방법 논문

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

DOI:

10.3791/51358

⸱

2014년 5월 27일

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Field of Biochemistry, and Molecular Cell Biology, Cornell University

이 논문에서

요약

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대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

초록

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대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 그러나, 현재의 플랫폼은 노동 집약적 샘플 준비, 낮은 검출 한계, 느린 검색 속도, 각 대사 산물에 대한 집중적 인 방법의 최적화 및 긍정적를 모두 측정 할 수 없다는 단일 실험에서 음으로 하전 된 이온과 같은 다른 제한 요인을 보유하고 있습니다. 따라서, 새로운 대사 프로토콜은 대사 체학 연구를 앞당길 수있다. 아미드 계 친수성 ​​크로마토 그래피는 화학 유도체없이 극성 대사 산물 분석을 가능하게한다. Q-Exactive (QE-MS)를 사용하여 고해상도 MS는 이온 광학 향상된 스캔 속도 (해상도 70,000 256 밀리 초)을 증가하고, 양 / 음 전환을 수행하는 기능을 가지고있다. 냉 메탄올 추출 전략을 사용하고, QE-MS와 아미드 열을 결합하는 동시에 추가 기능의 168 대상 극성 대사 물질 및 수천의 강력한 탐지 할 수 있습니다. DAT가공이 매우 효율적인 방식으로 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어로 수행되고, 질량 스펙트럼에서 추출 불명의 특징 데이터베이스에 쿼리 할 수​​있다.

서론

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동시에 여러 대사 산물을 측정하는 실험으로 정의 대사는 강렬한 관심의 영역이었다. 대사는 분자 생리학의 직접 판독을 제공하고 암 1-4으로 개발 및 질병에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 핵 자기 공명 (NMR) 및 가스 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (GC-MS)은 가장 일반적으로 사용되는 악기 5-9들이다. NMR, 특히 13 C라는 대사 무거운 동위 원소 표지 화합물, 이후 플럭스 실험에 사용 된 10, 11 NMR 활동이다. 그러나,이 전략은 대사에서 해당 응용 프로그램을 제한하는, 상대적으로 높은 샘플의 순도와 큰 샘플의 양을 필요로한다. 한편, NMR에서 수집 된 데이터를 집중 분석하고 복잡한 NMR 스펙트럼의 복합 할당이 곤란합니다. GC-MS는 광범위 극성 지질 대사 연구를 위해 사용되었지만, 그것은 휘발성 compoun을 필요DS 때로는 시간이 소요될 수 있습니다 복잡한 화학을 포함하고 실험적인 노이즈를 소개 대사 때문에 자주 유도체.

셋째 중극은 특성상 단편이나 딸 이온을 선택하는 데 사용되는 동안 삼중 사중 극 질량 분석계에 연결된 액체 크로마토 그래피 (LC)은, 다음 제 중극 조각화되어 본래 부모 이온을 선택하기위한 제 중극을 사용한다. 특정 딸 이온에 부모 이온의 전환을 기록하는이 방법은, 여러 반응 모니터링 (MRM)으로 불린다. MRM은 작은 분자와 단백질 정량 12-15,21 모두에게 매우 민감한 특정하고 강력한 방법입니다. 그러나, MRM은 한계가 있습니다. 높은 특이성을 달성하기 위해 MRM 방법은 각각의 대사에 구축 할 필요가있다. 이 방법은 특정 단편을 식별하고 prope의 사전 지식을 필요로 최적 충돌 에너지를, 대응 이루어져이러한 화학 구조 정보로서 그 대사 산물의 rties. 따라서, 일반적인 조각의 중립적 인 손실을 포함하는 몇 가지 예외를 제외하고,이 방법으로 알 수없는 대사를 식별 할 수 없습니다.

최근 몇 년 동안, 고해상도 질량 분석 (HRMS) 악기는 LTQ-orbitrap 및 Exactive 시리즈, QuanTof로 발표 및 TripleTOF 5600 16-18,22되었습니다. HRMS는 수 ppm의 오차 내에서 그대로 이온의 비율 (M / Z)를 충전하는 질량을 제공 할 수 있습니다. 따라서 모든 프리 커서 이온 (즉, 풀 스캔 모드)를 검출하여 조작 HRMS 악기 정확한 질량 분석의 결과 원소 조성으로부터 직접적인 구조 정보를 얻을 수 있고,이 정보는 잠재적 인 대사를 식별하기 위해 사용될 수있다. 실제로, 화합물에 대한 모든 정보는 구조적 이성질체의 레벨까지, 정확한 질량으로 얻을 수있다. 또한, 전체검사 방법은 대사 산물의 이전 지식을 필요로하지 않습니다 및 방법의 최적화가 필요하지 않습니다. m / z는 스캔 범위에 떨어지는 모든 이온을 분석 할 수 있기 때문에 또한, HRMS는 MRM 방법에 비해 단일 ​​실행 정량화 할 수있는 대사 산물의 수의 측면에서 거의 무제한의 용량을하고있다. HRMS 인해 스캔 전체 MS에서 얻어 질 수있는 데이터 포인트의 수를 비교 결과로 짧은 듀티 사이클에 또한 정량적 용량 삼중 사중 극 MRM에 대등하다. 따라서, HRMS 양적 대사에 대한 대체 방법을 제공합니다. 최근 HRMS의 개선 된 버전 (QE-MS)가 검출 영역 (19)을 확장 한 방법으로서, 충분히 빠른 사이클 시간과 양 및 음의 모드 사이의 전환에 따라 동작 될 수 Q-Exactive 질량 분석법을 칭했다. 여기서 우리는 QE-MS를 사용하여 우리의 대사 전략을 설명합니다.

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프로토콜

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1. LC-MS 시약, 크로마토 그래피 방법의 설립 준비 및 장비 운영 절차 수립

  1. LC 용제의 제조
    1. 500 ㎖의 이동 단계를 준비​​합니다. 20 mM의 아세트산 암모늄 및 3 % 아세토 니트릴 / 물에 15 mM의 수산화 암모늄, 최종 pH 9.0이고; B는 100 % 아세토 니트릴이다.
    2. 느슨하게 병을 모자 물 목욕 초음파 분쇄기에 배치하고, 별도의 난방없이 10 분 동안 초음파 처리. (이 단계는 암모늄염의 모두가 완전히 용해 있고 잔류 기포가 없다는 것을 보장하는 것이다.)
    3. LC-MS 사용을위한 250 ㎖의 유리 병에 용매, 4 ℃에서 나머지를 계속 전송 250 ML
  2. 낮은 질량 범위의 보정 용액을 준비합니다. 그것은 그 정확한 질량이 낮은 분자량에 감지하기 위해 대사 체학 응용 프로그램에 대한 사용자 정의 낮은 질량 범위의 보정 혼합물을 사용하는 것이 중요합니다.
    1. 소디 모두 5 ㎎의 무게를UM fluoroacetate 및 homovanillic 산 및 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도를 만들어 5 ml의 물에 그들을 용해. 10 ㎎ / ㎖의 최종 농도를 만들기 위해 메탄올에 녹여 디아 지논.
    2. 음의 낮은 질량 교정 액 1 ㎖를 제조하고 나트륨 fluoroaceate homovanillic 믹산 용액 20 ㎖와 함께 항온 마이너스 보정 용액 960 ㎖를 혼합한다. 양의 낮은 질량 보정 용액 1 ㎖를 만들려면, 열 양의 보정 용액 990 ㎖ 및 10 ㎖ 다이아 지논 솔루션을 섞는다. (낮은 질량 교정 솔루션은 4 ° C에서 보관해야하고 2 개월마다 신선한 준비합니다.)
  3. 낮은 질량 범위에서 QE-MS의 교정
    1. 낮은 질량 범위의 보정을 수행하기 전에, 제조업체의 지침에 따라 긍정과 부정 두 가지 모드에서 표준 질량 교정 (M / Z, 150-2,000)을 수행한다.
    2. 일반 대중의 교정이 통과되면, 인스트루먼트 컨트롤 패널에서 60~900m / Z까지 검색 범위를 조정긍정적 인 모드와 음의 모드에 대한 35 eV의 25 EV의 소스 CID이 적용됩니다. (이것은 카페인 조각 이온과 황산 이온의 강력한 신호를 제공 할 것입니다. 여기에 스캔 범위가 고정되어, 마지막 m / z는 시작 M / Z의 15 배 이상 클 수 없습니다해야하기 때문에)
    3. 이온 소스가 안정되면, 다음 사용자 정의 교정을 수행합니다. 참고 : 안정된 소스는 포지티브 모드에서 총 이온 전류 변화의 10 % 미만으로 정의하고, 네거티브 모드에서의 15 % 미만. 맞춤형 교정 이온 및 대응하는 m / z를 표 1에 나타내었다.
  4. 극성 대사 산물 분석을위한 LC-MS 계측을 설정합니다. LC는 대사 산물의 분리 및 검출을 위해 QE-MS에 연결된다.
    1. 온수 전기 분무 이온화 프로브 (H-ESI)와 QE-MS 장비. 나열된 프로브 관련 조정 매개 변수 설정 : 히터 온도 120 ° C를; 시스 가스, 30; 보조 가스, 10; 가스, 3을 청소; 전압 3.6 kV의 스프레이긍정적 인 모드와 음의 모드 2.5 kV의. 55에서 320 ° C에서 모세관 온도, S 렌즈를 설정합니다.
    2. 전체 검색 범위 : 다음과 같이 전체 검사 방법을 구축 60-900 (M / Z)를; 해결책 : 70,000; 최대 주입 시간 : 50 밀리 초 정도의 전형적인 주입 시간이 200 밀리 초; 자동 이득 제어 (AGC) : 3,000,000 이온. 이러한 설정은 양 및 음 양쪽 모드에서 스캔을 수행하기 위해 주변의 550 밀리의 듀티 사이클을 초래한다.
    3. 크로마토 그래피 방법을 설정합니다. 실내 온도 13, 15의 화합물 분리 아미드 칼럼 (100 × 2.1 mm 내경 3.5 mm)를 사용한다. 전술 한 바와 같이 이동상이고, 이동상 B는 아세토 니트릴이다. 다음과 같이 선형 그라데이션을 사용하여 0 분, 85 % B를; 1.5 분, 85 % B, 5.5 분, 35 % B; 10 분, 35 % B, 10.5 분, 35 % B, 14.5 분, 35 % B, 15 분, 85 % B, 20 분, 85 % B. 유속 0.15 ㎖ / 분 0-10 분 및 15의 20 분, 10.5에서 14.5 분에 0.3 ㎖ / 분이다.

2. 홍보대사 산물의 샘플의 eparation

  1. 추출 용매를 준비합니다. 50 ML 튜브에 40 ㎖의 메탄올 (LC-MS 급) 및 10 ㎖의 물 (LC-MS 급)를 혼합하고, 사용하기 전에 적어도 1 시간 동안 -80 ° C 냉동고에 보관합니다. 참고 :이 절차와 다음 단계는 생체 조직과 유체 샘플의 추출을 위해 변경 될 수있다.
    1. 전체 성장 매체와 세 10cm 접시 6 - 웰 플레이트에 문화 대장 암 HCT 8 세포는 RPMI 1640 10 % 열 불 활성화 태아 혈청과 10 만대 / L 페니실린 및 100 ㎎ / L 스트렙토 마이신과 보충.
    2. 세포가 80 %의 합류에 도달하면, 신속하게 미디어를 제거하고, 드라이 아이스 (13, 15)의 상단에있는 접시 또는 접시를 놓습니다. 즉시 (80 % 메탄올 / 물) 용매 1 ㎖의 추출을 추가하고, -80 ° C 냉동고에 플레이트를 전송합니다. 10cm 접시를 들어, 각 웰에 추출 용매 3 ㎖를 추가합니다. (중간 길이 중간에서 잔류 염에 의한 이온 억제 효과를 피하기 위해 가능한 한 많이 제거하십시오.)
    3. 15 분 동안 접시를 둡니다. 냉장고에서 제거하고, 드라이 아이스의 용매에 세포를 다 쳤어요. 1.7 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 대한 해결책을 전송하고, 10 분 동안 4 ° C에서 20,000 XG의 속도로 원심 분리기. (세 개의 복제 샘플을 만들기 위해 별도의 세 가지 요리에서 세포 대사를 준비합니다. 두 개의 튜브를 유지의 목적은 백업으로 한 것입니다.)
    4. 두 개의 새로운 에펜 도르프 튜브에 뜨는을 전송하고, 속도 진공을 건조. 이 사용 속도 진공에 따라 약 3-6 시간이 걸립니다. (샘플은 질소 하에서 밤새 건조 될 수있다.)
    5. -80 ° C 냉동고에 각 시료의 건조, 저장 튜브 후. 준비가되면, 20 ㎖의 물 (LC-MS 등급)에 하나의 샘플을 재구성 및 분석을위한 LC-QE-MS에 5 ㎖를 주입.

샘플 시퀀스 3. 설치

  1. 교정이 적절 QE-MS상에서 수행되면, 유동에서 85 %와 5 분 동안 LC 컬럼을 평형화LC의 그라데이션의 시작 조건입니다 0.15 ㎖ / 분의 속도.
  2. 무작위로 샘플 순서를 설정합니다. 주 :이 방식으로, 각 샘플에 LC-MS에 의해 도입 변동을 분배하고 상이한 샘플 사이의보다 정확한 비교를 보장한다. LC 구배를 10 분 동안 95 %이고, 0.15 ㎖ / 분의 유속으로 85 %에서 5 분 칼럼 평형화 하였다 제외한 모든 6 샘플은, 동일한 MS 방법을 주 워쉬 실행을 추가. 시스템의 배경을 평가 레벨에 수행하는 각 세척 실행 후 빈 샘플 (100 % 물)를 추가합니다.
  3. 순서를 저장하고 LC 열이 400 PSI 정도 안정 압력을 표시하면, 시퀀스 실행을 시작합니다. 다른 샘플은이 시퀀스 이후에 실행되도록 거기 없으면 끝나면 다음 그라데이션의 끝에서 0 ml / 분의 유량을 갖는 시퀀스의 끝에서 정지 주행을 추가하고 "대기"를 선택 순서.
  4. 다시 실행 동일한 샘플을 보정 한 후에 12 시간을 설정합니다. (이 전보정 후의 질량 에러 변동을 평가하는 발.)

4. 포스트 분석 기기 청소 및 유지 보수

  1. 시퀀스의 끝에서, 0.2 시간 동안 2 ml / 분의 유속으로 95 %로 컬럼을 세척하고, 필요한 경우, 세척하기 전에 열을 역방향.
  2. LC 열을 제거하고 직접 조합하여 이온 소스에 LC를 연결합니다. 용매, 물 / 메탄올 / 포름산 청소 준비 (v를 : V : V, 90:10:0.2), 대기 모드에있는 MS를 설정하고, 0.1의 유속으로 세척 LC-MS 시스템 ㎖ / 분에서 1 시간 동안 제거 잔류는 염 또는 다른 불순물을 침전. 너무 많은 시스템 압력이 있으면 유량을 낮추.
  3. 50 ° C에서 모세관 온도를 설정하고, 이온 케이지를 제거합니다. 모세관 온도가 50 ° C로 인하 한 후 조심스럽게 이온 청소 콘 및 이온 전달 튜브를 꺼내 이온 스위프 콘의 표면에 남아있는 불순물을 제거하기 위하여, 샌드페이퍼로서, 거친 메쉬를 사용.
  4. 이온의 이동 배치0.1 % 포름산 10 ml의 90 % 물 / 메탄올을 함유하는 15 ㎖의 팔콘 튜브에 관. 20 분 동안 수욕에서 초음파 분쇄기의 튜브를 초음파 처리 한 후, 내부에 용매를 가만히 따르다 10 ㎖의 순수 메탄올로 교체하고 또 다른 20 분 동안 초음파 처리. (필요한 경우, 초음파는 40 °의 C 또는 더 나은 청소 결과를 달성하기 위해 더 높은 온도에서 수행 될 수있다.)

LC-MS 데이터 5. 분석

  1. 샘플 서열을 확인하기 위하여 시퀀스에서 첫 번째 두 개의 샘플을 마친 후 불명 대사에 대한 피크를 검사, 원활하게 실행. 대사 이름, 중립 화학식 및 탐지 모드 (양수 또는 음수), 입력 파일로, 출력 파일을 압축 해제 한 봉우리와 ppm의 질량 오류가있는 목록을 CSV 파일을 사용합니다. 피크 형태는 비정상 또는 질량 오차가 5ppm 이하로 떨어져 있다면, 시퀀스의 나머지를 정지하고, 문제가 수행되어야 할 필요가있다.
  2. "피크 정렬 방법을 선택합니다및 상용 소프트웨어에 프레임 추출 ". LC-MS와 그룹들을 원시 데이터를 선택합니다. 피크 정렬을위한 크로마토 그래피 기준 샘플과 실행 시퀀스의 중간에 샘플을 선택합니다. 수집 된 데이터와 표적 대사 산물 분석 및 해당 프레임 시드 공지 대사 산물을 포함하는 프레임을 올려 시드.
  3. 개별적으로 긍정과 부정 모드에서 데이터 분석을 수행합니다. 다른 매개 변수에 대한 기본 설정을 사용합니다. 데이터베이스 검색 기능을 해제하고 워크 플로를 실행합니다. 모든 프레임의 피크 면적을 포함하는 엑셀 시트로 처리 된 데이터를 내 보냅니다. 프레임의 첫 번째 세트는 타겟 목록의 대사에 대응한다. 참고 : 표적 대사 분석을 위해 대사 산물 정보는 이전 연구 13,15에 기초하여 획득된다.
  4. 타겟이 불분명 한 대사 산물 분석을 위해, "구성 요소의 추출"의 방법을 선택합니다. 배경 빼기 빈 샘플을로드합니다. 설정된 피크 세기 임계t 10 5, 3의 잡음 비율 10 PPM 신호의 M / Z 폭.
  5. 알 수없는 화합물의 식별을 위해 인간의 대사 체 데이터베이스를 사용합니다. 복제 샘플에서 큰 CVS를 사용하여 구성 요소를 제거하기 위해 CV 필터를 사용합니다. 수동으로 각 구성 요소를 통과하고 잘 정의 된 피크 또는 데이터베이스 검색을위한 다양한 샘플 종류의 비교적 큰 차이를 가진 사람을 선택합니다. 데이터베이스의 히트 곡 데이터를 내 보냅니다. (피크 정렬 점수가 너무 낮은 경우 픽 배향이 무시 될 수있다.)

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결과

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대사 체학 데이터의 정확성이 높은 LC-QE-MS 기기의 성능에 따라 달라집니다. 악기가 좋은 상태에서 작동 여부를 평가하고, 그림 1과 같이 적용 방법은 적절한인지, 몇 가지 알려진 대사 LC 피크, 총 이온 크로마토 그래피 (TIC)에서 추출됩니다. 아미노산을 포함하여 극지 대사, 작용의 중간체 , TCA 중간체, 핵산, 비타민, 등등 ATP, NADP +와 현재 LC 조건 하에서 아미드 열에서 열 및 좋은 피크 모양에 잘 보존되어 있습니다. 한편, 질량 오류 테스트는 세중의 샘플 6 개의 농도가 보정 한 후에 두 번 실행됩니다. 그림 2에 나타낸 바와 같이, 낮은 질량 교정 후 24 시간 내에서 수행, 전체 시간 범위는 거의 24 시간을 다루고있다. 질량 오차 표적 대사 산물의 이론적 m / z에 검출 된 m / z을 비교함으로써 평가된다. 여기에 대상으로 대사 m / z가74 (글리신)에서 (NADP +) (744)에 이...

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토론

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이 프로토콜을 이용하여 세포의 성공적인 대사 산물 프로파일 링을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같다 : 1) 성장 배지와 세포의주의 추출을 제어하는​​ 단계; 2) 정량 피크 걸쳐 충분한 (보통 적어도 10) 데이터 포인트가되도록 MS 방법 설정에 근거 LC 방법을 조정하는 단계; 3) 샘플을 실행하기 전에 낮은 질량 교정을하고; 4) 이동 유지 시간을 피하기 위해 더 이상 5 이상 ㎖에 주입 피크 폭이 넓어 물에 의해 발생합니다; 5) 배치의 영향을 최소화하기 위해 동일한 배치의 비교를 위해 샘플을 준비하고 실행.

표준 낮은 질량 범위 교정 여기를 선택 (표 1)을 교환 할 수있다. 대량의 스캔 범위에 속하는 M / Z의 알려진 화합물은 잘 H-ESI 소스의 행동 및 교정 표준에 대한 합리적인 후보 물, 메탄올, 아세토 니트릴에 용해된다. 그것은 매우 모든 교정 솔루션을 저장하는 것이 좋습니다t 4 ° C의 카페인을 안정하고 또한 보정 성능이 ...

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공개 사항

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저자는 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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저자는 질량 교정 및 데이터 처리에 대한 가치있는 토론을위한 데틀 레프 슈만, 제니퍼 서튼 (써모 피셔 과학)와 나다니엘 스나이더 (펜실베니아 대학)을 인정하고 싶습니다. 이 책에서보고 된 연구는 상 수 R00CA168997에서 건강의 국립 연구소의 국립 암 연구소에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
포지티브 캘리브레이션 믹스Thermo Scientific#88323빛에 민감합니다. 4 °에 저장; C
음성 보정 혼합물Thermo Scientific# 883244 °에 보관; C
DiazinonSant Cruz Biotechnology#C0413눈에 자극을 일으키므로 후드에서 작업하십시오. 4 °에 저장; C
H-ESI 바늘 삽입Fisher Scientific#1303200막힌 경우 5% 포름산/물(고무 링 제거)로 교체하거나 청소할 수 있습니다.
Xbridge 아미드 컬럼Waters#186004860Guard 컬럼은 컬럼 수명을 늘리는 것이 좋습니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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