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방법 논문

캡처 복합 질량 분석 - 소설의 C 디 GMP 이펙터 단백질을 식별 할 수있는 강력한 도구

11.2K 조회수

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DOI:

10.3791/51404

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2015년 3월 29일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum of the University of Basel, 2Proteomics Core Facility, Biozentrum of the University of Basel

이 논문에서

요약

유비쿼터스 두 번째 메신저 c-di-GMP는 많은 박테리아의 성장과 행동을 제어합니다. 당사는 거의 모든 박테리아 종에서 c-di-GMP 결합 단백질을 생화학적으로 식별하고 특성화하기 위해 새로운 Capture Compound Mass Spectrometry 기반 기술을 개발했습니다.

초록

상당한 진전은 제 메신저 C 디 GMP의 합성 (diguanylate cyclases) 열화 (포스 포)에 관여하는 효소의 확인 및 특성화를 향해 지난 10 년 동안 만들어졌다. 대조적으로, 약간의 정보가이 시그널링 분자가 세포 과정의 다양한 범위를 조절하는 분자 메커니즘을 통해 세포 성분과 관련하여 가능하다. 알려진 이펙터 단백질의 대부분은 필츠 (Pilz) 가족에 속한다 또는 촉매를 포기하고 이펙터 기능을 채택했다 diguanylate cyclases 또는 포스 포 디에스 퇴화된다. 따라서, 더 나은 실험 방법은 실리코 예측의 신뢰성이 실패하는 신규 이펙터를 식별하고 검증하는 데 필요한 박테리아 광범위 셀룰러 C 디 GMP 네트워크를 정의한다.

우리는 최근에 강력한 도구로 새로운 캡처 복합 질량 분석 (CCMS) 기반 기술을 개발했다생화학 적 식별 및 C 디 GMP 결합 단백질을 특성화. 이 기법은 이전에 하나의 유기체에 적용 가능한 다양한 것으로보고되었다. 여기서 우리는 이러한 신호 성분을 프로빙 이용하는 프로토콜의 자세한 설명을 제공한다. 예로서, 우리는 녹농균, C 디 GMP는 병독성 및 생물막 제어에 중요한 역할을하는 기회 적 병원균 사용. CCMS는 C 디 GMP 네트워크의 공지되거나 예측 된 성분의 74 % (51분의 38)를 식별. 본 연구는 상세히 CCMS 절차를 설명하고, 소분자 시그널링에 관련된 신규 한 구성 요소를 식별하기위한 강력하고 다양한 도구로 정한다.

서론

C 디 GMP 그들의 성장 및 행동의 다양한 측면을 제어하기 위해 사용되는 대부분의 세균에 의해 두번째 키 메신저. 예를 들어, C-디 GMP는 세포주기 진행, 운동성 및 엑소 폴리 사카 라이드 및 표면 adhesins 2-4의 발현을 조절한다. 이러한 프로세스의 조정을 통해 C 디 GMP는 biofilm 형성, 병원성 박테리아 5의 범위의 만성 감염과 관련된 프로세스를 촉진합니다. C 디 GMP는 촉매 GGDEF 도메인 4 항구 diguanylate cyclases (DGCs)라는 효소에 의해 synthetized된다. 일부 DGCs 다운 C-GMP 디 바인딩시 클라 제 활성을 조절하는 사이트 억제을 갖는다. C 디 GMP의 분해는 촉매 EAL 또는 HD-GYP 중 도메인 6,7 숨겨 포스 포의 두 가지 클래스 (PDE는)에 의해 촉매된다.

직접 C 디 GMP 결합 공지 효과기 단백질의 대부분은 단백질의 세 개의 클래스 중 하나에 속한다 : 촉매를동맹 비활성 GGDEF 또는 EAL 도메인과 필츠 (Pilz) 도메인, C 디 GMP 8 바인딩에 따라 구조 변화를 받아야 작은 분자 스위치. DGCs, PDE는 필츠 단백질은 잘 특징과 도메인은 상대적으로 안전하게 실리에 예측할 수있다. 특히 관심은 이제 C 디 GMP 이펙터의 새로운 클래스의 식별에 초점을 맞추고 있습니다. 다른 바인딩 모티브 일부 C 디 GMP 이펙터는 부르크 홀데 리아 cenocepacia에서 CRP / FNR 단백질 가족 Bcam1349 또는 P.의 전사 조절 FleQ로 최근에 이러한 설명했다 녹농균 (9, 10). 또한, C-GMP 디 특정 리보 스위치 최근 식별과 C 디 GMP 의존적 11 유전자 발현을 제어하는 것으로 나타났다. 다른 이펙터의 C 디 GMP 바인딩 모티브는 제대로 보존 된 단백질의 생물 정보 학적 예측을 어렵게하고있다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 C 디 GMP의 SPE의 사용에 기초 생화학 방법을 개발cific 캡처 화합물은 질량 분석 1,12,13과 함께.

우리는 최근 (CDG-CC, 그림 1) 새로운 가의 C 디 GMP 캡처 화합물을 설계 한 일. 이 화학 골격이 구성된다 결합 단백질 C 디 GMP를 캡처 미끼로 이용 1) C 디 GMP 잔기, 2) UV-광활성 반응성 기는 링크 크로스를 사용 결합 단백질 CDG-CC 및 3) 비오틴 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 자성 비드를 이용하여 캡쳐 된 단백질을 분리. CDG-CC 직접 구체적 세포 용 해물과 같은 거대 분자의 복합체 C로부터 디 GMP 이펙터를 캡쳐 할 수있다. 캡처 계 화합물 및 화학 프로테오믹스 기반 방식은 이전 생물 광범위한 적용 것으로보고 된 예 Caulobacter crescentus, 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리엄 및 P. aeruginosa의 1,14.

이 방법론 논문에서,우리는 P. 추출물을 사용 CCMS 절차의 깊이 설명에 제공 예를 들어 녹농균. 이 연구는 생화학 적으로 작은 분자 신호 전달에 관여하는 새로운 구성 요소를 식별 할 수있는 강력하고 다양한 도구로 CCMS를 설정합니다.

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프로토콜

1. 해물 준비

  1. P. 성장 원하는 OD에 LB에 루기 노사 세포.
    참고 : 지침 : 로그 상 문화에 대한 고정 위상 문화에 대한 ≈ 100 ml의 문화 / 샘플 ≈ 500㎖의이 배양 / 샘플 (외경 600 ㎚ = 0.5)를 사용합니다.
  2. 5,000 x g에서 20 분 동안 원심 분리하여 펠렛.
  3. 재현 탁 0.5 ~ 1 ml의 용해 버퍼에 펠렛의 g (6.7 MM의 MES, 6.7 mM의 HEPES, 200 mM의 NaCl을, 6.7 mM의 한국 공항 공사, DDT 1 ㎜, pH를 7.5)와 단백질 분해 효소 억제제 (완전 미니, EDTA 무료)를 추가 할뿐만 아니라 DNaseI있다.
  4. 를 Lyse 20,000 psi에서 프랑스의 압력 셀을 통해 3 통로에 의해 세포 (자료 목록 참조).
  5. 초 원심 분리기 4 ° C에서 1 시간 동안 100,000 x g에서 세포 용 해물.
  6. 뜨는을 저장 (2 단계로 이동합니다).
  7. 피펫 팅 아래에 의해 용해 버퍼 1 배 1 mL를 펠렛을 씻으십시오.
  8. 초 원심 분리기 4 ℃에서 1 시간 동안 100,000 x g에서.
  9. 에 펠렛을 플래시 동결막 단백질 (단계 3 참조)의 포착을 위해 사용될 때까지 -20 ℃에서 액체 질소 저장.

C 디 GMP 무료 및 기타 뉴클레오티드 2. 제거 (가용 분 만 해당)

  1. 차가운 용해 완충액 10 mL로 PD10 탈염 컬럼 (참조 자료 목록)를 씻으십시오.
  2. 뉴클레오티드를 제거하기 위해 상등액 PD10 상 (≈ 1 ml)에 붓는다.
  3. 4 ml의 차가운 용해 완충 용액 (500 μL 단계)로 용출시켰다.
  4. 브래드 포드 분석에 의해 결정되는 곳 분수를 선택하고 그들을 풀.

3. 펠렛의 재 부상과 가용화 (막 분수 전용)

  1. (세제)없이 1X 캡쳐 버퍼 500 μl에 1,000에 펠렛을 재현 탁 (표 1 참조).
    참고 : 펠릿 재현 탁하기 어렵다. 대략 잘 솔루션을 균질화 주사기 (27) G를 사용 후, 펠렛을 재현 탁에 그것은 피펫 먼저 피펫 최대 및 아래 좋습니다.
  2. 1 % 추가 (W / V) N 도데 실-β-D-maltopyranoside (DDM).
  3. 회전 바퀴에 적어도 2 시간 (또는 O / N) 4 ° C에서 품어.
  4. 초 원심 분리기 4 ℃에서 1 시간 동안 100,000 x g에서.
  5. 뜨는을 수확.

4. 단백질 농도 측정

  1. (막 분획에 대한 분석으로 BCA) 브래드 포드 분석으로 단백질 농도를 측정한다.
  2. 10 ㎎ / ㎖에 총 단백질 농도를 설정합니다.

5. 캡처

  1. GDP, GTP, ATP, CTP의 1 ㎜, 5 배의 캡처 버퍼 (100 mM의 HEPES, 250 mM의 한국 공항 공사, 50 mM의 MgAc, 5 % 글리세롤, 산도 7.5) (표 1) 20 μL와 단백질 300 μg의 혼합. H 2 O. 100 μL에 대한 반응 볼륨을 조절
    주 : 전량 경쟁 제어시 CDG 및 C-CC 디 GMP의 볼륨을 포함한다 (단계 5.3 및 표 2 참조).
    참고 : 모든 실험은 200에서 수행되었다# 181; L (12) 튜브 PCR 스트립 (온도 과학).
    참고 : 막 분획을 위해, 항상 임계 미셀 농도 (8) M 우레아의 단백질 가용화 단계까지 (7.1 단계) (V / W 0.01 %) 이상 DDM 농도를 유지해야합니다.
  2. 회전 바퀴에 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
  3. 10 μM C​​DG-CC (최종 농도)를 추가합니다.
    주 : ( "비드 제어"로 칭함) CDG-CC없이 제어하고, 1 mM의 C 디 GMP ( "대회 관리")가 보충 된 제어를 포함 (표 2 참조).
    주 : CDG-CC 농도는 1 내지 10 μM로 조절 될 수있다.
  4. 어둠 속에서, 회전 바퀴에 적어도 2 시간 (O / N의 막 분획) 4 ° C에서 품어.
  5. CaproBox를 사용하여 4 분 동안 자외선과 CDG-CC의 반응 부분의 활성화에 의해 짧은 스핀, 크로스 링크, 후 (소스 = 310 nm의, 조도 ≥10 mW의 / cm² 이상, 거리 재료 목록을 참조 λ = 2cm). 주 : 스트립 가교 결합 전에 뚜껑을 제거합니다.
  6. 부드럽게 균질화, 25 ㎕의 5 배 세척 버퍼 (5 M의 NaCl 250 mM 트리스, 산도 7.5) 잘 재 부유 스트렙 타비 딘 자석 구슬의 50 μl를 추가합니다.
  7. 회전 바퀴에 1 시간 동안 4 ° C에서 품어.

6. 세척 단계

참고 : (자석 : 재료 목록 참조). 자석 PCR 스트립 뚜껑에 자석 구슬의 캡처, 시작합니다. 그 다음 세척 용액을 포함하여 새로운 PCR 스트립을 대체. 자석을 제거하고 구슬을 재현 탁하고, 2 분을 품어. 스핀 다운과 신선한 뚜껑으로 뚜껑을 교체합니다.

  1. 세척 단계 (가용 분획 만)
    1. 200 μL 1X 세척 버퍼에 6 회 반복한다.
    2. 200 μL를 HPLC 등급 H 2 O에 한 번 세척
    3. 200 μL 80 % 아세토 니트릴 6 회 반복한다.
    4. 200 μL를 HPLC 등급 H 2 O 2 회 반복한다
  2. 세척 단계 (membra북동 부분 만)
    1. + 0.1 % DDM 200 μL 1X 세척 버퍼에 5 회 반복한다.
    2. + 0.05 % DDM 200 μL 1X 세척 버퍼하는 과정을 2 회 반복한다.
    3. + 0.025 %의 DDM 200 μL 1X 세척 버퍼에 한 번 씻으십시오.
    4. + 0.0125 %의 DDM 200 μL 1X 세척 버퍼에 한 번 씻으십시오.
    5. 200 ㎕의 100 mM의 ABC에서 3 회 반복한다 (탄산 수소 암모늄, NH 4 CO 3) + 2 M 우레아.

7. MS 샘플 준비

  1. 20 μl의 100 mM의 ABC (막 분획에 대한 + 8 M 우레아 100 mM의 ABC)에 (직접 뚜껑) 구슬을 재현 탁 1.5 ml의 튜브에 전송합니다.
  2. 막 분획은 500 rpm으로 흔들면서 5 분 동안 60 ℃에서 배양한다.
  3. 200 mM의 TCEP (트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀) 0.5 μL를 첨가하고, 500 rpm으로 흔들면서, 60 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. 25 ℃로 냉각시킨다.
  4. 를 떨고, 요오도 아세트 아미드 새로 제조 된 400 mm의 0.5 μl를 추가하고 30 분 동안 25 ° C에서 배양500 rpm으로 어둠 속을 t.
  5. 0.5 ㎕의 0.5 M N의 아세틸 시스테인을 추가하고 500 rpm으로 진탕, 10 분 동안 25 ° C에서 품어.
  6. 막 분획 만 : 1 μL리스-C를 추가하고 37 ° C, O / N 품어.
  7. 2 μg의 트립신을 추가하고 500 RPM (건조를 방지하기 위해 파라 필름에 포장) 진탕, 37 ° C에서 O / N을 배양한다.
    주 : 샘플이 단계에서 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
    참고 : 막 분수는 : 트립신을 첨가하기 전에 <2 M의 요소 농도를 조정하는 100 mM의 ABC를 추가합니다.
  8. 간단히 튜브를 스핀 다운 자석 구슬을 수집합니다.
  9. 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송 (구슬이 남아있는 경우이 단계를 반복).
  10. 5 μL 5 % TFA (트리 플루오로 아세트산) + 1 μL 2 M 염산 (막 분획 15 ㎕의 5 % TFA + 5 μL 2 M 염산)를 추가합니다.
  11. 조건 C18를 MicroSpin 열 μL 아세토 니트릴 150 (둥지 그룹, MA, USA) (스핀 2,400 rpm에서 20 초).
  12. 동등0.1 % TFA (스핀 20 초, 2,400 RPM) μL C18 컬럼 (150)와 2 번 librate.
  13. 샘플을 넣고 2 분, 2,000 rpm으로 스핀.
  14. 흐름을 통해 열 상을 다시 넣고 회전 단계 (2 분, 2,000 RPM)를 반복합니다.
  15. 0.1 % TFA μL (150)로 3 회 세척, 5 % 아세토 니트릴 (20 초, 2,400 RPM).
  16. 새로운 튜브를 취하여 150 μL, 0.1 % TFA 회 용리, 50 % 아세토 니트릴 (2 분, 2,000 RPM).
  17. 속도 진공 청소기의 펩티드를 건조.
  18. 40 μL의 98 % H 2 O 2 % 아세토 니트릴, 0.15 % 포름산에서 재현 탁.
  19. 초음파 처리 20 초 (펄스주기 0.5, 진폭 100 %; 재료 목록 참조), 5 초, 12,000 RPM (벤치 탑 원심 분리기)를 스핀 다운. 소용돌이 10 초, 5 초, 12,000 rpm으로 스핀 다운. LC-MS / MS 분석을위한 HPLC 바이알로 옮긴다.
  20. -20 ° C에서 동결.
    주 : 샘플이 단계에서 -20 ℃에서 저장 될 수있다.

8. LC-MS / MS 분석

  1. 나노 LC를 실행 (나노 LC 시스템) equippRP-HPLC 컬럼 (75 μm의 X 37cm) C18 수지 충전과 ED (매직 C18 AQ이 3 μm) 95 % 용매 A (0.15 % 포름산, 2 % 아세토 니트릴), 5 % 용매 B의 선형 구배를 사용하여 ( 0.2 μL / 분의 유속으로 60 분에 걸쳐 용매 B 35 % 98 % 아세토 니트릴, 0.15 % 포름산).
  2. (전기 분무 이온 원에 연결된 이중 - 압력 LTQ Orbitrap Velos 질량 분광계) LC-MS / MS를 이용하여 펩티드를 분석한다.
    주 : 데이터 수집 모드는 MS가 (20)에서 가장 강한 이온의 선형 이온 트랩에 MS / MS 스캔이어서 60,000 FWHM의 해상도 질량 분석기의 FT 부 스캔 한 고해상도를 수득 하였다. MS / MS 시도의 효율을 높이기 위해 충전 상태 스크리닝 잠정은 미사용 배제하는 것을 가능하게하고, 단독 이온을 충전 하였다. 전구체 100 이온 수를 초과 할 때 담합에 의한 분해가 트리거했다. 동적 제외 기간은 30 초로 설정 하였다. 이온 축적 시간은 300 밀리 초 (MS) 및 (50)에 설정된밀리 초 (MS / MS).

9. 데이터베이스 검색

  1. P. 다운로드 aeruginosa의 NCBI 데이터베이스 NCBI 홈페이지를 통해 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
  2. MassMatrix 변환 도구 (사용 마스코트 일반 파일에 MS 원시 스펙트럼 (MGF) 변환 http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py을 ).
  3. P.에 대해 마스코트 버전 2.3을 사용하여이 MGF 파일을 검색 앞으로 함유 역 미끼 단백질 항목 aeruginosa의 NCBI 데이터베이스.
  4. 두 개의 완전히 트립신 펩티드의 분열을 놓친 용인 (프롤린 뒤에 제외) 리신과 아르기닌 후 실리 트립신 소화를 수행합니다.
  5. 변수 수정 및 고정 수정과 같은 시스테인 잔기의 carboxyamidomethylation (57.021464 다)와 같은 산화 된 methionines (15.99491 다)를 허용하는 데이터베이스 검색 매개 변수를 설정합니다. 마스코트 우리를 검색을위한고해상도 스캔을 보내고, 15 ppm으로 전구체 물질 허용 오차를 설정하고 다 0.6 단편 질량 허용 오차를 설정합니다. 마지막으로, 1 %에 단백질 FDR을 설정합니다.
  6. P.의 마스코트 검색을 가져 오기 비계 (Proteomesoftware, 버전 3)에 루기 노사 CCMS 실험은, 1 % 단백질 FDR 가까이를 취득하고, 총 스펙트럼 수를 추출하는 매개 변수를 설정합니다.
  7. 대표적인 결과는 본 논문에서는, 우리는 경쟁 제어 실험을 비교하는 쌍 T 테스트를 사용하고, 0.1 이하의 p 값, 2 (스펙트럼 수를 실험 / 경쟁 제어 스펙트럼 위의 스펙트럼 카운트 비율 안타를 고려 카운트).
  8. 데이터는 추가 분석을 위해 스프레드 시트 소프트웨어에서 내보낼 수 있습니다.

10. 레이블이없는 정량화

  1. Progenesis LC-MS 소프트웨어 (비선형 역학, 버전 4.0)에 원시 파일을 가져옵니다.
  2. 기본 setti에서 LC-MS 배향 및 특징 검출을 수행NGS.
  3. Progenesis LC-MS에서 MGF 형식으로 데이터를 내 보냅니다.
  4. NCBI P. 대하여 MASCOT를 사용 MS / MS 스펙트럼을 검색 앞으로 함유 역 미끼 단백질 항목 aeruginosa의 데이터베이스.
  5. Progenesis LC-MS로 데이터베이스 검색 결과를 가져 오기 및 MS1 기능에 펩티드의 식별을 매핑합니다.
  6. (0.1 이하, Q 값, 상기 2 스펙트럼 계수 비 임계) 데이터 평가 (유의 수준의 계산식 폴드 변경 비율)의 내용 SafeQuant ProteinSQAnalysis 스크립트를 사용 하였다.

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결과

P.에 새로운 C 디 GMP 이펙터를 확인하려면 aeruginosa에 우리는 체계적으로 P.의 가용성과 막 분수를 분석하는 CCMS를 사용 로그 상 문화 루기 노자 균주 PAO1 (OD = 0.5 (600)). 여기에서 우리는 요약하고이 낚시 원정대의 대표적인 결과에 대해 설명합니다. 네 개의 독립적 인 생물 복제를 사용 하였다. 각 실험을위한 두 가지 CDG-CC 농도 (5 μM 및 10 μM)을 사용 하였다. 특이성 프로브, 실험 (표 1) (즉, CDG-CC)없이 비드 제어 최종적 1mM의 경쟁자로서 C 디와 GMP의 존재 또는 부재하에 수행 하였다.

(도 2) 위에 상세히 설명하면 다음과 같은 방법을 우리는 비계 형식으로 캡처 단백질의 목록을 생성했다. 가능성 오염 물질을 제거 하였다. 이 리보솜 단백질, 스트...

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토론

특별한주의가 프로토콜의 여러 단계에서주의해야한다. 단백질 농도가 10 ㎎의 농도를 갖는 중요한 파라미터이다 / ml의 세포가 특정한 성장 조건 (예를 들면 작은 콜로니 생물막 또는 변이체) 하에서 성장 될 때 도달하기 힘들어. 따라서, 펠릿 부유 용균 완충액 저용량에서 수행되어야한다. 단백질 농도는 8 ㎎ / ㎖로 감소 될 수있다. Nesper 외. (1)에 의해 게시 된 방법과 비교하여, 우리는 뉴클레오티드 결합 단백질의 비특이적 포획을 최소화하기 위해 캡처 반응물에 다양한 뉴클레오타이드를 첨가. 뉴클레오티드 첨가 특이성을 개선하지만, 동시에 동일한 사이트의 서로 다른 뉴클레오티드 결합 단백질의 포착을 방지 할 수있다. 예를 들어 최근에 도시 된 효과기 FleQ는 ATP와 결합하는 C 디 GMP D 18 이상으로 한 우리의 이전의 실험에서 ATP의 부재하에 구체적 고기 잡이 아닌시켰다ATA ATP의 과잉 존재하에 여기에 제시된.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

녹농균에 대한 CCMS 조건을 최적화한 Alberto Reinders에게 감사드립니다. 우리는 또한 녹농균(P. aeruginosa) 단백질의 주석에 대해 Pablo Manfredi에게 감사를 표합니다. 이 작업은 스위스 국립과학재단(SNF)의 Sinergia 보조금 CRSII3_127433의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
caproBoxcaprotec bioanalytics1-5010-001 (220 V)UV 램프, 냉각 96-플레이트 냉각 블록에 연결, 광활성화를 위한
caproMagcaprotec bioanalyticsCCMS 스타터 키트에 포함되어 있습니다.를 피펫팅하지 않고 자성 입자를 쉽게 취급할 수 있습니다
. 요청 시 caproKit caprotec bioanalytics키트에는 c-di-GMP-capture 화합물, c-di-GMP(경쟁 제어용), streptavidin 코팅된 자성 비드, capture buffer, 그리고 세척 buffers가 포함되어 있습니다.
일회용 PD-10 탈염 컬럼GE Healthcare17-0851-01 
12-튜브 PCR 스트립Thermo ScientificAB-1114
UIS250v 초음파 발생기 VialTweeterHielscher 초음파 기술UIS250v 및 VialTweeter
소형 프랑스어 압력 셀Thermo Electron CorporationFA-003
c-di-GMP

참고문헌

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  3. Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
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c di GMPPseudomonas aeruginosaPD 10UV
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