이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

의 조직 화학 염색

42.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51381

⸱

2014년 5월 13일

 , 
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

이 논문에서

요약

식물 세포벽 구성은 조직 유형에 따라 다르며 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴을 포함할 수 있습니다. 세포 유형 수준에서 차이를 시각화하기 위해 다양한 염색 기술이 개발되었습니다. 이 논문은 일반적으로 사용되는 세포벽 염색 기술을 편집한 것입니다.

초록

Arabidopsis thaliana는 식물의 다양한 세포 과정을 이해하고 조작하는 데 일반적으로 사용되는 모델 유기체이며 2차 세포벽 형성 연구에 광범위하게 사용되었습니다. 2차 세포벽 증착은 1차 세포벽이 놓인 후에 발생하며, 이 과정은 혈관 및 섬유 조직을 형성하는 세포와 같은 특수 세포에 의해 독점적으로 수행됩니다. 대부분의 2차 세포벽은 셀룰로오스(40-50%), 헤미셀룰로오스(25-30%), 리그닌(20-30%)으로 구성되어 있습니다. 2차 세포벽 생합성에 영향을 미치는 여러 돌연변이가 분리되었으며, 해당 돌연변이는 보상 반응에 의해 가려질 수 있기 때문에 해당 돌연변이는 명백한 생화학적 조성 변화 또는 시각적 표현형을 나타내거나 나타내지 않을 수 있습니다. 염색 절차는 역사적으로 세포 기반의 차이를 보여주기 위해 사용되어 왔습니다. 이러한 방법은 전적으로 시각적 분석 수단입니다. 그럼에도 불구하고 신속하고 비판적인 분석에서 이들의 역할은 매우 중요합니다. 콩고 레드(Congo red)와 칼코플루오르 화이트(calcofluor white)는 다당류를 검출하는 데 사용되는 염색이며, 말레(Mäule)와 플로로글루시놀(phloroglucinol)은 리그닌(lignin)의 차이를 확인하는 데 일반적으로 사용되며, 톨루이딘 블루 O(toluidine blue O)는 다당류와 리그닌을 구별하여 염색하는 데 사용됩니다. 겉보기에는 간단해 보이는 절편, 염색 및 이미징 기술은 초보자에게는 어려울 수 있습니다. 이 연구는 A. thaliana 모델을 사용한 시료 전처리를 시작으로 식물의 2차 세포벽에서 세포 및 조직 조직을 관찰하기 위해 쉽게 구현할 수 있는 다양한 염색 방법론의 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

서론

식물 세포의 벽은 다양한 구성 요소 내에서 정보의 과다 보유 : 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 (크 실란, glucuronoxylan, 크 실로 글루칸, 아라비, 혼합 결합 글루칸, 또는 글루코), 펙틴을. 조직 학적 기술 조직 및 세포 수준에서 보조 세포 벽 내의 차이를 연구하는 중요한 시각적 단서를 제공한다. 다양한 조직 학적 방법이 개발되었고, 문헌에서 발견 될 수 있지만, 단순한 시각적 지시 매우 상세한 프로토콜이 드물게 이제까지 가능한 경우 없기 때문에 이러한 기술은 어렵고 시간 소모적 초보자 수있다. 본 연구의 목적은 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 조직 학적 염색 기법에 대한 간단한 지침을 제공하는 것이다.

줄기 조직을 구획하는 셀 벽 및 셀의 셰이프 시각화하는 첫 번째 단계이다. 손으로 자른 부분이 저렴하고 준비하는 시간을 줄이고 있지만, vibratome의 사용은 일관성을 제공하며,고품질 이미지를 산출한다. vibratome를 사용하여 선명한 이미지를 생성하는 데 도움이 상당히 간단 나쁜 시료 준비에 의해 야기 될 샘플 간의 부정확 차이 제조 위험을 줄여 동일한 두께, 심지어 섹션을 생성함으로써 더 나은 데이터 품질을 생산한다. 신선한 표본을 해결하기 위해 수지를 사용하여 초보자를위한 도전이 될 수 있으며, 분석을 신속하게 수행 할 필요가있는 경우에도 여전히 전문가를위한 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 또,이 수지에 포함되었을 때 샘플로 생물학적 활성을 측정하는 것이 불가능해진다. 아가 로스 및 제 금형을 채용 한 간단한 기술은 줄기 조직을 매립 명이이며 또한 부드러운 조직의 절개가 필요한 다른 애플리케이션에 이용 될 수있다. 수지 시험편을 매립에 비해,이 방법은 살아있는 조직을 유지하는 샘플 조작을 감소시키는 이점을 갖는다. vibratome를 통해 조직을 단면은 고정밀 및 homogen를 생성연구의 목적에 따라, 다음 여러 다른 염색 기술과 함께 사용될 수 있으며, OU를 섹션.

리그닌과 다른 방향족 화합물을 시각화하는 가장 간단한 방법은 자외선 (UV) 빛을 사용합니다. UV 빛에 의해 방향족 기반 분자의 여기 오래된 기술이지만, 그것은 여전히​​ 리그닌의 시각화를위한 가장 빠른 방법 중 하나입니다. UV 빛은 다른 방향족 화합물을 자극하기 때문에 그러나, UV 시각화 실제로 리그닌 탐지에 적합하지 않습니다. 1-3 : 리그닌은 주로 세 가지 빌딩 블록, monolignols (coniferyl 알코올, sinapyl 알코올, 및 p-coumaryl 알코올 hydroxycinnamyl 알코올)로 구성되어 있습니다. 플로로 글 루시놀 얼룩 통, 섬유 및 기관의 조직 4에 존재 cinnamaldehydes의 범위에 단서를 제공 할 수 있습니다. 플로로 글 루시놀 일반 cinnamaldehydes의 좋은 지표이며 cinnamaldehydes 및 기타 방향족 화합물을 구별 할 수 있습니다. sinapyl 알코올 단량체를 검출 할 수있다및 마 울레 얼룩의 사용으로 차별화. 톨루이딘 블루 O는 다색 염료이며, 따라서 다른 색 5,6에 칸막이 벽의 다른 요소를 더럽힐 수있는 능력을 갖는다. 톨루이딘 블루 O의 주된 용도는 펙틴 및 리그닌 5,6를 검출하는 것이다. 톨루이딘 블루 O를 사용하는 장점은 세포벽의 많은 요소가 단일 단계로 시각화 할 수 있다는 것이다. 흰색 calcofluor 및 콩고 레드 모두 함께 작동하기 쉽고 셀룰로오스를 시각화 할 수있다. Calcofluor 흰색 얼룩 셀룰로오스, callose 및 기타 비 치환 또는 약하게 치환 된 β-글루칸 6-9, 콩고 붉은 얼룩은 직접 특히 10,11-β (1 → 4) - 글루칸과 셀룰로오스 할 수있는 반면. 본 연구의 목표는 A.에서 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 상기 염색 기법의 사용을 위해 단순한 지침을 제공하는 것이다 장대 줄기.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 임베딩에게 줄기

  1. 물에 7 % 아가로 오스 용액 (증류수 100 ㎖에 전기 수준의 아가로 오스 7 g)을 확인합니다. 20 분간 고압 증기 멸균 또는 낮은 강도 (1,250 와트 전자의 예를 들면, 10 % 강도)에서 20 분 동안 레인지 작동하여 아가 로스를 녹여.
  2. 플라스틱 병을 사용하여 줄기 삽입을 위해 만든 금형을 준비합니다.
    1. 면도날을 사용하여, 2 ㎖ 스크류 캡 microcentrifuge 관 (파트 A)의 원뿔 바닥을 잘라. 주사기 바늘로, 임베드하도록 스템의 직경보다 약간 큰 튜브 캡에 구멍을 천공. 다음으로, 0.6 ML의 microcentrifuge 관 (파트 B)의 아래쪽에서 0.5 cm를 잘라.
    2. 미리 절단 2 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 0.6 ㎖의 마이크로 원심 튜브의 컷오프 0.5 cm 부를 추가. 파라 필름 (그림 1)를 사용하여 두 부분을 밀봉합니다. 주 : 튜브의 하단은 아가로 오스가 고형화 된 후에 매립 샘플의 제거를 용이하게 절단된다. 티그는 모자에 구멍이 줄기는 아가로 오스에 포함되는 경우 줄기가 안정적으로 유지에 도움이됩니다. 형은 아가 로스를 잡고 삽입 할 때 줄기를 똑바로 유지하는 역할을합니다. 아가로 오스가 설정과 줄기가 삽입 될 때까지 파라 필름은 두 부분, 및 B를 보유 할 것이다.
    3. 면도날을 사용하여, 관심 영역 (제 줄기 절간의 예 중간)에서 줄기 부분을 절단. 참고 : 이상적으로, 줄기는 단지 탈수에 의해 파괴를 방지하기 위해 삽입하기 전에 차단해야합니다. 대안 적으로, 스템은 일시적 물로 적신 여과지를 함유하는 플레이트에 저장 될 수있다. 이 판은 조직의 탈수 및 변형을 방지하기 위해 삽입 될 준비가 될 때까지 얼음에 배치 할 수 있습니다. 높은 습기없이 30 분 이상 기간에 대한 줄기를 저장하면 줄기가 건조하게됩니다.
  3. 낮은 강도에서 전자 레인지에 아가로 오스를 용융. 주의 : 아가 포함하는 병이 뜨거워 질 수 있습니다. 병을 데리러 미트를 사용합니다. 용융 아가로 오스의에게하자(20 ° C와 25 ° C 사이) 실온에서 TAND은 약 50 ° C로 냉각 될 때까지
  4. 천천히 병을 채우기 위해 미리 만들어진 플라스틱 금형에 아가로 오스의 5 mL를 피펫. 참고 : 확인 금형에 기포가 없는지 확인하십시오. 기포는 아가로 오스 금형의 격차가 발생하고 완전히 결국 샘플 섹션의 고르지 절단으로 이어질 것입니다 줄기 샘플을 커버하지 않습니다.
    1. 아가로 오스가 반고체이 될 30 ~ 60 초 동안 식혀 보자. 그것은 침투와 아가로 오스, 떠 서서,하지만 할 수 있는지 확인하고, 작은 이쑤시개로 테스트합니다. 참고 : 아가로 오스는 세포의 형태를 파괴하고, 줄기를 쇠퇴 해하여 샘플을 손상됩니다 뜨거울 때 줄기가 배치됩니다.
    2. 이 아가로 채워진 유리 병에 줄기를 놓습니다. 줄기가 똑바로 유지 있는지 확인합니다. 스템의 선단이 뚜껑에 의해 유지되어있는 방식으로 천공 된 모자를 배​​치. 나사에 캡을 설정하지 마십시오. 언젠가 (단일 종류의) 하나의 줄기보다 더 embe이 될 수 있습니다하나의 유리 병에 dded; 그러나 특정한 경우, 캡을 사용하지 않는다. 참고 : 나사에 캡이 설정되어있는 경우, 줄기 트위스트 얻을 것이다.
  5. 이 응고 될 때까지 10 ~ 30 분 동안 실온에서 4 ° C에서 유리 병을 둡니다.
  6. 부드럽게 튜브의 밀어 곰팡이를 제거합니다. 파라 필름을 엽니 다. 유리 현미경 슬라이드에 부분에서 응고 아가 로스를 해제 엄지 손가락으로 부드럽게 금형 부품 B의 바닥을 밀어 넣습니다.
  7. 길이 1.2 cm의 세 가지 거의 동일한 조각으로 아가로 오스 임베디드 줄기를 잘라. 아가로 오스 아니었다 및 폐기 줄기 부분을 잘라.
    1. 임베디드와 아가로 오스의 이러한 조각을 보관은 밀폐 된 섹션 준비가 될 때까지 4 ° C에서 어두운 상자에 2 ㎖의 마이크로 원심 튜브를 줄기. 또한, 최대 1 주일에 4 ° C에서 튜브를 저장합니다. NOTE : 저장이 가능하지만, 실험자는 매립 줄기 아직 살아 있고, 실험 의존한다는 인식해야, 유물은 잠재적으로 도입 될 수있다.

2. 단면 줄기

  1. 주의 :주의 깊게 vibratome 설명서를 읽고 모든 안전 지침을 따르십시오.
  2. 시편 디스크 (임의의 고체 또는 액체 무료) 깨끗하고 완전히 건조해야합니다. 이전의 실험에서 잔여 접착제를 제거하고 물로 씻어 면도날과 표본 디스크를 청소합니다. 그런 다음 종이 타월로 건조. 참고 :이 접착제가 잘 작동하고 아가로 오스 표본에 바인딩되었는지 확인합니다. 이 단계가 제대로 수행되지 않는 경우, 시편이 디스크에 부착되지 않을 수 이상 시험편 단면 처리 중에 디스크 탈락 발생할 가능성이있다.
    1. 사용 소프트 논문은 표본을 포함하는 아가로 오스 블록의 모든 수분을 제거하기 위해 정리합니다.
    2. 시편 디스크 조직 접착제의 작은 방울을 배치합니다. 킬 접착제 병의 팁을 사용 플레이트의 중간 영역을 커버하기 위해 접착제 밖으로. 신속 장소아가로 오스 블록 시험편에 수직 또는 각각 횡 또는 종 단면에 대한 플레이트와 병렬로 어느 것을 이렇게. 접착제가 10 ~ 30 분 동안 실온에서 4 ° C에서의 표본 디스크에 샘플을 고정 할 수 있습니다. 참고 :이 시간에 민감한 단계입니다.
  3. 버퍼 트레이 또는 통에 자리에 표본 디스크를 고정합니다. 섹션이 아가로 오스 블록 / s는 면도날과 평행해야한다. 샘플이 완전히 침수 될 때까지 실온에서 증류수로 버퍼 트레이를 기입하십시오.
  4. 반 면도날을 잘라 다음 날이 완전히 평평하게 유지되도록 튼튼한 가위로 끝을 잘라. 칼 홀더에 규격에 맞게 자르는 면도날의 절반을 연결합니다.
    1. 84 °에 칼 홀더의 각도를 설정, 50 Hz에서 (vibratome에 위치 5)에 0.90 / 초 mm (vibratome에 위치 8) 및 주파수 속도. 100 μm의 두께의 섹션을 잘라. 연속 모드를 사용합니다. NOTE :이 두께는 조직 염색 프로토콜의 일부에 사용되는 다양한 산 및 기본 치료를 견딜 수 있음을 보장하기 위해 선택되었다. 절편의 창을 설정하고 부분 약 1.2 cm의 아가로 오스 블록에 vibratome의 연속 모드에서 15 ~ 20 분을 할 수 있습니다.
  5. 버퍼 트레이에 절편 동안 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 섹션을 수집합니다. 또한, 섹션 유리 비커에 버퍼 트레이에서 전송하고 명확한 페트리 접시에 할 수 있습니다. 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 몇 가지 섹션을 전송합니다. 주 : 표본은 분명 배경에 절을 참조하기 쉽기 때문에 세균 배양 용 접시에서 수집하고, 버퍼 트레이는 다음 시편 뇌관을 할 수 있기 때문이다.
  6. 섹션은 30 ~ 60 분 동안 4 ° C에서 50 ML 튜브에 저장하거나 수집 및 1.5 ~ 2 밀리리터의 microcentrifuge 튜브에 저장 될 수 있습니다. 참고 : 더 긴 기간에 대한 부분을 저장하는 것은 좋지 이미지 품질을 제공합니다.

영상 3. 현미경 및 카메라 설정

  1. 현미경 쾰러 조명을 조정합니다. 목표를 선택합니다. 먼저 시편에 초점을 맞 춥니 다. 절반 이하로 빛의 강도를 가져옵니다. 필드 다이아 프램 (FD)와 조리개 (AP)를 닫습니다 또는 특정 목적에 가장 낮은 설정을 가져옵니다.
    1. 배율이 높을수록 더 큰 링이 될 것입니다. 로 급격히 가능한 필드 홍채 초점을 콘덴서 초점 노브를 사용합니다.
    2. 천천히 응축기 센터링 노브 (응축기를 둘러싼 핀형 나사)를 사용하여 센터 필드 조리개 (육각 형상의 작은 링)의 이미지를 가져온다. 천천히 필드 홍채 가장자리에 도달하는 격막 (FD)이 같은 증가. 필드 홍채 가장자리를 통과 한 후 바로 FD를 증가 중지합니다.
    3. 천천히 명암을 조절하는 조리개 (AP)를 증가시킨다. 필요에 따라 빛의 강도를 조절합니다. NOTE : 쾰러 조명마다 O 위해 조정될 필요bjective, 모든 실험 일. 하루 조정 후의 번호를합니다. 이 숫자는 목적이 특정 일에 앞뒤로 전환 할 때마다 다시 사용됩니다.
  2. 조리개, 강도, 노출 시간, 게인, 표 1에 설명 된대로 필터를 조정합니다.이 정보는 참조 표기하고 있습니다.
  3. 형광 이미지를 캡처하는 기계적 셔터 대형 인터 라인 CCD 칩과 고해상도 디지털 카메라를 사용하여; 및 명 시야 이미지를위한 고해상도, 고속 카메라.
  4. 표준 소프트웨어를 사용하여 슬라이드를 처리한다. 소프트웨어를로드합니다. "획득"하고 "카메라 설정 / 보드를,"다음 사용하는 카메라를 선택합니다. "OK"를 클릭하십시오. 다음에 "취득"을 클릭 "색상 탭을 선택합니다."에서 "색상 탭,"선택 "바이엘 방법을"다음 "평균 네."제안 된 이득 (빨강, 녹색, 파랑) 아프로 추가m 표 1. "설정 저장"탭을 선택하고 이미지가 저장 될 디렉토리를 클릭합니다. 표 1의 제안에서 "노출 시간"을 설정합니다. "1"에서 "비닝"을 설정하고 "라이브 비닝 (binning)을"관심 영역에 "1."초점에서 다음을 클릭하십시오 "라이브에 저장합니다."
  5. 카메라 소프트웨어에 출력 이미지는 "TIF"형식입니다. 세포 유형의 조직 화학에 대한 이미지를 분석한다. 프레 젠 테이션 및 간행물의 다운 스트림 사용에 대한 표준 컴퓨터 소프트웨어를 사용합니다.

4. 자외선과 밝은 - 필드 이미징

  1. 섹션이 용이 피펫 팅 할 수 있도록 피펫 팁 컷으로 1 ㎖ 피펫을 사용합니다. 부드럽게 피펫 섹션 끝으로하고 현미경 슬라이드에에. 커버 슬립을 가진 부분을 커버. UV 빛이나 밝은 필드 조명 아래 부분을 확인하십시오.

5. 플로로 글 루시놀 -염산 (WIESNER) 염색 (12)

  1. 3 % 루시놀 용액을 제조 10 ml의 무수 에탄올에 루시놀 0.3 g을 용해. 에탄올 3 % 플로로 글 루시놀의 두 볼륨에 진한 염산 (37 N) 중 하나의 볼륨을 혼합; 이 솔루션은 플로로 글 루시놀 염산 (PH-염산) 또는 WIESNER 얼룩입니다. 참고 :이 솔루션은 솔루션은 시간이 지남에 따라 저하되고 염색이 효과가 될 것입니다 때문에, 염색의 날에 신선한 만든 수 및 저장 할 수 있습니다. 주의 : 염산은 부식성이 높은, 그래서 PH-염산 얼룩을 처리하는 동안 극도의주의를 사용합니다.
  2. 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 줄기 부분을 전송합니다. 섹션을 포함하는 튜브에 PH-HCl 용액 1 ㎖를 추가하고 PH-염산 얼룩의 염산은 부식성 때문에 바로 모자. 부드럽게 모든 섹션이 더러운 것을 보장하기 위해 튜브를 이동합니다. 이 단계에 대한 대안은 PH-HCl 용액이 위아래로 피펫 팅 할 수 있도록 바람직하게는 초를 방해하지 않고, 열려있는 관 뚜껑을 유지하는 것입니다tions. 참고 :이 그 부분에 손상을 줄 수 있으므로, 피펫 팁으로 섹션을 피펫하지 않도록주의하십시오.
    1. 섹션 손상없이 용이하게 피펫 팅 될 수있는 방식으로 피펫 팁 잘라 1 ㎖ 피펫을 사용한다. 부드럽게 끝으로하고 현미경 슬라이드에 섹션을 피펫. 커버 미끄럼 방지 부분을 커버. 명 시야 조명 아래 부분을 확인하십시오. 주 : PH-HCl 용액은 표본의 열화를 일으키는 50-10 분에서 건조. 따라서, 영상은 그 기간 내에 완료되어야한다.

6. 울레 염색 (13, 14)

  1. 0.5 % 과망간산 칼륨 용액을 제조하기 위해 40 ㎖의 증류수에 과망간산 칼륨 0.2 g을 용해. 칠일의 최대 상온에서 어두운 병에 보관합니다.
    1. 9 ㎖의 증류수 (1시 10분)에 1 ㎖ 진한 염산 (37 N)을 추가하여 3.7 % HCl 용액을 준비합니다. 에 신선한 3.7 % 염산 용액을 제조실험의 날. 사용되는 37 N 염산 원액이 너무 오래 있지 않은지 확인합니다. 농축 수산화 암모늄 용액 (14.8 M)가 감소하는 포화 용액의 몰 농도를 방지하기 위해 39 ° C에서 저장되어야한다.
  2. 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 줄기 부분을 전송합니다. 섹션을 함유하는 튜브에 0.5 % 과망간산 칼륨 용액 1 ㎖를 추가.
    1. 바람직 부분을 방해하지 않고, 부드럽게 상하 0.5 % 과망간산 칼륨 용액을 피펫. 2 분 동안 품어 피펫 팅을 반복합니다. 모든 섹션이 정착 될 때까지 microcentrifuge 관이 서 보자. 참고 : 섹션이 손상받을 수 있으므로 피펫 팁으로 섹션을 피펫하지 않도록주의하십시오. 이 솔루션은 어두운으로 줄기 부분을 참조, 그래서 테스트 튜브 랙에 섹션에 튜브를 유지하고 2 분 동안 정착 할 수 있도록하기 어려울 수 있습니다.
    2. 1 ㎖ 피펫을 사용하여, 0.5 % 과망간산 칼륨 용액 700 μL를 그립니다.과망간산 칼륨 용액을 씻어 증류수 700 μl를 추가합니다. 수용액은 분명 유지 될 때까지 3 - 4 배를 반복하거나.
    3. 물을 폐기하십시오. 깊은 브라운 색상이 섹션에서 방전 될 때까지 빠르게 3 % 염산 1 ㎖를 추가합니다. 이 3 ~ 5 분 이내에 발생할 수 있습니다 또는 5 분 각 2 세척이 필요할 수 있습니다. 모두 3 % HCl 용액을 피펫 바로 다음 단계로 진행합니다.
    4. 진한 수산화 나트륨 용액 1 ㎖를 추가합니다. 섹션 손상없이 용이하게 피펫 팅 될 수있는 방식으로 첨단 잘라 1 ㎖ 피펫을 사용한다. 부드럽게 끝으로하고 현미경 슬라이드에 섹션을 피펫. coverslip에있는 부분을 커버. 명 시야 조명 아래 부분을 확인하십시오. 주의 : 수산화 암모늄은 매우 부식성이 있기 때문에, 현미경, 렌즈의 무대에 부식을 유발하지 않도록 각별한주의와 관심이 필요합니다. 주 : 수산화 암모늄 매연 어려운 샘플을 관찰하게, 커버 슬립 안개 수. 따라서 커버 슬립을 추가하기 전에 특별히 조심. 이 솔루션은 5 ~ 10 분에 건조, 그래서 영상은 그 기간 내에 완료되어야한다.

7. 콩고 레드 염색 11, 15

  1. 0.5 % 콩고 레드 용액을 제조하기 위해 100 ml의 증류수 콩고 레드 0.5 g을 용해.
  2. 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 줄기 부분을 전송합니다. 튜브에 0.5 % 콩고 레드 시액 1 ㎖를 추가합니다. 조심스럽게 0.5 % 콩고 레드 솔루션을 피펫 아래 부분을 방해하지 않고. 참고 :이 부분에 손상을 줄 수 있으므로 피펫 팁에 섹션을 피펫하지 않도록주의하십시오.
    1. 실온에서 10 분간 부화 및 피펫 팅을 반복한다. 실온에서 배양 또 다른 3 분에 따릅니다.
    2. 0.5 % 콩고 레드 솔루션 700 μl를 끌어낼 1 ㎖ 피펫을 사용합니다. 콩고 레드 솔루션을 씻어 증류수 700 μl를 추가합니다. 세정액 때까지 세척 3 배를 반복분명하다.
    3. 섹션 손상없이 용이하게 피펫 팅 할 수있는 방식으로 그 끝 컷으로 1 ㎖ 피펫을 사용합니다. 부드럽게 끝으로하고 현미경 슬라이드에 섹션을 피펫 및 커버 슬립로 커버. 40분의 560의 통과 대역으로 필터를 사용하여 푸른 빛 여기에서 현미경 슬라이드에 샘플을 관찰한다. 참고 : 물이 10 ~ 30 분에 콩고 레드를 씻어 바와 같이, 이전에 현미경 분석에 오랫동안 물에 섹션을 보관하지 마십시오.

8. Calcofluor 화이트 염색 9

  1. 0.2 % 주식 솔루션을 준비 증류수 10 ㎖에 (흰색 M2R calcofluor) 형광 증 백제 (28) 0.02 g을 녹이고. 0.2 % 용액은 4 ℃에서 어두운 병에 6 개월 동안 저장 될 수있다 증류수 0.2 % 스톡 용액을 10 배 희석하여 0.02 %의 작동 용액을 준비한다.
  2. 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 줄기 부분을 전송합니다. 0.02 %의 calcof의 관 1 ㎖에 추가luor 흰색 솔루션을 제공합니다. 부드럽게 위아래로 0.02 %의 calcofluor 흰색 솔루션을 피펫. 참고 :이 부분에 손상을 줄 수 있으므로 피펫 팁에 섹션을 피펫하지 않도록주의하십시오.
    1. 실온에서 5 분간 부화 및 피펫 팅을 반복한다. 실온에서 또 다른 3 분의 섹션을 품어. 참고 : 섹션이 쉽게 섹션을 손상시키지 않고 솔루션을 피펫 할 수 있도록 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
    2. 0.02 %의 calcofluor 흰색 용액 700 μl를 끌어와 증류수 700 μl를 추가하는 1 ㎖ 피펫을 사용하여; 5 분은 calcofluor 흰색 솔루션을 씻어 때까지 기다립니다. 세척 3 - 4 배를 반복합니다. 섹션 손상없이 용이하게 피펫 될 수있는 방법으로의 피펫 팁 컷으로 1 ㎖ 피펫을 사용합니다.
    3. 부드럽게 끝으로하고 현미경 슬라이드에 섹션을 피펫 커버 슬립로 커버. UV 빛 아래 부분을 확인하십시오.

9. 톨루이딘 블루전자 O 염색 16, 17

  1. 0.02 % 용액을 제조 100 ml의 증류수에 0.02 g의 톨루이딘 블루 O 녹여. NOTE : 톨루이딘 블루 O 용액을 실온에서 어두운 병에서 이주를 위해 저장 될 수있다.
  2. 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 줄기 부분을 전송합니다. 튜브에 0.02 %의 톨루이딘 블루 O 용액 1 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 0.02 %의 톨루이딘 블루 O 솔루션을 피펫. 그런 다음 5 분 동안 실온에서 배양하고 회 피펫 팅을 반복한다. 참고 :이 부분에 손상을 줄 수 있으므로 피펫 팁에 섹션을 피펫하지 않도록주의하십시오. 섹션이 정착 될 때까지 microcentrifuge 관이 아직도 서 보자. 이 솔루션은 어두운 상태로, 볼, 그래서 테스트 튜브 랙에 대한 섹션을 포함하는 튜브를 유지하고 실온에서 2 분 동안 정착 할 수 있도록하기 어려울 수 있습니다.
    1. 0.02 %의 톨루이딘 블루 O 솔루션 700 μl를 끌어낼 1 ㎖ 피펫을 사용합니다. 톨루이딘 블루 O 졸을 씻어 증류수 700 μl를 추가합니다의 ution. 3 - 4 배를 반복하거나 세척 솔루션까지 분명하다. 섹션들을 손상시키지 않고 용이하게 피펫 팅 될 수있는 방식으로 피펫 팁 잘라 1 ㎖ 피펫을 사용한다.
    2. 부드럽게 끝으로하고 현미경 슬라이드에 섹션을 피펫 커버 슬립로 커버. 명 시야 조명 아래 부분을 확인하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

임베딩 및 단면 줄기 :
포함 할 만든 플라스틱 금형의 사용은 아가로 오스 빠르고 쉽게 (그림 1) 입증 7 %에서 유래한다. 두 부분 (A와 B, 그림 1) 내장 된 유리 병 시스템은 간단한 쉽게 청소 시스템을 유지, 아가로 오스는 불활성 유리 병 부분에 충실하지 않는 한 아가로 오스에 포함 된 줄기를 해제 할 수 있습니다. 작은 유리 병 몇 년 동안 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 임베디드 줄기를 저장하는 편의는 다음 단계가 쉬워집니다. 언젠가 임베디드 비슷한을 저장하기 위해 줄기는 단면 처리에 대해 하나의 단면 판에 (최대 3 개) 그룹화 할 수 있습니다.

UV에서 방향족의 관측 :
줄기 부분은 유리 슬라이드에 증류수에 장착 UV 빛으로 관찰되었다. 세포에있는 리그닌을 포함하는 방향족 화합물은, UV 빛에서 자신의 형광도에 의해 시각하실 수 있습니다. 통 (XY)와 interfasci...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

A. thaliana의 줄기 부분 널리 이차 세포벽의 세포 조직을 연구하고 질적 야생형 및 트랜스 제닉 식물의 차이를 조사하기 위해 사용된다. 표본을 절편 일반적으로 사용되는 기술은 직접 손으로 절단하다; 표본이 아가로 오스 또는 정착에 포함 된 경우 나, 절편은 vibratome 또는 마이크로톰을 수행 할 수 있습니다. 한편 절단 달리, 마지막 두 단순히 샘플 및 요철 표면 사이의 두께 차이로 인한 잘못된 시료 준비에 의해 야기 될 샘플 간의 차이 부정확 제조 위험을 줄일 수있다. 이러한 방법들은 모두 장단점이 있습니다. 우리는 vibratome를 사용 구획 한 후, 아가 로스에 매립 선택하고, 다음과 같은 이유로 이렇게했다 : 신선한 조직의 정교한 처리의 필요성을 없애 매립 용이성과 시간을 사용하여 아가 로스에 보냈다. 또한, 직접 만든 금형 만들기 쉽고 저렴, 일을 보유 할 수전자 똑바로 줄기, 몇 년 동안 사용할 수 있으며, 혼잡하지 않고 표본을 쉽게 방출하는 데 도움이 될 수 있습니다. 높은 비율의 아...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 재정적 갈등이 없습니다.

감사의 글

우리는 편집에 도움 세이빈 러셀에 감사드립니다. 이 작품은 (http://www.jbei.org) 미국 에너지 부, 과학, 생물 환경 연구의 사무실, 사무실에서 지원하는 DOE BioEnergy 공동 연구소의 일부였다 로렌스 버클리 사이의 계약 DE-AC02-05CH11231 통해 국립 연구소와 미국 에너지 부.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아가로 스EMDMERC2125CAS 번호 : 9012-36-6
PhloroglucinolSigmaP 35021,3,5- 트리 하이드 록시 벤젠 [CAS 번호 : 108-73-6]
염산EMDHX0603-75CAS 번호 : 7647-01-0
수산화 암모늄EMDAX1303-6CAS 번호 : 1336-21-6
툴리딘 블루 O시그마T3260블루틴 클로라이드, 톨로늄 클로라이드 [CAS 번호 92-31-9] 
과망간산 칼시그마223468CAS 번호 7722-64-7 
에탄올 190 증명KOPTECV1401CAS 번호: 64-17-5
콩고 레드시그마 C6277디소듐 3,3'-[[1,1'-비페닐]-4,4'-디일비스(아조)]비스(4-아미노나프탈렌 1-설포네이트) [CAS 번호 573-58-0]
형광 증백제 28/ Calcofluor White StainSigmaF3543 4,4'- 비스 [[4- [비스 (2- 하이드 록시 에틸) 아미노] -6- 아닐리 노 -1,3,5- 트리아진 -2- 일] 아미노] 스틸벤 -2,2'- 디 술폰산 [CAS 번호 4404-43-7] 
VibratomeLeicaLeica 진동 칼날 마이크로톰 VT1000Shttp://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
RazorAmerican Safety 면도기 회사품목 # 60-0139-0000 스테인레스 스틸 더블 에지 블레이드 (Personna Super)
스크류 캡 마이크로 원심분리기 튜브 (2 ml)VWR16466-044
마이크로 원심분리기 튜브 (0.6 ml)Axygen ScientificMCT-060-C
미트Bel-Art380000000SCIENCEWARE  핫 핸드 프로텍터 미트
티슈 접착제Ted Pella Inc10033Store at 4 ° C 또는 20 ° C 3개월 이상 보관용
전자레인지PanasonicNN-SD762SPELCO Pro CA 44 인스턴트 티슈 접착제 
기계식 셔터가 없는 CCD 칩이 있는 카메라 하마마츠C4742-95
고속 컬러 카메라     Q이미징MicroPublisher 5.0 RTV
카메라 소프트웨어   Molecular DevicesMetaMorph 버전 7.7.0.0
Imagining anaylsis 어도비 포토샵 CS4
마이크로 커버 안경, 사각형, No. 1VWR48366-06722 x 22 mm (7/8 x 7/8")-커버 안경은 부식에 강하고 균일하게 두껍고 평평합니다. 1 번 두께는 0.13-0.17 mm입니다.
프로스트 마이크로 슬라이드, 1mmVWR48312-00375 x 25mm - 1mm
파라필름 M알칸 패키징BRNDPM998
TX2 필터 큐브라이카11513851/11513885560/40 대역 통과로 콩고 적색 분석에 사용됩니다.
륨

참고문헌

  1. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
  2. Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
  3. Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
  4. Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
  5. Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
  6. Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
  7. Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
  8. Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
  9. Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
  10. Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
  11. Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
  12. Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  13. Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
  14. Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
  15. Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
  16. Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
  17. Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
  18. Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
  19. Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
  20. Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
  21. Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
  22. Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

OMALS
의 조직 화학 염색
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.