마우스의 수력 학적 유전자 전달에 의한 단백질의 일시적 발현

요약

유체 유전자 전달에 의한 벌거 벗은 DNA의 생체 내 형질에서 최소한의 염증 반응과 동물의 조직에 유전자를 소개합니다. 유전자 산물의 충분한 양의 유전자 기능 및 조절뿐만 아니라, 단백질의 구조 및 기능 분석 될 수 있도록 생성된다.

초록

생체 내에서 형질 전환 유전자를 효율적으로 발현은 유전자 기능을 연구하고 질병에 대한 치료법 개발에 매우 중요합니다. 지난 몇 년 동안, 유체 유전자 전달 (HGD)이 설치류에 형질 전환 유전자를 전달하기위한, 간단하고, 빠르고, 안전하고 효과적인 방법으로 떠오르고있다. 이 기술은 관류 기관의 세포막의 투과성을 증가시키는 생리 용액의 대량의 급속한 주입에 의해 생성되는 힘에 의존하고, 따라서 세포로 DNA를 전달한다. HGD의 주요 장점 중 하나는 알몸 플라스미드 DNA (pDNA를)를 사용하여 포유류 세포로 형질 전환 유전자를 도입 할 수있는 기능입니다. 플라스미드를 사용하여 외래 유전자를 도입하는 방법은 매우 안전하고, 최소한의 고효율, 힘들고, 바이러스 사업자에 반대합니다. HGD가 처음 생쥐에 유전자를 전달하기 위해 사용 된, 그것은 이제 올리고 뉴클레오티드, 인공 염색체, RNA, 단백질 및 마우스에 작은 분자를 포함한 물질의 넓은 범위, 래트를 전달하는 데 사용와, 제한된 정도, 다른 동물. 이 프로토콜은 생쥐의 HGD에 대해 설명하고 프로 시저를 성공적으로 수행하는 중요한 방법의 세 가지 주요 측면에 초점을 맞추고 : 정맥에 바늘의 정확한 삽입, 분사의 볼륨 및 배달의 속도. 예를 분비, 영장류 특정 단백질을 인코딩하는 두 유전자의 일시적 발현이 방법의 응용 프로그램을 보여 주어, 아포 지단백 LI (APOL-I)과 합 토글 로빈 관련 단백질 (HPR).

서론

에 의해 처음으로 설명하기 때문에 류 등. 및 장 등., 유체 유전자 전달 (HGD)는 설치류 모델 시스템 ^{1, 2} 유전자의 기능을 연구하는데 매우 중요한 도구가되고있다. 기술은 표적 기관 ^{1, 2의} 세포에 의해 플라스미드 DNA의 흡수를 촉진하기 위하여 마우스의 꼬리 정맥에 용액의 대량 (8~12% 체중)의 급속 주입 (5-7 초)을 포함한다. 이러한 조건은 신장, 비장, 폐와 심장에 간 적은 유전자 발현의 강력한 유전자 발현을 초래할.

10 μg을 pCMV-LacZ를 플라스미드 주입 HGD 날짜 ^1에 가장 효율적인 비 바이러스 성, 생체 내 유전자 전달 방법을 만드는 간세포의 많은 40 %가 감염 될 수 있습니다. 바이러스 성 항공사와는 달리, pDNA를 준비하기 쉽고, 설치류 호스트 ³ 면역 반응을 유도하지 않고 끝이 재결합하여 건강 위험하지 않습니다ogenous 바이러스. HGD에 의해 전달 된 DNA 분자가 포장을 필요로하지 않기 때문에 또한,이 방법은 150킬로바이트 ^4만큼 많은 세균 인공 염색체 (BAC)의 전달에 적합하다. 유체 역학적 방법에 의해 전달 된 분자의 다른 종류의 RN....

프로토콜

여기에 설명 된 모든 실험은 헌터 칼리지의 기관 동물 케어 및 사용위원회, 뉴욕 시립 대학에 의해 승인되었습니다.

독소가없는 플라스미드 DNA의 1. 준비

1. 갓 줄무늬 선택적 판에서 포유 동물 발현 벡터에 대한 관심의 유전자를 포함하는 박테리아의 하나의 식민지를 선택합니다.
2. 박테리아의 성장과 수확에 대한 시판 독소가없는 플라스미드 정제 키트의 수첩에서 발견 된 권장 사항을 따르십시오.
3. 시판 엔도톡신 프리 플라스미드 정제 키트의 프로토콜에 따라 박테리아 세포에서 내 독소가없는 플라스미드 DNA를 정제 하였다.
4. 독소가없는 플라스틱 제품을 사용하고 독소가 제거 단계 후 DNA 샘플에 다시 도입되지 않도록주의하십시오 DNA를 처리합니다.
5. MICR를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 내 독소가없는 플라스미드 DNA의 농도를 측정O-볼륨 UV의 아래 기술 분광 광도계 또는 표준 큐벳 기반 분광 광도계.
   1. 다음 마이크로 분광 광도계 샘플 보유 시스템의 하부 및 상부 광학 표면을 청소한다. 하단 광 시스템에 깨끗한 탈 이온수 피펫 1 μL. 레버 암을 닫고 상단 광학 시스템을 목욕을 할 몇 번을 누른 다음 열기 레버를 티슈로 닦아냅니다.

결과

마우스의 꼬리 정맥에 바늘의 정확한 위치는 (도 1에 도시 된 바와 같이)을 성공적으로 유체 역학 기반하여 형질 도입 유전자 전달을위한 필수 조건이다. 주입의 전체 볼륨은 6-8의 기간 내에 전달 될 수 있도록 종종 기술의 가장 어려운 부분은, 그러나, 움직임이없는 꼬리 정맥 내 바늘의 유지이다. 사출 과정에서 사소한 오류가 크게 감소 된 형질 전환 효율 및 단백질 발현의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 각각의 실험 HGD의 성공을 모니터링하는 것이 필수적이다. 또한 형질 전환 단백질이 때문에 민감한 항체의 부족으로 웨스턴 블롯에 의해 검출하기 어려운 경우, 원숭이 APOL-I의 경우에서와 같이, 주입 효율이 단백질에 대한 유전자를 운반하는 플라스미드의 공동 주입에 의해 모니터링 될 수 검출이 용이하다. 도 2에 도시 된 실험에서, 마우스는 50 주사했다세 차등 6XHIS 중 하나를 운반하는 플라스미드 ㎍의는 비비 APOL-I 유전자와 원숭이

토론

올바르게 수행 할 경우, HGD는 유전자 전달의 매우 안전하고 효과적인 방법입니다. 성공적인 HGD에 중요한 단계는 1)보다 8 초에 마우스 3)의 꼬리 정맥에) 생리 식염수 차량 2의 큰 볼륨에서 DNA의 정확한 양을 제공.

주입 과정 자체가 대단한 약간의 손재주가 필요하지만,이 여섯 번째 절차의 성공은 종종 실험주의 준비에있다. 최대한의 유전자 발현을 달성하기 위해 필요한의 pDNA의 양이 사용될 플라스미드 따라서 발현되는 유전자에 따라 크게 달라질 수 있으며, 주입되는 DNA의 최적 량은 각 응용에 대한 실험적으로 결정되어야한다. 마우스의 경우, 일반적으로 권장되는 DNA의 범위는 유전자 발현이 고원에 도달 할 수있는 이상으로 5 ~ 50 μg이다. 우리 손에, APOL-I 또는 HPR 유전자 하나를 들고 50 μg pRG977의 주입은 circulatin 높은 수준에 이르게처음 두 일 G 단백질 수준은 HGD을 게시 할 수 있습니다. 두.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알코올 준비 닦음	Webcol	6818
AST 키트, Amplite 비색 AAT	Bioquest	13801
원뿔형 튜브, 50ml	BD Falcon	352070
EndoFree 플라스미드 맥시 키트	Qiagen	12362
KimWipes	KIMTECH	34120
마우스 테일 일루미네이터	Braintree Scientific	MTI RST	또는 동등한
바늘, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)	BD	305175
바늘, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)	BD	305109
pRG977 (포유류 발현 벡터)	Regeneron Pharmaceuticals		재료 이전 계약 필요
염화나트륨, 0.9% INJ USP 10 ml, 호스피라	Fisher	NC9054335
주사기, 3ml, HGD	의 압력을 견디는 데 필요한 Luer-Lok	BD	309657

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