Method Article

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

DOI:

10.3791/51416

⸱

July 1st, 2014

 , 
1CEA, DSV, IG, Genoscope, 2CNRS-UMR8030, Évry, France, 3Université d'Évry Val d'Essonne, 4Massachusetts General Hospital Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

Abstract

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환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확하게 질량 분석기를 사용하여 샘​​플 간의 단백질 발현 차이를 정량화하는 방법입니다. REDI 라벨은 각각의 유리 아민에 두 개의 메틸 그룹을 추가하기 위해 정기적 (빛) 또는 포름 알데히드와 나트륨 시아 노보로 하이드 라이드의 중수 (무거운) 양식을 사용하여 수행됩니다. 여기에서 우리는 REDI 표시와 복잡한 단백질 혼합물의 정량 비교를위한 강력한 프로토콜을 보여줍니다. 비교를 위해 단백질 시료는 빛 또는 무거운 메틸 태그, 혼합하고, LC-MS/MS 공동 분석 중 하나를 수행하는 레이블 펩타이드로 분해된다. 상대 단백질의 개체수는 전체 MS 스펙트럼에서 추출 된 성분 펩타이드의 무겁고 가벼운 표시된 버전의 이온 크로마토 그램의 피크 면적을 비교하여 정량화. 여기에서 설명하는 방법은 샘플 역상 고상 추출에 의한 제조, 펩타이드에 열 REDI 라벨, 기본 산도 회전에 의해 펩타이드 분획을 포함ersed 상 (BPRP) 크로마토 그래피 StageTip 펩티드 정제. 우리는 안정 동위 원소의 설립을위한 다른 방법에 대한 REDI 라벨의 장점과 한계에 대해 설명합니다. 우리는 샘플의 거의 모든 종류의 단백질의 개체수를 비교하는 빠르고, 저렴하고 정확한 방법으로 REDI 라벨을 사용하여 새로운 응용 프로그램을 강조 표시합니다.

Introduction

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복잡한 시료 사이에 많은 단백질의 농도 차이를 측정하는 것은 단백질 체학의 중심 과제이다. 점점이 서로 다른 동위 원소의 태그를 각 샘플에서 단백질을 라벨 샘플을 결합하고, 농도의 차이를 정량화하기 위해 질량 분석기를 사용하여 수행되고있다. 몇 가지 방법은 단백질과 펩타이드의 안정 동위 원소 표지 존재한다. ICAT 3, iTRAQ 4, 환원 디메틸 화 5 단백질 추출 및 소화 후 안정 동위 원소의 태그를 추가하는 반면 15 N 표시 1 SILAC 2, 생체 내에서 대사 동위 원소 라벨을 소개합니다. 이러한 방법 중에서, 환원 디메틸 화 (REDI 라벨링)는 샘플의 거의 모든 종류의 단백질 농도 차이를 정량화 할 수있는 저렴하고 재현성있는 방법으로 인기를 얻고있다.

REDI 라벨은 감소 쉬프 기반을 형성하는 포름 알데히드와 반응 펩티드를 포함노보로 하이드 라이드로. 이 반응은 N-말단 및 리신 측쇄 monomethylates 및 N-말단에 프롤린 자유 아미노기를 dimethylates. 여기에 설명 된 프로토콜은 중수 소화 포름 알데히드와 노보로 하이드 라이드 (그림 1)를 사....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고 :이 방법은 이전에 12를 설명했다.

1. 단백질 분리

바람직하게는 프랑스어 프레스, 구슬 박동, 또는 초음파 등의 물리적 방법에 의해, 용해하는 세포에 의해 세포 단백질의 1 밀리그램을 준비합니다. 효소 질량 분석 측정을 혼동하기 때문에 라이소자임 - 매개 세포 용해를 방지.

단백질의 2. TCA 강수량

단백질을 침전 10 분 동안 얼음에 4 권의 단백질과 진정으로 1 볼륨 트리클로로 아세트산 (TCA)를 추가합니다. 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 12,000 XG에 상층 액을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 12,000 XG에 얼음처럼 차가운 아세톤 및 원심 분리기 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁 상층 액을 제거하고 15 분 동안 펠렛을 건조 벤치에 튜브를 반전. -80 ° C에서 저장 단백질 펠렛

3. 변성 단백질과 이황화 채권을 감소

다시단백질을 중단 500 ㎕의 변성 및 감소 버퍼에 1 ~ 2 ㎎ / ㎖ (50 mM의 HEPES 산도 8.5, 5 mM의 DTT ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 사카로 마이 세스 세레 비시 애를 사용하여 정확도, 정밀도 및 REDI 라벨의 재현성을 평가하고 클로 스트 리듐 속의 세균은 전체 세포 용 해물을 phytofermentans. 우리는 먼저 C의 혼합의 REDI 라벨의 효율성을 정량화 셀룰로오스 (무거운 표시, H)과 포도당 (빛 라벨, L) 문화에서 단백질 해물을 phytofermentans. 1 %의 펩타이드 거짓 발견의 속도로 여과 할 때,이 샘플은 98 % REDI 라벨 효율 11194 독특한 펩타이드 서열을 포함. 미분 획 S. 사카로 마이 세스 세레 비시 애 단백질 용 해물은 마찬가지로, H 또는 L로 표지 시약 다양한 비율로 혼합하고, 분석 하였다. 단백질 발현의 차이 ()이 (중앙값 MS1 피크 구역 로그) 재현성 H 및 L 샘플 비율 (도 3)를 혼합하는 넓은 범위에 걸쳐 혼합 하였다되는 비율을 반영한다. 특히.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

높은 저렴한 라벨 시약 (시약은 샘플 당 1 달러 미만의 비용), 빠른 반응 속도 (~ 10 분), 부산물의 부재 : 몇 가지 점은 양적 proteomics의 매력적인 방법 환원 디메틸 화 (REDI 라벨)를 사용하여 펩티드의 안정 동위 원소 라벨링을 재현성 (도 3,도 4), 안정적인 반응 생성물, 임의의 단백질 분해 효소를 사용하는 능력 및 표지 된 펩티드의 높은 이온화 효율. 이 합성 중간에 특정 아미노산 auxotrophies 또는 성장 균주 또는 세포 라인을 필요로하지 않기 때문에 REDI으로 화학 라벨은 또한 신진 대사 라벨에보다 유리하다. 이와 같이, 한 Redi 근소 돌연변이 균주가 다른 15 사이, 13과 인간 줄기 세포 14 사용할 수있는 신규 한 미생물 (12)를 포함하여 단백질 시료의 거의 모든 타입에 적용될 수있다.

REDI 라벨의 한계는 오티에.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 재정적 이익 또는 그 밖의 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

도움과 안내를 해주신 SP Gygi와 GM Church에 감사드립니다. 이 작업은 ACT에 대한 CNRS chaire d' excellence의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
트리클로로 아세트산Sigma-AldrichT9159단백질 침전
아세톤Sigma-Aldrich650501단백질 침전
데실 황산나트륨Sigma-Aldrich71736변성, 단백질 감소
수산화나트륨Sigma-AldrichS8045변성, 단백질
DL-Dithiothreitol감소Sigma-Aldrich43816변성, 감소, 알킬레이트 단백질
프로테아제 억제제 완전한 미니 칵테일Roche4693124001변성, 단백질
감소 요오도아세트아미드Sigma-AldrichI6125알킬레이트 단백질
HEPES시그마-알드리치H7523재현탁, 추출물, 라벨 단백질
염화칼슘시그마-알드리치C5670단백질 재현탁
Lysyl EndoproteaseWako Chemicals129-02541단백질 분해
퀀싱 등급 트립신PromegaV5111단백질 분해
아세트산Sigma-Aldrich320099단백질 분해
Trifluoroacetic acidSigma-Aldrich299537역상 펩타이드 추출
tC18 Sep-Pak C18 카트리지WatersWAT054960역상 펩타이드 추출
추출 매니폴드WatersWAT200609역상 펩타이드 추출
아세토니트릴시그마-알드리치14261다양한
포름알데히드시그마-알드리치252549" 빛" 펩타이드 라벨링
시아노보로하이드라이드시그마-알드리치71435" 빛" 펩타이드 라벨링
중수소화 포름알데히드시그마-알드리치492620" 무거운" 펩타이드 라벨링
시아노보로듀테리드나트륨CDN 동위원소D-1797" 무거운" 펩타이드 라벨링
MESSigma-AldrichM3671펩타이드 라벨링
C18-HPLC 컬럼 (4.6 x 250 mm, 5 µ m 입자 크기)Agilent770450-902기본 pH 역상 크로마토그래
포름산Sigma-Aldrich399388다양한
C18 Empore 디스크3M14-386-3 STAGE 팁
메탄올시그마-알드리치494437STAGE 팁
도 시피

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
  2. Ong, S. -E., Blagoev, B., et al.

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Reductive DimethylationStable Isotope LabelingQuantitative ProteomicsPeptide FractionationLC MS MS AnalysisSolid Phase ExtractionBasic pH Reversed Phase ChromatographyStageTip PurificationMass Spectrometry QuantificationProtein Abundance Comparison

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