에 대한 간단한 라이트 시트 현미경 설정 토토에서 이미징 C. 엘레 개발

요약

이 프로토콜은 가벼운 시트 현미경의 설치 및 C의 생체 내 이미징을위한 그것의 구현에 대해 설명합니다 엘레 배아.

초록

빠른 속도와 낮은 광독성 이미징 기술은 토토의 유기체의 발달을 연구하는 전제 조건이다. 세포 내 해상도로 3D 영상을 제공하면서 빛 시트 기반 현미경, 사진 표백 및 공 초점 현미경에 비해 광독성 효과를 감소시킨다. 여기에 우리가 직립 현미경과 빛 시트의 생성을위한 광 - 기계 요소의 작은 집합으로 구성되어 가벼운 시트 기반의 현미경의 설정을 제시한다. 이 프로토콜은, 빌드 현미경을 정렬하고 빛 시트의 특성을하는 방법에 대해 설명합니다. 또, C. TOTO의 이미징에 대한 방법을 구현하는 방법을 상세 elegans의 간단한 관찰 챔버를 이용하여 배아. 이 방법은 개발의 몇 시간 이상 3D 두 색상 시간 경과 영화를 캡처 할 수 있습니다. 이 기능은 장시간 세포의 모양, 세포 분열 및 태그 단백질의 추적을 용이하게한다.

서론

유기체의 형성과 형성 세포의 움직임, 세포 모양의 변화, 세포 분열과 세포 분화를 포함한다. 이러한 프로세스의 진행과 조정을 이해하는 세 가지 차원으로 기능과 세포 내 해상도와 빠른 이미징 도구가 필요합니다. 이러한 생체 내 이미징 기능과 기술 사이, 빛 시트 조명 현미경은 단일 / 선택적 비행기 조명 현미경이라고 저 광독성 효과 및 ^1,2 낮은 photobleaching에 생산의 고유 한 장점이있다.

시트 조명 현미경에서 시료를 광학 단면 처리를 행하는 광 시트에 의해 측으로부터 조명된다. 조명 경로와 검출 경로는 서로 수직 및 광 시트는 검출 대물 렌즈의 물체 초점면과 일치하도록 정렬된다. 샘플은 두 경로의 교차점에 배치된다ND 3D 이미징을 허용하도록 검출 축을 따라 이동 될 수있다. 또한 남은 평면은 조명되고,이 평면의 모든 포인트가 동시에 검출된다. 이것은 상당히 수집 속도를 증가시키고 공 초점 현미경 ^(3)에 비해 광표백뿐만 아니라 광독성을 감소시킨다.

이 차원 화상에 대해, 제공된 스캔 탐지 부분은 없으며, 조명 부분은 어느 것도 필요하지 않다; : 실용 시트 조명 현미경 설정 및 정렬하기 쉬운 기능 구획으로 광 시야 기술로서, 3 차원 화상은 샘플을 잡고 스테이지의 하나의 축 이동에 의해 얻어 질 수있다.

여기에서 우리는 C의 토토 영상에 대한 간단한 빛 시트 현미경과 그 구현의 설정까지 제시 elegans의 배아. C. 엘레 배아 잘 생체 IMA 살고 적합투명도로 인해 ging를, 불변의 혈통과 셀에 박힌 ^4,5를 배치합니다. 개발 된 광 시트 설치가 검출을위한 표준 직립 현미경을 기반으로합니다. 아래에 제시 프로토콜을 구축하고 정렬 여기 모듈 / 경로, 테스트 및 빛 시트의 특성과 3D 영상의 샘플을 장착하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 또한 형광 마커를 표현하는 다양한 균주의 설정과 획득 시간 경과 영화의 예를 제공합니다.

프로토콜

1. 빛 시트 및 검색 경로 설정

그림 1은 광 설치의 일반적인 방식을 제공합니다.

1. 광학 테이블에 현미경과 레이저를 삽입하고 고정합니다.
2. 레이저에게 488 nm의, 561 nm의 해당 이색 거울이 405 nm의 결합. 다이크로 익 미러 후, 레이저 공동 정확하게 정렬되어야한다. 레이저 파장, 다이크로 익 미러, 광학 필터의 선택은 실험에 사용 된 특정 형광 라벨의 흡수 스펙트럼으로부터 결정되는 것에주의.
3. 음향 광학 파장 가변 필터 (AOTF)를 놓습니다. AOTF의 주파수 및 전력을 조정하는 공급자 테스트 용지를 사용한다. 잘 맞춰지면 내 PowerMeter 의해 측정, 레이저 파워의 약 90 %의 최대 조정에 전송된다. AOTF 불필요한 만들 수있는 몇 가지 레이저가 완전히 소프트웨어에 의해 제어 할 수 있습니다.
4. 배치 및 수정망원경. 망원경은 같거나 조명 대물 렌즈의 배면 개구의 직경보다 큰 폭으로 확장 된 빔을 2 개의 렌즈로 구성되어 있습니다. 최소 초점 거리를 가진 렌즈가 먼저 와야한다.
5. 장소, 정렬하고 가까운 원통형 렌즈의 뒷면 구멍에 위쪽으로 광학 경로를 데리고 잠망경을 고정합니다. 잠망경의 두 개의 거울은 장축이 완전히 확장 된 빔을 반영하기 위해 미러의 경사에 누워있다 방식으로 장착되어 있습니다.
6. 다음 잠망경 출구 원통형 렌즈를 놓습니다. 원통형 렌즈가 한 방향으로 상기 빔을 포커스하고 그에 광 시트를 형성하는 다른 방향으로 평행 나뭇잎 유의.
7. 조명 대물 렌즈를 사용하여 얻어진 광 시트를 집중할. 조명 대물의 이미지 초점이 검출 목적의 물체 초점 포인트와 일치한다는 것을주의한다. 빔 프로젝트긴 거리에서 화면 (예 : 벽)에 대한 것입니다. 빛 시트의 화면 날카로운 윤곽을 얻기 위해 조명 빔의 축을 따라 조명의 목적을 이동합니다.
8. 현미경 (큐브)에서 예약 된 장소에서 쿼드 라인 (405/488/561/638) 방출 필터를 놓습니다.
9. 현미경 출력 포트에 EMCCD 카메라를 놓습니다.
10. 현미경 단계에 드릴 구멍에 나사에 의해 현미경 무대에서 첫 번째 매뉴얼 번역의 단계를 수정. 이동 스테이지의 에지가 큐벳이 검출 대물 렌즈 아래를 중심으로되도록 멀리 현미경 스테이지의 중심으로부터 약 2 ㎝에 배치되어야합니다.
11. 첫 번째 두 번째 매뉴얼 번역 단계를 수정. 두 단계의 방향 (X 및 Y 번역) 수직해야합니다.
12. 앞의 두 단계의 상단에있는 Z 압전 단계를 수정. 동력 스테이지 대신 압전 스테이지 사용될 수 있음을주의한다.
13. 큐벳 holde 수정R 스테이지의 상부에 (도 2 참조). 큐벳 따라서 조명 경로의 교차점과 서로 직각이 검출 경로에 배치 될 것이다.

2. 라이트 시트 확인

1. 형광 용액을 유리 큐벳을 가득 채운 두 개의 광 경로의 교차점에 샘플 홀더에 놓습니다. 빛 시트는 이렇게 볼 수 있습니다. 이는 수평이어야하고, 대칭 / 검출 대물 렌즈 중심에 대하여.
2. 원통형 렌즈를 제거하고 광 시트의 두께를 측정하기 위해 화상을 취득. 광 시트의 두께는 조명 대물 렌즈 (NA에 대해 3-4 = 0.3 μM)의 개구 수 (NA)에 의존한다는 것을주의한다. 관련 렌즈 것을 유의 광 시트의 두께는, 슬릿 배면 개구들이 빔의 크기를 감소시킴으로써 증가 될 수있다. 형광 마이크로 스피어는 AX를 측정하는데 사용될 수 있음을 유의현미경의 원점이라 횡 해상도.
3. 실험을 시작하기 전에 원통형 렌즈를 다시 넣습니다.

3. C.의 실장 엘레 태아

다음 단계는 (그림 3)됩니다.

1. 10 × 20 ​​× 1 ㎜의 유리 슬라이드의 조각을 잘라 다이아몬드 마킹 펜을 사용합니다.
2. 5 % 박토 - 한천을 준비 60 ℃에서 물에 데쳐 및 히터 블록에서 그것을 유지
3. 슬라이드의 절단 된 부분의 한면에 폴리-L-라이신의 50 μl를 추가, 건조시켜야합니다.
4. 벤치에 현미경 슬라이드를 삽입하고 고정합니다.
5. 고정 슬라이드와 슬라이드의 절단 된 부분을 나란히하고 상단에 녹은 한천의 드롭을 추가합니다. 얇은 한천 패드를 얻기 위해 다른 깨끗한 현미경 슬라이드를 사용하여 한천을 꽉.
6. 한천 패드 상단 슬라이드를 제거하기 전에 건조하도록 허용합니다.
7. 약 3mm 오의 과잉을 남겨하기 위해 고정 된 슬라이드의 측면에있는 한천 패드를 잘라F 한천 부드럽게 고정 슬라이드를 제거합니다.
8. 한천에 폴리-L-라이신의 50 μL를 추가하고 완전히 건조 보자.
9. 시계 유리에 M9 매체에 임신하는 벌레를 넣습니다.
10. 배아를 해제하는 메스와 외음부의 수준에서 벌레를 잘라.
11. 양안에서 관심 단계에서 배아를 식별하고 미세 모세관 피펫을 사용하여 그들을 수집.
12. 슬라이드의 절단 된 부분에서 돌출 폴리-L-라이신 코팅 한천의 부분에 배아를 놓습니다. 바로 옆에 슬라이드의 경계에 배아를 놓습니다. 그들은 충분히 안정하지 않기 때문에 한천의 국경에서 배아를 배치하지 마십시오. 배아는 폴리-L-라이신 층에 붙어 있도록 조심스럽게 액체를 제거합니다.
13. 빠르게 건조를 방지하기 위해 배아를 맞 춥니 다.
14. 플라스틱 페트리 접시에 잘라 슬라이드를 삽입하고 부드럽게 슬라이드를 커버하는 M9 배지를 추가합니다.
15. 계란이 여전히 한천에 붙어있는 양안에서 확인하십시오.

C. 4. 기록 엘레 개발

1. 샘플 홀더의 이전 준비 (컷 슬라이드, 한천 플러스 배아를) 수정하고 큐벳에 배치합니다. 그림 4는 수제 홀더를 설명하고 그림 5는 관측 맥락에서 큐벳의보기를 보여줍니다.
2. 압전 무대에 큐벳을 수정.
3. 시야 조명 태아의 위치를​​ 확인합니다.
4. AOTF, 카메라와 압전 단계를 제어하는​​ 집에서 만든 소프트웨어를 시작합니다. 이러한 마이크로 매니저와 같은 무료 소프트웨어는, 또한 사용할 수 있습니다.
5. 레이저 라인 및 전력 (AOTF)를 선택합니다.
6. 원통형 렌즈 및 조명용 렌즈를지지하는 세 방향으로 스테이지를 사용하여 광 시트의 위치를​​ 조정한다. 밝은 신호를 얻기 위해 가로 방향 (X)에 따라 단계를 이동합니다. 일을 구하는 다음 광 시트의 Z 위치 및 길이 방향의 위치 (Y)를 조정노이즈 비율 전자 최상의 신호. 빛 시트 초점의 위치가 빛의 경로 길이의 차이를 해결하기 위해 하나의 배아에서 다른 조정해야 할 수도 있습니다.
7. 타임 랩스 영상을 획득하기 위해, 두 이미지뿐만 아니라, 취득되는 화상의 수와 레이저 파워 사이의 시간을 얻는, 노출 시간을 선택한다. 2 컬러 수집을 위해, 두 번째 레이저 라인을 선택합니다. 두 가지 색상 이​​미지를 연속적으로 획득된다.
8. AZ 스택을 획득하려면, 또한 두 조각 사이의 거리, 및 시작과 압전체의 위치를​​ 종료를 선택한다.

결과

세 가지 다른 C.로부터 3 3D 시간 경과 기록 실험 엘레 균주는 상술 광 시트 현미경 설정을 사용하여 획득 될 수있는 데이터의 종류를 나타낸다. 우리는 이러한 조건에서 배아 SPIM 이미징 C.에서만 광독성 낮은 수준의 원인을 나타내는 이전 보고서와 일치, 정상 속도로 개발하고 영상 살아남을 것을 확인 엘레 ^{6,7 배아.}

첫 번째 변형 GFP (; stIs10024 zuIs178)에 융합 히스톤을 표현한다. 기록마다 37 초 촬영 20 조각 (조각 1 μm의 사이의 거리)의 더미를 가진 2 시간 동안 실시 하였다. 6가 서로 다른 시점에서 스택의 한면을 보여줍니다 그림. 두 interphasic 핵 (화살표)과 농축 유사 분열 염색질 (화살표 머리)를 명확하게 볼 수 있습니다.

두 번째 변형 GFP (ruIs57)에 융합 튜 불린과 히스톤을 표현mCherry (; stIs10226 itIs37)에 융합. 기록마다 105 초 촬영 20 조각 (조각 1 μm의 사이의 거리)의 스택과 함께 16 분 동안 수행 하였다. 7 스택과 다른 시점의 서로 다른면을 보여줍니다 그림. 관련 영화 1 표시 3 연속 시점에서 복원을 3D로. 분열 동안, 유사 분열 스핀들 (그린) 및 응축 염색체 (레드) 깨끗이 발달 동안 세포 분열 방향의 추적을 허용하는 표시이다.

세 번째 변형 GFP (pwIs23)에 융합 아포 지단백 VIT-2를 표현하고 mCherry (ltIs44) 바인딩 막. 기록이 매 30 초 촬영 10 조각 (조각 1 μm의 사이의 거리)의 스택과 함께 25 분 동안 수행 하였다. 8 스택과 다른 시점의 서로 다른면을 보여줍니다 그림. 세포 내에서 노른자 지방 단백질 입자 (녹색)의 빠른 이동을 쉽게 할 수 있습니다다음.

그림 1 : 조명 및 검출 장치, 전면과 바닥 전체로 구성 SPIM 광 설치. 조명 유닛에서는, 다이크로 익 미러에 의해 결합 된 레이저는 각각 독립적으로, 레이저의 파워를 제어 AOTF를 입력한다. 이어서, 망원경은 4 배에 의해 빔의 크기를 증가시키고, 잠망경 현미경의 높이로 가져온다. 원통형 렌즈는 조명 목적으로 재 집중되는 광 시트를 형성한다. 검출부는 직립 현미경에 통합되어 있으며, 주로 검출 렌즈, 필터, 튜브 렌즈와 EMCCD 의해 구성된다. 샘플은 조명 및 검출 경로 사이의 교차점에 위치된다. 압전 단계 수있는 샘플의 수직 (Z) 변위3D 획득을위한.

그림 2. 큐벳 홀더 홀더는 3 알루미늄 플레이트로 구성되어 있으며, 압전 무대에 나사 결합된다. 유리 베트는 (빨간색) 스프링에 의해 유지된다.

그림 3 : C. 실장 프로토콜 SPIM의 실험 elegans의 배아. 유리의 절단 된 부분은 폴리-L-라이신으로 코팅되어 있습니다. 한천의 패드는 코팅 표면 상에 위치된다. 폴리-L-라이신은 다음 한천 패드에 추가됩니다. 마지막으로, C. 엘레 배아는 폴리-L-라이신 코팅 한천 패드에 정렬됩니다.

그림 4 : 샘플 홀더. 홀더 유리 큐벳의 내부 크기에 적합하다. (빨간색) 두 개의 스프링 (그림 3 참조) 유리 슬라이드를 개최합니다. 이 홀더는 다음 유리 큐벳 안에 넣을 수 있습니다.

도 5 :... 샘플 홀더가 관찰 컨텍스트에서 배아 프로토콜이도 3에 요약에 따른 유리 슬라이드에 고정화 슬라이드가도 4에 설명 된 샘플 홀더에 의해 유지되는 샘플 홀더 유리 큐벳에 삽입되어, 그림 2에 설명 된 홀더에 의해 개최. 빛 시트는 내가 수평 및측면에서 배아를 lluminates. 피검 렌즈를 샘플 위에 수직이다.

그림 6 : C.의 기록 히스톤 :: GFP 융합을 표현 elegans의 배아 유전자 변형 배아의 단일 평면 이미지 히스톤 :: GFP 융합 (zuIs178; stIs10024) 표현하는 서로 다른 시간 지점에서를 3D 시간 경과 기록에서 추출한 이미지 :.. 20 조각 (만든 스택 조각 1 μm의 사이의 거리); 조각 당 노출 시간 : 30 밀리 초; 스택 사이의 시간 간격 : 37 초; 총 수집 시간 : 2 시간. 화살표 : interphasic 핵, 화살표 머리 : 응축 유사 분열 염색질. t = 0 분에서 배아는 2 세포 단계에 있으며, 정상 발달의에서 예상대로 t에서 = 120 분 배아는 70 셀이(하나의 평면에 포함 된 유일한 세포가 배아의 모든 세포가 아닌 그림에서 볼 수 있으며주의) 오줌. 조명의 전력 (조명 목적의 출구에서 측정) 488 nm에서 30 μW했다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7 : C.의 기록 엘레의 튜 블린 :: GFP 융합을 표현 배아와 히스톤 :: mCherry 융합. C.의 3D 시간 경과 기록에서 추출한 이미지 튜 블린 :: GFP 융합 (ruIs57)와 히스톤 :: mCherry 융합 (; stIs10226 itIs37)을 표현 elegans의 배아. 촬영 조건 : 조각 1 ~ 20 조각 (거리의 스택의 인수μm의) 모든 105 초; 총 수집 시간 : 16 분; 노출 시간 : 각 채널에 대해 200 밀리 초. 패널은 동일한 스택의 10 조각을 보여줍니다. 패널 B는 동일한 슬라이스마다 210 초를 보여줍니다. 조명의 전력 (조명 목적의 출구에서 측정) 각각 488 및 561 nm의 레이저, 30 μW 300 μW했다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8 : C.의 기록 VIT-2 :: GFP 융합을 표현 elegans의 배아와 C의 3D 시간 경과 기록에서 추출한 막 대상 mCherry. 이미지 엘레 배아 VIT-2 :: GFP 융합을 표현 (PWIS23) 및 막 - 대상 mCherry (ltIs44). 촬영 조건 : 10 조각 (조각 1 μm의 사이의 거리) 매 30 초 스택의 인수; 총 수집 시간 : 25 분; 채널 당 노출 시간 : 200 밀리 초. 패널은 동일한 스택의 제 5 슬라이스를 나타낸다. 패널 B는 동일한 슬라이스마다 30 초를 보여줍니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 C의 생체 내 이미징을위한 빛 시트 현미경의 쉬운 설치를 설명 엘레 배아. 레이저, 빔 익스팬더, 시준 및 초점 렌즈를 포함한 광 시트를 생성하고 정렬하기 위해 필요한 광학 소자는 용이하게 광학 벤치에 장착 될 수있다. 검출 경로와 카메라의 직립 현미경과 조합하여,이 설정에 대한 간단한 솔루션 가벼운 시트 현미경을 제공합니다.

이 형상은 샘플 환경이 간단하게. 살아있는 표본이 개최 위치 및 기계 조각의 작은 집합으로 이동 유리 큐벳에 배치됩니다. 시트 조명 현미경 능력을 가진 절편 넓은 분야의 기술이기 때문에, 단지 하나의 축 동력 이동은 3D 이미징을 위해 요구된다. 이것은 단일 스캔 소자에 동기화 요건을 제한하고, 소프트웨어 개발을 용이하게한다. iSPIM ⁶ 우리의 수직 지오에 비해RY는 검출 용 고 NA 대물 렌즈의 사용을 허용한다. 수평면에서 대물 렌즈와 SPIM 셋업에 비해 샘플의 장착 및 배아의 일련의 이미징은 쉽다. 전부,이 기술의 구현은 간단하고 광학에 약간의 전문 지식을 얻을 수 있습니다. 이것은 더 빠른 속도와 더 감소 광독성하지만 낮은 축 해상도의 단점의 장점과 공 초점 현미경에 싼 대안이다.

우리는 또한 C.를 탑재 할 수있는 쉽고 재현성있는 방법을 개발 이 시스템을 사용하여 생체 내 이미징을위한 엘레 간스의 배아. 설치 절차는 빠르게 (15 분) 일상 실험에 적합합니다. C.에 대한 엘레 영상, 간단한 설치의 장점은 적어도 두 겹이다 : 토토 이미징 (i)는 회전하지 않고 가능하기 때문에 3D 재건은 간단합니다; (II) 샘플 설치가 용이하고 여러 개의 배아는 순차적으로 이미지화 할 수있다같은 슬라이드에. 우리는 세포 분열과 세포 모양의 변화를 관찰 할 수있는 충분한 시간 분해능과 시간 경과 영화의 예를 보여 주었다. C.을 연구하는 빛 시트 현미경의 힘 elegans의 개발도 최근 다른 ^{6, 7, 8에} 의해 설명되었다. 따라서,이 기술은 C.의 형태 형성 및 패터닝을 연구하는 것은 매우 유용 할 것이다 elegans의 배아.

이 시스템은 또한 다른 모델 생물의 발달을 분석하는 데 사용할 수 있습니까? 그것은 인식하는 것이 중요하다되도록 C. 작은 투명 유기체 시트 조명 현미경의 구현 엘레은 Drosophila의 배아와 같은 큰 생물보다 덜 엄격하다. 초파리의 토토 영상에서 일반적으로 회전 및 멀티 뷰 복원 ^{9, 10.} 선상 여기 대물 렌즈와 두 가지 측면에서 흥분도 attenuat에 의한 그림자 효과를 감소 할 수 있습니다 필요합니다빛 ^(11)의 이온. 그러나, 여기에 제시된 설정은 여전히 낮은 표백과 낮은 photoxicity으로, 초파리 배아의 이미지를 한쪽으로 구성된다. 이 설정은 또한 멍게 또는 제브라 피쉬와 같은 이미지를 작은 투명 배아에 도움이 될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SPIM
감지
직립 현미경	ZEISS	Axiophot 1
100x W 대물렌즈 (NA 1.1, W.D. 2.5mm)	NIKON
EMCCD 뒷면 조명	ANDOR	DU-885K-CS0-#VP
조명
LASER 488 nm / 60 mW	TOPTICA	iBeam 스마트
레이저 405 nm / 120 mW	TOPTICA	iBeam 스마트
레이저 561 nm / 500 mW	COBOLT	JIVE 500	타임 랩스 이미징의 경우 50 또는 100mW로 충분합니다
쿼드 라인 레이저 거부 밴드 ZET 405/488/561/638	AHF	F57-405
Dichroic 405	AHF	F38-405
Dichroic 488	SEMROCK	Di01-R488
AOTF	AA	AOTFnC-400.650-TN
미러
렌즈 50mm	THORLABS		망원경 5X
렌즈 200mm	THORLABS		망원경 5X
잠망경	THORLABS	RS99/M
원통형 렌즈 f=100mm	THORLABS	ACY254-100-A
10X NA 0,3	NIKON
xyz 스테이지	NEWPORT
Sample
Bacto Agar	Bectkton Dickinson	214010	5% 물
Poly-L-Lysine 용액	Sigma	P8920
모세관 GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L	Havard Appartus	30-0019
흡인 튜브(구강 피펫)	Dutsher	55005
M9 매체:
KH2PO4 (3g/L)	모든 공급업체
Na2HPO4 (6g/L)	모든 공급업체
NaCL (5g/L)	모든 공급업체
MgSO4 (1 mM 최종)	모든 공급업체
큐벳 홀더	Brice Detailleur가 만든	집에서 만든
Claude Moretti가 만든	샘플 홀더	HOME MADE
x 스테이지	NEWPORT
커버 슬립 50x20x1 mm	MARIENFELD		컷 다음 10x20x1mm
피에조 전기 무대 증폭기 / 컨트롤러	PI	P-622. ZCD / E-625.CR
큐벳 40mmx40mmx10mm	HELLMA	704.002-OG.40 mm- 10mm 높이
의 다이아몬드 포인트 글라스 마킹 연필	VWR
Olivier
C++ (Qt) 홈메이드 소프트웨어			; S, 요청 시 제공됩니다. 대체 솔루션: Micromanager 또는 LabVIEW