이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.
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방법 논문
3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화
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이 논문에서
요약
초록
그것은 지금 잘 세포 및 조직 미세 종양의 개시 및 진행에 영향을 미치는 중요한 규제 것으로 알려져있다. 또한, 세포 외 기질 (ECM)는 생체 내에서의 문화와 항상성에있는 세포 행동의 중요한 조절기로 입증되었습니다. 이차원 (2D)에서 세포를 배양의 현재의 접근 방식, 그리고 그들의 세포 미세 환경 간의 복잡한 상호 작용의 교란 및 손실 플라스틱 표면 결과. 3 차원 (3D) 배양 분석의 사용을 통해, 세포 미세 환경 상호 작용을위한 조건은 생체 내 미세 환경을 닮은 확립된다. 이 문서는 주변 환경에 세포 침략의 평가에 3D 문화의 가능성을 예시, 3D 지하 막 단백질 매트릭스에서 유방암 세포를 성장하기위한 세부 방법론을 제공합니다. 또, 이러한 3D 분석법은 molec 신호의 손실을 검사 할 가능성이있는 방법을 논의절차를 면역 염색에서 상피 형태를 조절 ules. 이러한 연구는 유방암의 확산에 필요한 침입을 조절 공정에 중요한 기계적 세부 사항을 확인하는 데 도움.
서론
마이그레이션 및 개인 또는 집단 세포의 침윤 암의 두 가지 특징입니다, 암세포 1-4의 전이성 확산에 필요합니다. 전이를 개시하는 암 세포의 능력은 이주 및 세포의 기저막을 저하 invadopodia를 사용하여 인접 조직으로 침입하는 그들의 능력에 달려있다. Invadopodia 행렬 분해하는 프로 테아 제 5의 출시를 통해 세포 외 기질의 분해를 가능하게 동적 말라 풍부한 매트릭스 분해 돌출부이다. 암 세포 침윤은 암 세포의 이주 다음 행렬의 저하를 수반하고이를 3 차원 (3D) 행렬이 환경의 재구성을 수반한다. 따라서, 매트릭스를 통해 침투, 세포는 그 모양을 변형하고, 세포 외 기질 (ECM) 2와 상호 작용해야합니다.
유방 조직의 무결성을 유지 단단히 관제사,에 따라 달라집니다세포-ECM과 세포 - 세포 접착 접합 유전자 발현 및 상피 극성의 중단에 영향을 미치는 때문에 D 조직 구조는 암 6-10의 발병으로 이어질 수 있습니다. 그러나, 트랜스 웰 챔버 분석이나 상처 스크래치 분석 등 대부분의 생체 외 마이그레이션 및 침입 분석은 2 차원 (2D)이며, 따라서 이러한 세포와 그 인접 환경 3,6,8,11-14....
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프로토콜
지하 막 매트릭스에있는 유방암 세포의 1. 입체 문화 (매립 기술)
- 취급 리겔 기저막 매트릭스 : 4 ℃에서 하룻밤 얼음 해동 기저막 매트릭스는 저온에서 액체이지만, 실온에서 고체화. 얼음 (그림 1A-B)에 지하 막 매트릭스를 유지합니다.
- 나선형 패턴 (그림 1C)에서 P-200 Pipetman의 끝 부분을 사용하여 확산 매트릭스에 의한 기저막 행렬의 50 μL와 공 초점 1 번 유리 바닥 접시를 커버. 기포의 형성을 피하기 위하여 기저막 매트릭스 확산 때는주의. 마찬가지로, 메 니스 커스의 형성을 방지하기 위해 유리 바닥 접시의 테두리에 닫 행렬을 확산하지 마십시오. 미숙 한 처리 기저막 행렬은, 다음 얼음에있을 수 있습니다 요리, P-200 Pipetman과 피펫을 예비 냉각하는 경우 (또는 4 ° C에서 냉장고에 하룻밤 왼쪽). 이 단계 제공응고하기 전에 지하 막 매트릭스를 확산하기위한 추가 시간. (그림 1D)를 응고 기저막 행렬을 사용하려면 적어도 30 분 (5 % CO 2와 37 ° C에서) 세포 배양 인큐베이터에서 접시 (들)를 놓습니다.
- 행렬이 응고가 진행되는 동안, 세포의 70 ~ 80 % 년 합류 100 m....
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결과
3D 행렬에 침입하는 MDA-MB-231 세포의 예는도 3C에 도시되어있다. 세포는 매트릭스 (1 일)에 포함하고, 3 일에 의해 침략 (별 모양) 구조를 형성하기 시작하고, 완전 5 일 (그림 3C)에 의해 매트릭스에 침투하고 있습니다. 형성 성상 식민지의 수는 계산하고, (침습적 및 비 침습적) 접시 당 콜로니의 총 수의 백분율로 표시됩니다. 측정이 5 일 동안 매일 수행하고 있기 때문에 또한, 침략의 속도도 평가 될 수있다.
형태 발생 이벤트의 타임 라인을 설정하면 이러한 분석에 많은 매개 변수를 테스트 할 수있는 기초를 제공한다. 예를 들어, 유방암 세포는 세포 골격 재 배열을 촉진 할 수 항암 약물 또는 약물로 치료 될 수 있으며, 침입에 대한 이들 약물의 효과는 비자극 세포 및 차량 (24)을 제어에 비해, 확인 될 수있다. 선택적으로, 유방의 용량은 수침습 돌기를 형성 CER 세포 유.......
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토론
3D 세포 배양 기술의 개발은 연구자주세요 극적인 형태 학적 변화를 시각화 할 수 있도록, 유방 상피 세포의 변화를 연구 할 수있다. 세포 침윤을 분석 외에, 단일 또는 다세포 유방 상피 세포 접착 상체는, 증식, 크기 및 기저 혀끝 극성의 변화를 평가하기 위해 사용될 수있다. 세포가 ECM (8)과 겹쳐있다 이전에보고 된 방법과는 대조적으로, 우리의 방법은 정량 할 다 방향 침입을 허용 ECM 18,19,24있는 세포를 포함합니다. 이러한 혁신적인 3D 문화 모델은 연구자가 기존의 트랜스 웰 챔버 침공 분석을 사용하여, 단일 층의 세포를 연구 할 때 할 수 없습니다 표현형의 변화를 연구 할 수 있습니다. 세포 콜로니의 촛점 면역 분석과 함께 모두 생화학 및 약리학 적 전략의 혼입을 통해 3D 모델 자르하는 능력을 촉진했다Y는 더 정교하고 세부 사항을 형태 학적 변화를 분석 할 수 있습니다. 이 기술은 따라서 암의 시작과 발전에 영향을 미치는 메커니즘에 대한 우리의 이해를 발전했다있다. .......
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공개 사항
우리는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research, CIHR) 보조금 MOP 107972의 M.B. 기금으로 수행되었습니다. M.B.는 CIHR New Investigator Salary Award를 수상했습니다. D.C.는 Translational Breast Cancer Research Unit 및 CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program의 장학금을 받았습니다. C.G.는 Translational Breast Cancer Research Unit의 장학금을 받았습니다. 런던 지역 암 프로그램 및 CIHR- 암 연구 및 기술 이전에 대한 전략 교육 프로그램. SGD입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml 튜브 | VWR | CA10011-700 | 멸균, 일회용 |
| 100-mm 배양 접시 BD353003 | VWR | CABD353003 | 멸균, 일회용 |
| 15 ml 팔콘 튜브 | VWR | CA21008-918 | 멸균, 일회용 |
| 1 ml 여과 팁 | VWR | 10011-350 | 멸균, 일회용 |
| 200 μ l 여과된 끝 | VWR | 22234-016 | 메마른, 처분할 수 있는 |
| 20 μ l 필터링 팁 | VWR | 22234-008 | 멸균, 일회용 |
| 35mm 유리 바닥 Confocal No.1 문화 접시 | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | 사용 전 사전 냉각 |
| , 소 혈청 알부민 (BSA) | BioShop | ALB003.100 | 3%로 사용 |
| ; A11029 | 1:250 for IF | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1,200 IF |
| 안티-베타-카테닌 | BD Transduction Laboratories | 610153 | 마우스-단클론성; IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | 10% (v/v)에서 사용 |
| Hoechst 33258, 펜타하이드레이트 (비스-벤즈이미드) - 10 mg⁄ | 0.1%(1:10,000 희석)에서 사용되는 | Life Technologies | H3569 |
| InVivo 분석기 제품군 | 미디어 사이버네틱스는 | 3D 문화 이미징에 사용됩니다 (10X 및 40X에서 DIC 이미지) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | 100 nM 에서 사용됩니다; |
| 안티 라미닌 | Cedarlane | AB19012(CH) | 토끼-polyclonal 전장 인간; IF |
| LSM-510 META 레이저 스캐닝 현미경 | Zeiss | 63X 대물렌즈에서 사용됨; 오일 이멀젼 렌즈 | |
| Matrigel 페놀 레드 프리 (BD356237) | VWR | CACB356237 | 로트 번호: 2180819; 10.4 mg/ml |
| Olympus IX-81 현미경 | Olympus | 3D 배양 이미징에 사용(10X 및 40X에서 DIC 이미지) | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 항생제(배지에 첨가, 0.01%에서 사용) |
| 10 ml 피펫 | VWR | CA53300-523 | 함유 멸균, 일회용 |
| RPMI 1640 배지 | MDA-MB-231 세포 | ||
| 배양에 사용0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | MDA-MB-231 세포를 트립신화하는 데 사용 |
| MEGM (총알 키트): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | MCF10A 세포 배양에 사용 |
참고문헌
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., ....
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재인쇄 및 허가
