체외 배양 시스템은 척추 근육 생성에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다. 그러나, 많은, 특히 기초 분류군, nonmammalian 골격 근육 발달과 성장에 대해 배웠 겠죠. 이 조직, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)의 성체 줄기 세포를 분리하고, 차 문화 속에서 자신의 자기 갱신, 증식 및 분화를 유지하기위한 효율적이고 강력한 프로토콜에 걸쳐 보존 및 분기 규제 메커니즘의 식별 가능 척추 동물의 계통.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
때문에 생체 내에서 근육 조직 프로그램을 공부와 관련된 고유의 어려움과 시간, 골격 근육의 주민 성체 줄기 세포에서 파생 된 주 문화 시스템은 근육 조직 전구 세포 (MPC를)은 포유 동물의 골격 근육 발달에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다 성장. 특히 척추 동물의 기초 분류군 사이에서, 그러나, 데이터는 자기 갱신, 확산 및 MPC와의 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 설명하는 제한됩니다. 특히 관심을 부속 기관 손실 (즉, urodele 양서류) 다음과 같은 상당한 치하의 골격 근섬유 세포의 증식 (즉, 경골 어류) 및 완전 재생을 받아야하는 기초 척추 동물의 능력을 기초 잠재적 인 메커니즘이다. 또한, 배양 된 근육 아세포의 사용은 재생 및 근육 조직 프로그램 재현부와 그들 사이의 차이의 이해를 도울 수있다. 에이 말은, 우리는 세부 사항에 강력하고 효율적인 프로토콜을 설명 (및 유사 안에) 더 많은 시작, 근육 조직 프로그램의 진화를 이해하기위한 플랫폼으로 세포 배양에서, MPC는 그들의 자손, 근원 세포와 미성숙 myotubes을 분리하고 유지 기초 척추 동물. 제브라 피쉬 (다니오 rerio)의 모델 생물의 상태를 대문자로, 우리는 잉어 clade의 Danioninae의 작은 물고기에이 프로토콜의 응용 프로그램에보고합니다. 탠덤,이 프로토콜은 멕시코 Axolotl의 (Ambystomamexicanum)에서도 실험실 설치류에서 MPC를 분리하여 넓은 비교 방법을 실현하는데 사용된다. 이 프로토콜은 현재 널리 무지개 송어, 연어, 도미 1-4 등 여러 물고기 종에 근육 생성을 연구하는 데 사용됩니다.
서론
포유 동물의 근육 생성의 상당한 이해 C2C12 5, 모두 기본 마우스 (뮤스 musculus)의 근 모세포 문화와 잘 설명 마우스 유래 세포주에이 과정의 반복 설을 통해 얻을 수있다. 1950 년대 6 년부터이 문화가 다른 척추 동물의 확장, 근육 생성에 의해, murinemyogenic 프로그램의 이해에 많은 발전을 주도하고있다. 또한, 하나의 세포 근섬유 이식편 기술은 위성 세포와 주변 근섬유 7-9 사이의 상호 작용에 대한 이해를 증가하고있다. 세포 배양은 근육 생성의 조사에 특히 인해 짧은 시간에 전구체로부터 분화 된 세포 10, RNAi를위한 형질의 상대적 용이성 11 ~ 14, 15, 16 및 과발현 형질 전환 연구 14,17,18, 체외에서 생체 이식 18 ~ 20 다음에 확장, 심지어 샘플분류군 (21, 22)에서, 근원 전구 세포와 그 통제 요원의 Arison는. 때문에 문화 시스템의 인공 환경에 차이가 5,23을 설명 하였지만, 이러한 생체 시스템은 다핵의 형성을 지배하는 복잡한 프로그램을 우리의 해부에 필수적인적일 수있다, 말기 차별화 된 myof....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
윤리 문 : 여기에 설명 척추 동물을 포함한 모든 실험은 버밍햄에 위치한 앨라배마 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회의 사전 승인 및 실험 동물 복지, 미국 국립 보건 연구소의 사무실에 의해 설립 된 가이드 라인과 일치했다 보건 복지부.
문화 1. 준비
- (2 L 당 26.96 g 13.48 g / L) 9 mM의 탄산 수소 나트륨 (2 L 당 1.51 g), DMEM에서 20 mM의 HEPES (2 L 당 9.53 g)을 다음과 같이 기본 매체를 준비합니다.
- 산도를 결정하고 염산 또는 수산화 나트륨과 7.40로 조정합니다.
- 삼투압을 결정하고 (필요한 경우) NaCl로 ~ 300 mOsm로 조정합니다.
- 필터는 최대 2 ~ 3 개월 빛으로부터 보호 4 ° C에서 (2) 1 L의 진공 살균 시스템과 저장소를 사용하여 소독.
참고 : 전체 시약 표 1과 표 2를 참조, 도구, consum의당했을 및 장비 정보를 제공합니다.
- 초순수 멸균 물 50 ㎖에 γ-조사 폴리-L-라이신의 5 밀리그램 (> 30 MW)를 용해하여 폴리-L-라이신 처리 접시를 준비합니다. 리신....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
주야 후 파종, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)는 (그림 1A와 1D 참조) 라미닌의 기질에 부착 볼 수 있어야합니다. 파종 후, 세포 (MPC를)이 세포 유형을 나타내는 스핀들 형상 (그림 1)를 채택하고 MyoD1 + (그림 2)이다. 다니오 종에서 MPC는이 앙 코링 및 살모 종 MPC를하는 것보다 작은 바이폴라 프로세스와보다 컴팩트 한 것으로 나타납니다. 그러나, 문화의 네 가지 일 이상은, 검사의 모든 셨나요 종에서 MPC를 비슷한 형태학을 채택하고 근육 아세포처럼 뚜렷하게 볼 (그림 1B 및 1E). 전체 미디어를 제거해야하고, MPC를 세척 매체로 두 번 세척해야한다. 근육 섬유 모세포는 근육 조직 문화를 오염시키고 (근원 세포의 스핀들 모양 대) 자신의 별과 같은 형태로 MPC를 / 아세포에서 쉽게 구별 할 수 있습니다. 플레이트의 세척 크게 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
근육 조직이 프로그램은, 어느 검사 종, 가장 쉽게 체외 시스템을 통해 공부하실 수 있습니다. 사실, 격리에, 근원 성 전구 세포 (MPC를) 생선이나 포유류의 myosatellite 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 쉽게 증식, 세포주기 취소 될 수 있으며, 근육 아세포의 단말 차별화 및 초기 myotubes에 그 근원 세포의 융합을 포함하는이 규제가 심한 과정을 입력합니다. (제브라 피쉬 (67) 및 무지개 송어 (69)의 가능한 예외) 셨나요 종의 형질 전환 유전자 기자 균주의 일반적인 부족은 MPC / MSC 활성화, 증식, 분화의 생체 활동에 제약, 따라서 여기에 제시된 시험 관내 시스템입니다 물고기 종의 연구를위한 매력적인 플랫폼입니다.
MPC / 중간 엽 줄기 세포에 상관없이 종의 성공적인 문화 불임에 대한) 엄격한주의에 크게 의존; 골격 근육 t의 b)는 철저하게 기계적인 분리문.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
공개 아무것도 없다.
감사의 글
저자는 Drs에 많은 감사를하고 싶습니다. 작은 물고기와 양서류이 문화 프로토콜의 개발과 응용 프로그램에서 자신의 전문 지식에 대한 호셉 Planas와 후안 카스티요. 덕분에, 때문에 끊임없이 마태, Delci 크리스텐슨, 재커리 파울러, 브룩 프란 젠, 나단 프뢰 리히, 키라 마샬 충전 등 많은 물고기 (종 및 숫자 모두)에서 근육 조직의 박리와 해리에 지원 한 수많은 개인도 있습니다 벤 마이어, 이단 Remily 및 Sinibaldo 로메로. 이 작품은 생물 창업 자금 버밍엄학과, 프로테아제 연구 NIH 그랜트 # 2P20 RR015566, NIH NIAMS 그랜트 # R03AR055350 센터에서 알라바마 대학의 지원 및 PRB에 NDSU 사전 FORWARD NSF 그랜트 # HRD-0811239했다. 지원도 UAB 영양 비만 연구 센터 수상 # 1 P30DK056336, NIH NIDDK에 의해 제공되었다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 그 필요는 없습니다NIH의 공식 견해를 나타냅니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 표 1. 상세 시약 정보 | |||
| 시약 | 회사(선호 v. 대체) | 카탈로그 번호(선호 v. 대체) | 배양당 수량 |
| &감마;-조사 폴리-L-라이신 | 시그마-알드리치(MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5mg |
| DMEM(고포도당) | 시그마-알드리치(cellgro) | MT-50-003-PB(D7777) | 2 L |
| 라미닌 | BD Biosciences ( Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg |
| 중탄산나트륨 (NaHCO3) | Fisher Scientific (시그마-알드리치) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g |
| HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (시그마-알드리치) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g |
| 항생제/항진균제 | Thermo Scientific (시그마-알드리치) | SV3007901 (A5955) | 17-20 mL |
| 황산 | 겐타마이신Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 mL |
| 기증자 말 혈청 | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL |
| 소 태아 혈청 | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL |
| 콜라겐 분해 효소 (IV형) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g |
| 트립신 (췌장에서 추출) | MP 생물 의학 (시그마-알드리치) | ICN15357125 (T5266) | 1 g |
| 표 2. 소모품, 도구 및 장비 | |||
| 소모품 | 도구 | 장비 | |
| 세포 배양 플레이트 | 겸자 (거친) | 혈청학적 피펫터 | |
| 멸균 50 mL 원뿔형 튜브 | 겸자 (미세) | pH 측정기 | |
| 실험실 테이프 | 메스 핸들 | 냉각 인큐베이터 (Echotherm) | |
| 0.2 μ m 진공 살균 시스템 | 메스 블레이드 (# 10, # 11) | 층류 후드 | |
| 발수 오토 클레이브 종이 | 수술 가위 | 진공 매니 폴드 | |
| 혈청 학적 피펫 | 유리 페트리 접시 | 미세삼투압 측정기 | |
| 12-16 G 캐뉼라 Luer Locks | |||
| 표 3. 세포 배양 플레이트 코팅을 위한 최적화된 용량 | |||
| 웰당 플레이트 크기 | cm^2 폴리 | -L-라이신* | 라미닌** |
| 6 웰 | 9.5 | 1.6 mL | 1 |
| 24 웰 | 1.9 | 0.32 | 0.2 |
| 48 웰 | 0.95 | 0.16 | 0.1 96 |
| 웰 | 0.32 | 0.06 | 0.03 |
| *0.1 mg/mL 농도 | ** 0.020 mg/mL 농도 | ||
| 표 4. 분리, 해리 및 배양용 배지 | |||
| 시약 | 분리 | 세척 | 해리 |
| 베이스 배지 | 419.25 mL | 395.40 mL | 297.00 mL |
| 겐타마이신 설페이트** | 0.75 mL | 0.60 mL | - |
| 기증자 말 혈청 | 75.00 mL | - | - |
| 소 태아 혈청*** | - | - | - |
| * PSF : 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 곰팡이 존 칵테일 (100x); ** 50 mg/mL 농도; 특성화 | |||
| 표 5. 권장 희석 및 도금 용량 | |||
| 플레이트 크기 | cm^2 웰당 | 희석 | 도금 볼륨 |
| 6 웰 | 9.5 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 1 mL |
| 24 well | 1.9 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 250 μ L |
| 48 웰 | 0.95 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 150 μ L |
| 96 웰 | 0.32 | 1.5-2.0x10^6 cells/mL | 50-100 μ L |
| 표 6. g 조직당 평균 세포 | |||
| 수 종 | 평균 # 세포/g 조직 | ||
| Danio rerio | 6,400,000 | ||
| Danio dangila | 1,783,000 | ||
| Devario aequipinnatus | 1,797,000 | ||
| Oncorhynchus mykiss | 66,800 | ||
| 표 7. 권장 배양 온도 | |||
| 종 | 온도 | ||
| Danio/ Devario spp. | 26 - 28 &도; C | ||
| Oncorhynchus/Salmo spp. | 10* - 18 &도; C | ||
| Ambystoma mexicanum | 18° C | ||
| * 낮은 온도는 더 낮은 확산 속도를 지원합니다. |
참고문헌
- Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
- Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
