Method Article

C 형 간염 바이러스의 복제를 분석하기위한 프로토콜

DOI:

10.3791/51362

⸱

June 26th, 2014

 ,  , 
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

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C형 간염 바이러스(HCV)는 간경변과 암을 포함한 간 질환을 일으키는 주요 인간 병원체입니다. HCV 감염성 세포 배양 시스템은 HCV 복제의 분자 메커니즘을 이해하고 새로운 치료법을 개발하는 데 필수적입니다. 여기에서는 HCV 복제 주기의 다양한 단계를 조사하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

Abstract

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C 형 간염 바이러스 (HCV)는 세계 인구의 3 %에 영향을 미치는 만성 간염, 간경변 및 간암 등의 심각한 간 질환의 원인이됩니다. HCV는 가족 플라 비 바이러스과에 속하는 포락선 RNA 바이러스이다. 현재의 치료는 완전히 효과가없고, 부작용이 발생합니다. 가능한 HCV 백신이 없습니다. 따라서, 지속적인 노력은 백신과 더 나은 치료를 개발하기 위해 필요합니다. HCV 세포 배양 시스템은 바이러스 진입, 게놈 복제, 포장, 및 송신을 포함하여 HCV 성장의 각종 단계 연구에 중요하다. 제시된 현재 프로 시저에서, 우리는 야생형 intragenotype의 2A 키메라 바이러스, FNX-HCV, 그리고 바이러스 복제를 연구하는 레 닐라 루시퍼 라제 리포터 유전자를 운반하는 재조합 FNX-Rluc 바이러스를 사용했습니다. 인간 간암 세포주 (허-7을 기준으로)의 시험 관내 형질 도입에 사용 된은 HCV 게놈 RNA를 전사를. 무 세포 배양 상층 액, 단백질 해물과 t전 체 RNA는 HCV의 성장을 평가하는 사후 형질 포인트는 다양한 시간에 수확. HCV 게놈의 복제 상태 정량적 RT-PCR 및 HCV의 존재를 시각화하는 이중 가닥 RNA에 의해 평가 하였다. HCV 단백질 발현은 HCV NS3 및 NS5A 단백질에 대한 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 및 면역 형광 분석에 의해 확인되었다. 배양 상청 및 바이러스 역가에 감염성 입자를 방출 HCV의 RNA 형질 감염 세포를 측정 하였다. 루시페라아제 리포터 분석법은 HCV의 복제 수준 및 감염성을 평가하기 위해 사용되었다. 결론적으로, 우리는 HCV의 복제주기의 다른 단계를 특성화하기위한 다양한 바이러스 적 분석을 제시한다.

Introduction

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C 형 간염 바이러스 (HCV)는 간경변과 간암의 원인이됩니다. 그것은 350,000의 사람들이 매년 1-3 죽어과 170 만명이 전 세계적으로 영향을 미칩니다. HCV는 9.6 KB의 게놈의 크기와 양의 가닥 RNA 바이러스이다. HCV 게놈은 단백질 가수 분해 10 폴리펩티드에 다양한 세포 및 바이러스 프로테아제에 의해 절단된다 ~ 3000 개의 아미노산의 단일 폴리 단백질로 번역된다. HCV는 속 Hepacivirus에 프로토 타입 바이러스와 가족 플라 비 바이러스과 4에 속한다. 노출되면, HCV는 개인의 80 %에 만성 감염을 설정합니다. 감염이 진단은 간 저하를 방지하기 위해 치료 적 개입을 허용 할 수 있습니다 대부분 증상이 적시에 있습니다. 현재 치료는 차선이고 백신은 5,6 사용할 수 없습니다.

C 형 간염의 원인은 1989 7 설명했다. HCV 복제를 공부하는 것은 C 형 간염 백신과 치료 연구를위한 중요하지만이 있었다긴 효율적인 바이러스 배양 시스템의 부족에 의해 방해. HCV의 분자 클론은 간내 접종 8시 침팬지에 감염 될 것으로 나타났다. 이어서, HCV 서브 게놈 플리은 세포 배양 시스템 9,....

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Protocol

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프로토콜의 일반적인 개요는도 1에 도시되어있다.

1. 셀

  1. 15 % 소 태아 혈청 (FBS), 10 mM의 비 필수 아미노산, 10mM의 헤 페스, 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신 (100 ㎎ / ㎖), 및 2 mM의 L-글루타민을 포함 완전 성장 배지를 준비한다.
  2. C 형 간염 바이러스의 복제주기의 체외 분석을 위해 위의 보충제를 포함하는 완전한 성장 매체 허-7.5.1 셀 (13)을 유지한다.
  3. 5 % CO 2와 37 ° C에서 지정한 보충 성장 매체 허-7.5.1 세포 배양 바이러스의 변종.

2. 바이러스와 플라스미드 구문

  1. HCV RNA의 상보 적 DNA (cDNA를) 형태로 생성 및 유전자 조작의 용이성을 위해 플라스미드 벡터로 복제. 참고 : 일본의 전격 성 간염 1의 발견은, JFH-1 (유전자형 2A의 HCV), HCV 연구에 대한 비판적이고있다 격리주로 HCV의 복제 사이클 11-13를 연구하는 데 사용. JFH-1 HCV에 따라 간 및 intragenotypic 키메라 ....

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Results

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C 형 간염 바이러스는 RNA 바이러스이다. 따라서, 유전자 조작 목적, HCV 게놈 cDNA를 박테리아 플라스미드 벡터에 클로닝되었다. T7 RNA 폴리머 라제 프로모터 서열은 HCV 게놈의 5 '말단 바로 전에 도입되었다. HCV 분석 워크 플로우에 대한 일반적인 개요를 그림 1에 제시되어있다. 정확한 3 '끝 HCV 게놈 RNA를 생성하려면, 플라스미드를 포함하는 HCV 게놈은 XBA I 제한 효소 생성 된 단일 가닥 오버행이 녹두 클레아 소화를 둔화 된 절단된다 . HCV 선형화 된 플라스미드의 품질을 아가 로스 겔 전기 영동 (도 2B)에 의해 평가 하였다. HCV DNA는 시험 관내 전사에 매개 T7 RNA 중합 효소를 실시하고 그 결과 RNA는 9.6 킬로베이스 (도 2c)에서 하나의 제품을 얻었다.

우리는 intragenotype 2a 개의.......

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Discussion

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이 그림은 C 형 간염 바이러스의 복제 사이클을 분석하는 방법을 설명한다. HCV는 인간의 병원체이며, 소정의 바이오 안전성 의정서는 엄격하게 준수해야하는 것입니다. HCV 감염 세포 배양 시스템은 이전 11-13,16,17 설명되었다. 예시 된 프로토콜을 다음과 같은 때 우리가 구현하는 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫째, 다운 스트림 연구에 그대로 전체 길이 바이러스 게놈 RNA의 좋은 품질을 가지고 높은 중요하다. 바이러스의 cDNA를 들고 입력 플라스미드를 선형화하고 신중하게 무디게 할 수있다. XBA I 오버행을 무디게하기 위해 사용 된 녹두 콩 클레아가 아닌 특정 클레아 제와 장시간 배양은 바이러스 게놈의 3 '말단의 손상이나 성능 저하가 발생합니다. 클레아는 ​​페놀 - 클로로포름 추출 또는 음이온 교환 칼럼 정제에 의해 지정된 30 분 인큐베이션 후에 즉시 제거되어야한다. DNA 치료 핵산 분해 효소의 젤 추출로 추천 할 수 없습니다효소는 전기 영동 과정 중에 활성.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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Huh-7.5.1 세포주를 제공해 주신 F. Chisari에게 감사드립니다. 원고를 편집해 주신 Justine Ho에게 감사드립니다. 이 작업은 Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award와 National Center for Advancing Translational Sciences의 지원을 받았으며 V.A.에 UL1TR000124 지원했습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
둘베코' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)Fisher Scientific10-017-CV
비 필수 아미노산Fisher ScientificMT25025CI
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
Opti-MEM 감소 혈청 매체, 페놀 없음 RedLife Technologies11058-021
Huh-7.5.1스크립스 연구소세포주는 프랜시스 치사리 박사가 스크립스 연구소와 시더스-시나이 메디컬 센터
플라스미드 (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)Cedars-Sinai Medical CenterHCV 플라스미드는 중첩된 올리고-뉴클레오티드를 사용하여 Dr. Arumugaswami에 의해 합성되었습니다.
XBAI뉴 잉글랜드 Biolabs Inc.R0145S
녹두 뉴클레아제뉴잉글랜드 Biolabs Inc.M0250S
T7 RiboMAX Express 대규모 RNA 생산 시스템PromegaP1320
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm)BioexpressE-5010-4
Gene Pulser Xcell Total SystemBio-Rad165-2660
마우스 단클론 항-dsRNA 항체 J2 영어 & 과학 컨설팅 Kft.
염소 안티 토끼 IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11008
염소 안티 토끼 IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
PVDF 멤브레인 패키지Bio-Rad162-0263
블로팅 등급 차단제 Non-Fat Dry MilkBio-Rad170-6404XTU
Tween-20Bio-Rad170-6531XTU
항-C형 간염 바이러스 NS3 항체 [8 G-2]Abcamab65407
항-C형 간염 바이러스 NS3 항체 [H23]Abcamab13830
염소 항-마우스 IgG 고추냉이 과산화효소 (HRP)와 결합 잭슨 면역 연구소 Inc.115-035-003
Amersham ECL 프라임 웨스턴 블로팅 검출 시약 GE 헬스케어 생명과학RPN2236
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
ViiA 7 real-time PCR 시스템Life TechnologiesNA
Renilla Luciferase 분석 시스템 키트PromegaE2810
RNase-Free DNasePromegaM6101
GloMax-Multi Detection System(광도계)프로메가
사이의 MTA를 실행하듯 Arumugaswami 박사에게 친절하게 제공되었습니다.10010200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D.

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