애벌레 Zebrafish의 척수 절개

요약

척추 절개 한 후, 성인 zebrafish의 육주 후 손상에 의한 기능 회복이있다. 유생의 투명성과 빠른 복구를 이용하려면, 우리는 애벌레 척수에 병행하는 방법을 제시한다. 절개 한 후, 우리는 3 일 후 부상으로 이일 후 상해에서 시작 감각 회복을 관찰하고 C-굴곡 운동.

초록

포유 동물에 의한 부상의 수준 이하로 축삭 재성장의 부족뿐만 아니라 척추 신경을 재개하는 무능력에 척수 손상을 다음과 감각과 운동 회복에 실패합니다. 그러나, 척수의 완전 절개 후 감각과 기능 회복을 모두 제브라 다니오의 rerio 전시 등 일부 anamniotes. 성인 zebrafish의 6 주 후 부상으로 감각과 운동 회복, 척수 손상 후 재생을 연구하기위한 설립 모델 생물이다. 투명 애벌레 제브라 피쉬에서 사용할 수있는 재생 과정의 생체 내 분석의 장점뿐만 아니라 성인의 유전 도구에 액세스 할 수 없습니다를 사용하려면, 우리는 척수를 절단 한 후 재생을 연구하는 애벌레 제브라 피쉬를 사용합니다. 여기에서 우리는 재생 가능하고 검증 가능한 애벌레 척수에 병행하는 방법을 보여줍니다. 절개 한 후, 우리의 데이터도 2 일 후 부상 수 (dpi)에 감각 복구 시작을 보여줍니다, 재치H 3 dpi로 5 dpi로 무료 수영의 재개에 의해 검출 C-굽힘 운동. 따라서 우리는 척수 손상 후 복구의 연구를위한 성인 제브라 피쉬에 동반자 도구로 애벌레 제브라 피쉬를 제안한다.

서론

인간의 척수에 큰 외상은 종종 인해 축삭을 자라게 또는 신경 ^1,2를 재개 할 수 없다는으로, 영구적 인 마비와 부상의 수준 이하로 감각의 손실이 발생합니다. 포유 동물과는 달리, 그러나, 도롱뇽과 제브라 피쉬 (다니오 rerio) 등의 anamniotes도 완전 척수 절개 ^3,4 후 강력한 회복을 보여줍니다.

성인 zebrafish의 척수 손상 ^5-7 다음 복구 프로세스를 연구하기위한 기초가 튼튼한 모델입니다. 완전 척수를 절단 한 다음, 감각 및 기관차 기능의 회복은 육주 후 부상 ^(8)에 의해 성인 제브라 피쉬에서 관찰된다. 생체 내 재생 과정을 조사하기 위해, 우리는 투명 유생 제브라 ⁹ 돌렸다.

여기서 우리는 오일 후 수정 (DPF) 애벌레 제브라 피쉬의 USI의 척수를 절개하는 방법을 제시한다밧의에서 수정 메스로 경 사진 미세 주입 피펫을,, 겨 등. ^10이 방법은 높은 처리량, 낮은 사망률과 재현성을 지원합니다. 연습으로, 300 유생 / 시간은 가로로 할 수 있으며, 98.75 % 0.72 % ± 3,600 이상의 동물을 포함 transections 6 개월 이상, 7 일 후 부상 (dpi)로 될 때까지 살아 남았다. 우리의 데이터뿐만 아니라 감각과 운동의 빠른 회복을 보여줍니다 : 1 dpi로에서 부상당한 물고기의 모든 움직임은 가슴 지느러미 운동에 의해 구동된다. 그러나 애벌레 2 dpi로하여 절개에 바늘 터치 꼬리 텅스텐에 응답하기 시작, 3 dpi로하여 C-굽힘 운동을 다시 설정하고, 5 dpi로 ^(11)에 의해 약탈 수영을 표시합니다. 아세틸 튜 불린에 대한 항체 염색법을 사용하여, 우리는 축삭 1 dpi 해상도에서 부상 사이트에서없는 것을 확인했지만, 5 dpi로하여 부상 사이트를 넘었다. 우리는이 프로토콜은 다음과 같은 부상 척수에있는 축삭 재성장과 신경의 연구를위한 가치있는 기술을 제공 할 것입니다 믿습니다.

프로토콜

제브라 피쉬는 표준 절차에 따라 제기 자란 있었다; 실험은 유타 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.

수술 플레이트 1. 준비

1. 제조업체의 지침에 따라, 60mm 페트리 접시와 실 가드 184 실리콘 엘라스토머 키트를 사용하여 수술 판을 확인합니다. 반 전체보다는 더 이상 요리를 채우고 중합 할 수 있습니다. 스토어는 실내 온도에 덮여.

마이크로 피펫 2. 준비

1. 가열 및 마이크로 인젝션 용 바늘을 제조하기위한 동일한 설정을 사용하여 마이크로 피펫 풀러에서 얇은 벽 붕규산 모세관 튜브를 당겨 마이크로 피펫을 제조.
2. 해부 현미경, 집게로 직경 약 200 ㎛에 마이크로 피펫의 팁을 떼어냅니다.
3. 베벨 깨진 25 °에서의 두 번째 베벨 다음 35 °에 처음 microgrinder와 가장자리. 끝이 날카로운 SMO 있는지 확인OTH. 스토어는 점토의 작은 금액에 페트리 접시에 경 마이크로 피펫을 완료했다.

Zebrafish의 유충 3. 준비

1. 수술 전에 7 일, 남성과 여성의 제브라 피쉬의 짝짓기 탱크를 설정합니다.
2. 조명이 최대 수율을 보장하기 위해 어서 3 시간 후, 다음날 아침 배아를 수집합니다. ^knu3, 28.5 ℃에서 일종의 수정 된 배아 100분의 100 mm 플레이트 E3 25 ㎖의 : 같은 Tg는 (EGFP elevl3)와 같은 유전자 변형 기자 라인을 사용하는 경우 야생형를​​ 사용하는 경우, 정렬 28.5 ℃에서 E3의 25 ㎖에 태아에게 100분의 25 mm 플레이트를 기름지게
3. 기자 회선을 사용하는 경우, 48 HPF에서 형광 발현에 대한 배아를 화면. 확인 된 배아는 28.5 ℃에서 E3의 25 ㎖에 1백분의 25 mm 플레이트의 밀도로 성숙 할 수 있도록 허용
4. 유충은 5 DPF 경우, E2 + 10 ㎎ / L 겐타 마이신 황산염 (GS) + Tricaine과 실 가드을 포함하여 수술 판을 준비합니다.
   1. 100mm 페트리 표시에 25 ㎖의 E2 + GS를 추가하여 복구 요리를 준비합니다아.
   2. 함께 세 면봉 테이핑으로 메스를 준비합니다. 이 세 가지 홈이 삼각형 도구를 형성 할 것이다.
   3. 홈 중 하나에 테이핑하여 면봉에 준비된 마이크로 피펫을 장착합니다.
5. E2 + GS와 지우기가 1 ㎖ 주사기 전에 면봉에 설치에 27 G 바늘을 사용하여 때까지 플러시 마이크로 피펫을 다시 사용합니다.

4. 수술

1. Tricaine와 시간 (25 물고기)에서 애벌레의 1 접시를 마취. 더 이상 터치 반응을 전시하지 않을 때 물고기가 충분히 마취됩니다. 그것은 메스 그들에 닿을 때 그렇지 않으면 그들은 트됩니다, 물고기가 완전히 수술 전에 마취하는 것이 중요합니다. 수술은 해부 현미경으로 수행됩니다.
2. 수술 판에 유충을 전송합니다.
   1. 이 메스를 들고 손에의 뒷면에 가까운 측면에 위치하도록 최대 배율에서 한 번에 하나의 유충을 돌립니다.
   2. 그들은 실 가드에 휴식 있도록 위치, 핀셋유충의 폭에 각도.
   3. 집게의 팔 중 하나에 유리 메스를 보강, 확인 척색의 복부 가장자리를 넘어 절단하지 않는 것, 항문 구멍의 수준에서 애벌레의 등 측면 얼굴로 절단. 척수를 절단하기 위해 메스를 트위스트.
   4. 나머지 유충으로 반복합니다.
      참고 : 유충이 스며들 경우, 수술에서 회복되지 않습니다. 즉시 수술 판에서 유충을 제거하고 Tricaine의 과다 복용을 통해 안락사.
3. 유생의 배치에서 수술이 완료되면, 전송이 복구 플레이트에 동물을 부상. 이 마취의 청산을 지원하는 것입니다.
   1. 주의 : 전송 부상 애벌레를 수집 할 때, 그들은 먼저 머리 또는 꼬리를 수집하고 있는지 확인 : 유충을 절곡하여 부상 사이트를 강조하지 않습니다.
      주 : 수술에 사용 된 모든 장치가 마이크로 피펫을 포함하여 재사용 할 수 있습니다.

5. 복구

1. TRansfer 복구 플레이트에서 25/plate의 밀도로 25 ml의 E2 + GS 가득 100mm 접시에 유충을 부상. 28.5 ° C의 배양기에서 복구 할 수 있습니다.
2. 병 들고 죽은 동물을 제거, 매일 번호판을 확인합니다. Coleps (담수 원생 동물)가 미디어에 표시 될 때까지 미디어를 변경하지 마십시오. 미디어를 변경하는 경우, 새 접시에 물고기를 전송하지 않는다; 대신, 가능한 한 많은 용지를 제거하고 새로운 미디어와 같은 플레이트를 홍수. Coleps 인구를 줄이기 위해 필요한 경우를 반복합니다.
3. 가루 튀김 식품의 소량의 일일 사료.
   참고 : 라이브 음식 (예를 들면, paramecia 또는 로티퍼)는 그들이 운동을 회복 할 때까지 부상 유충에 공급 될 수 없다. 그렇지 않으면, 라이브 음식은 부상 사이트를 식민지화하고 유충을 죽일 것입니다.

결과

부상 사이트를 주변 조직 손상의 심각도를 감소시키기 위해, 마이크로 피펫의 적절한 베벨 중요합니다. 그림 1A는 제대로 경 팁을 보여줍니다. 너무 좁 팁 (그림 1C)이 아니라 조직을 절단보다 피부 떨어져 눈 경향이있는 동안 너무 넓 팁 (그림 1B)를 사용하면, 때문에 등쪽 대동맥을 새김의 증가 가능성에 높은 사망자가 발생하는 경향이있다.

1 dpi 해상도에서 제브라 피쉬. 그림 2A 라이브의 Tg (EGFP elevl3)의 완전히 가로로 척수를 보여 척수를 시각화하는 ^knu3 :이 기술을 연습 할 수있는, 이러한 Tg는 (EGFP elevl3)로 리포터 줄을 사용하는 것이 유리하다 . 물고기의 공동을 갖는 그림 2B는

토론

처음에이 기술을 학습 할 때, 우리는 하나의 세션에서 더 이상 50 ~ 100 이상 transections을 시도하는 것이 좋습니다. 이 기술을 마스터 한 후, 우리는 시간 당 300 배아까지 절개 할 수있다; 그러나, 처리량이 수준의 주간 연습의 몇 개월을 필요로합니다. 우리는 또한 기자 라인을 연습하고 불완전 척수 절개의 빈도가 1 % 이하로 감소 될 때까지 완전 절개를 확인하는 것이 좋습니다.

성인 제브라 피쉬의 척수 절개는 부상 후 축삭 재성장과 신경을 공부 잘 설립하고 강력한 기술이다. 애벌레 유기체로이 분석을 이동하여, 우리는 생체 내에서 복구를 검사 할 수 있습니다. 또한, 우리는 또한, 예를 들어, 재생 과정에서 Tcf7l1a ¹² 다양한 유전자의 역할을 검토하는 성인 제브라 피쉬에서 사용할 수없는 유전 적 도구를 활용할 수 있습니다.

원래 D...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
60mm 페트리 접시	VWR	82050-544
100mm 페트리 접시	VWR	89038-968
PDMS, Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Fisher Scientific	NC9644388
붕규산 모세관 튜브: OD 1.00mm, ID 0.78mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
집게	파인 사이언티픽 툴 Inc.	11252-30
해부 현미경	니콘	SMZ6454
마이크로 그라인더	나리시게	EG-44
겐타마이신 황산염	Amresco Inc.	0304-5G	는 물 10 mg/ml에 녹이고 -20°C에서 보관하십시오. C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Cotton tipped 애플리케이터, 목재, 6인치	Fisher Scientific	23-400-101
1 ml 주사기	BD	309625
27 G 바늘	BD	305109
프라이 식품	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	-20 ° C
마이크로 피펫 풀러	Sutter Instrument Co.	모델 P-97	상자 필라멘트 FB330B
20x E2 (1 L); RT
17.5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90 g CaCl2·>< 2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 g MgSO4· 7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); < / 강력 > 신선하게 만들기, 여분의
0.35g NaCO3< / sub>	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); RT
50 ml 20x E2
2 ml 신선한 500x NaCO3