에 침입하는 MDA-MB-231 세포의 예는도 3C에 도시되어있다. 세포는 매트릭스 (1 일)에 포함하고, 3 일에 의해 침략 (별 모양) 구조를 형성하기 시작하고, 완전 5 일 (그림 3C)에 의해 매트릭스에 침투하고 있습니다. 형성 성상 식민지의 수는 계산하고, (침습적 및 비 침습적) 접시 당 콜로니의 총 수의 백분율로 표시됩니다. 측정이 5 일 동안 매일 수행하고 있기 때문에 또한, 침략의 속도도 평가 될 수있다.

형태 발생 이벤트의 타임 라인을 설정하면 이러한 분석에 많은 매개 변수를 테스트 할 수있는 기초를 제공한다. 예를 들어, 유방암 세포는 세포 골격 재 배열을 촉진 할 수 항암 약물 또는 약물로 치료 될 수 있으며, 침입에 대한 이들 약물의 효과는 비자극 세포 및 차량 (24)을 제어에 비해, 확인 될 수있다. 선택적으로, 유방의 용량은 수침습 돌기를 형성 CER 세포 유전자 RNA 간섭 (예컨대 shRNA를 같은)를 사용 18,24,25 잠재적 종양 유전자 또는 억제 유전자 발현을 표현하는 세포를 수정에 정량화 될 수있다.

실험 도구로서 3D 세포 배양을 사용하는 주요 이점은 세포 형태 학적 변화 도중 중요한 신호 분자의 공간적 시간적 특징을 조사 할 수있는 기능이다. 면역 형광 염색을 이용하여,이 분자의 발현 육안 3D 배양 이내에 검출 될 수있다. 그림 3E에서, 우리는 멤브레인 무결성 및 지하 막 단백질 라미닌의 V (24)의 확산 현지화의 손실을 표시하는 MDA-MB-231 세포의 대표 침략 (성상) 식민지를 보여줍니다. 유방암 세포에서 관찰되는 것과 대조적으로, 라미닌의 V는 치료되지 않은 악성 MCF10A 세포의 유방 선포 세포 (그림을 둘러싸는 그대로 기저막 층에 현지화 된3E) 24.

그림 3. 이미지 수집 및 대표 이미지의 그림입니다. A) 현미경으로 촬영 한 사진. B) 미분 간섭 대비 (DIC) 촬상 현미경 이미지를 얻기 위해 사용이어서 이미지 (회 촬영에 대한 MDA-MB-231 세포의 이미지 분석 소프트웨어. C) 샘플 대표 DIC 이미지를 사용하여 분석 오일)가 표시됩니다. 일원 분산 분석은 Dunnett의 여러 비교 테스트 다음 : * P <0.05. 형광 현미경을 사용하여 스케일 바, 100 μm의. D) 이미지 수집. E) MDA-MB-231의 라미닌의 V 현지화 (5 일 동안 성장) 12 일 동안 성장 MCF10A 세포 ()을 묘사하는 샘플 면역 이미지가 표시됩니다. 스케일 바, 20 μm의.

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