여기에 프로토콜은 바이오 층 간섭과 단백질 - 단백질 상호 작용의 운동 분석을 설명합니다. 셀룰러 에너지 대사에 관여 F 형 ATP 합성 효소는, 세균에서의 ε 서브 유닛에 의해 억제 될 수있다. 우리는 ε의 억제 C-말단 도메인과 촉매 복합체의 상호 작용을 연구하는 바이오 층 간섭을 채택했다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 대장균 ATP 합성 효소의 촉매 복합체 소단위 ε의 억제 작용을 연구하는 바이오 층 간섭계를 사용하는 방법을 설명한다. 세균성 F 형 ATP 신타 약물 내성 결핵에 대처하기 위해 새로운, FDA 승인 항생제의 대상입니다. 서브 유닛 ε의 C-말단 도메인에 의해 ATP 합성 효소의 이해 박테리아 별 자동 억제 항균 약물의 발견을위한 효소를 표적으로하는 새로운 방법을 제공 할 수있다. ε의 C-말단 도메인은 활성 및 비활성 상태 및 촉매 사이트 리간드 간의 전이 효소가 우세한 ε의 배좌의 영향을 미칠 수있는 극적인 형태 적 변화를 겪는다. 간접적으로 ε의 바인딩 / 촉매 복합과 분리하고, MEA의 분석 측정 반응 속도슈어 분명히 nondissociable 억제 형태 및에서 효소 결합 ε의 변화. 바이오 - 레이어 간섭 신호는 용액 조성물에 지나치게 민감하지이므로도 ε의 형태 적 변화에 촉매 사이트 리간드의 알로 스테 릭 효과를 모니터하는데 사용될 수있다.
서론
단백질 - 단백질 상호 작용은 많은 생물 학적 과정에 중요하며, 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 같은 레이블의 광학 방법은 1 바인딩과 해리의 속도를 연구하기 위해 체외에서 사용되어왔다. 대부분의 라벨없는 방법은 센서면에 하나의 생체 분자를 고정화하고 고정화 한 생체 분자와 연관로서 용액으로부터 바인딩 파트너를 검출하는 광 신호를 사용한다. SPR은 매우 민감한 방법이지만,이 때문에 센서 (2)를 통해 흐르는 용액의 굴절률 변화에 간섭하는 경향이있다. SPR 바이오 층 간섭계 (BLI)만큼 민감하지가 적은 샘플 구성 1,3의 변화에 의해 영향을받지 않는다. BLI는 끝 독점 생체 적합성 코팅이 광섬유 바이오 센서를 사용합니다. (진수 RED96) 여기에 사용 된 시스템에 8 개의 분광 광도계가 포함되어 있습니다. 흰색 빛이 로봇 팔에 이동 프로브의 행으로 파이프됩니다. 광섬유 센서는 아칸소전자는 프로브에 의해 포착 및 샘플을 포함하는 96 - 웰 플레이트로 옮겼다. 표적 분자 중 하나는 바이오 센서 표면에 고정된다. 그런 다음 센서 솔루션의 결합 파트너를 포함하는 우물로 이동합니다. BLI는 고정 된 분자와 결합 파트너의 연결을 모니터링하고 바인딩 파트너없이 솔루션에 센서를 이동 한 후 해리를 모....
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프로토콜
1. BLI 분석 실험을위한 장비를 프로그래밍
램프가 예열 할 수 있도록 사전에 기기에 적어도 한 시간에 켜고,이 소음을 최소화하고 실험 기간 동안 광 신호에서 표류 할 필요가있다. 샘플 플레이트 홀더를 prewarm 악기 탭을 통해 원하는 온도를 설정합니다. 그런 다음 데이터 수집 소프트웨어의 실험적인 디자인을 설정합니다. 실험 마법사 탭에서 "새 속도론 실험"을 선택합니다. 이 정의해야하는 모든 단계에 탭 메뉴를 제공합니다.
1.1. 플레이트의 정의
96 - 웰 샘플 플레이트에 사용되는 열을 정의. 버퍼, 고정 된 단백질 또는 바인딩 파트너를 포함하는 열을 지정합니다. 각 웰 협회, 사용될 파트너 결합 농도를 입력한다. 참고 : 그림 2의 플레이트 정의가 서로 다른 분석을위한 옵션이 있습니다.
1.2. 분석의 정의
ontent "> 분석에 필요한 모든 단계를 정의합니다. 다음은 (내가)베이스 라인 (수), (II)로드, (ⅲ) 협회와 파트너를 바인딩 (IV) 해리 (가) 있습니다. 그런 다음, 아래에 설명 된대로, 개별 분석 단계를 링크 각각의 ....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
실시간 바인딩 및 해리 BLI의 반응 속도는 그림 3에 나와 있습니다. 이 실험은 협회와 해리의 분석 완충액으로 이루어졌다. 센서가 잠깐 동안 만 prewet했다 이후이 실험은 10 분 기준 단계를 시작했다. 다음으로, 비오틴 ε는 센서에로드했습니다. ε의 검출 가능한 해리은 바인딩 파트너가 추가되지 있었다 기준 곡선 (G)에서 본 나머지 모든 단계에 걸쳐 발생했습니다. 제 2 기준 센서 (H)가 고정화 단백질의 결여이고 결합 파트너의 낮은 비특이적 결합을 나타내었다. F 1 (-ε)의 다양한 농도는 전 세계적으로 결과를 맞게하고 케이, 케이 D 및 K D에 대한 최고의 가치를 얻기 위해 센서 AF 협회 단계에서 사용되었다. 결과는 그림 4의 데이터 트레이스 (파란색)를 산출 프로토콜로 처리했다. 이 경우, 기준 센서 추적 H는 샘플 TR로부터 감산 하였다바인딩 파트너 및 시스템 신호 드리프트의 비특이적 결합.......
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토론
BLI에 대한 현재 사용 가능한 장비는 생체 분자의 상호 작용에 대한 분석에 상당한 처리량과 유연성을 허용합니다. 각종 용액 시료 블랙 마이크로 타이 터 플레이트의 웰에 분배하고, 병렬 BLI 센서 세트는 플레이트에 웰의 열 사이에서 앞뒤로 이동하도록 프로그램되어있다. 시료는 분석을 통해 궤도 흔들어 교반. 여기에 사용 된 시스템은 8 센서를 가지고 있으며, 96 웰 샘플 플레이트를 사용하지만, 다른 시스템 (16) 센서와 384도 샘플 플레이트를 사용합니다. 따라서, 센서가 고정 된 생체 분자와 솔루션의 결합 파트너 사이의 상호 작용은 병렬로 여러 개의 센서와 다른 조건에서 테스트 할 수 있습니다. 예를 들어, 고정화 억제 ε 서브 유닛으로 여기에 제시된 제 분석에서, 상호 작용은 평행 효소 (결합 파트너)의 여섯 가지 농도의 측정 (도 3 및 4) 하였다. 이것은 도전 분석 determi 허용NE에 대한 속도 상수의 단일 쌍 (A, K
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공개 사항
저자는 관심 없음 충돌이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
우리는 그림 1에 사용 된 그래픽을 제공 FortéBio 감사합니다. 이 작품은 TMD에 NIH 교부금 GM083088에 의해 지원되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 옥텟-RED96 | Pall/Forté Bio | 30-5048 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | A6003-10G | 지방산 무료 |
| 바이오센서/스트렙타비딘 | Pall/Forté Bio | 18-5019 | 96개 센서 |
| 트레이 Microtiter 플레이트 | Greiner Bio-one | 655209 | Black, 폴리프로필렌 |
| 데이터 수집 소프트웨어 | Pall/Forté Bio | Version 6.4 | 최신 버전 사용 가능 |
| 데이터 분석 소프트웨어 | Pall/Forté Bio | 버전 6.4 | 최신 버전 사용 가능 |
참고문헌
- Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis. Biosensors. 1, 70-92 (2011).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 5....
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재인쇄 및 허가
