말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

요약

미세 아교 세포는 세포 외 환경에서 소재를 탐식거나 삼키는 고용량으로 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포이다. 여기 시냅스 구성 요소의 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화 및 측정 광범위하게 적용, 신뢰성, 높은 정량 분석​​은 설명한다.

초록

식균 작용은 세포가 주변 세포 환경에서 자료 (전체 세포, 세포, 이물질 등의 일부를) 침몰 이후에 일반적으로 리소좀의 분해를 통해이 물질을 소화하는 과정이다. 미세 아교 세포는 식세포 기능 신경 퇴행성 질환 건강한 뇌의 발달 (알츠하이머 병의 예, 베타 - 아밀로이드 클리어런스) (즉, 시냅스에서의 조건의 넓은 범위에 설명 된 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포 아르 가지 치기) ^1-6. 다음 프로토콜 개발 마우스 retinogeniculate 체제 ⁷ 연접 입력 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화하고 계량화하기 위해 개발 말림 분석법이다. 이 분석은 특정 컨텍스트에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하기 위해 사용되었지만, 유사한 접근법은 뇌 (예를 들어, 성상 교세포) 및 신체의 나머지 다른 식세포를 평가하기 위해 사용될 수있다(예를 들어, 말초 식세포)뿐만 아니라 시냅스 리모델링이 발생하는 다른 문맥 (예, 뇌 손상 / 질병).

서론

시냅스 회로는 동물의 생활 전반에 걸쳐 리모델링. 개발 두뇌에서 시냅스가 초과 형성하고 시냅스의 일부를 선택적으로 제거 및 ^8-10 유지하는 시냅스의 유지 및 강화를 포함 시냅스 가지 치기를 받아야한다. 이 프로세스는 성인 신경계의 정확한 연결 특성을 달성 할 필요가있다. 성인에서, 시냅스 또한 특히 학습 및 기억의 맥락에서 플라스틱 일 수있다. 이 가소성의 구조적 상관 관계가 돌기 쪽과 연접 BOUTONS ^{11 ~ 13의} 추가 및 / 또는 제거를 포함하는 것으로 생각된다. 건강한 신경 시스템의 이러한 역할뿐만 아니라, 시냅스 리모델링은 신경계 질병 / 상해 ^12,14,15에 참여하고있다. 예를 들면, 척수 손상 후, 절단 축삭이어서 개조 및 기능적 회복 ^16-19을 달성하기 위해 새로운의 시냅스를 형성한다.

NT는 "> 시냅스 가소성의 중요한 부분으로 신흥 식균 작용 또는 제거 ^3,5,20 향하는 시냅스의 말림하는 과정입니다. 우리는 최근 건강, 출생 후 마우스의 뇌 ⁷ 시냅스 가지 치기의 맥락에서이 현상을 보였다. 특히 , 미세 아교 세포는 상주 CNS 면역 세포와 대 식세포는 피크 기간 동안 발달 시냅스 가지 치기, 시상의 출생 등의 측면 굽은 핵 (dLGN)의 영역에서 시냅스 입력을 삼켜 표시했다.이 말림의 유전자 또는 약물 봉쇄 시냅스 연결의 지속적인 적자로 만들었습니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 시냅스 입력 식세포 매개 말림을 측정하는 신뢰성 높은 정량 분석​​에 대해 설명합니다. 이 문서의 목적을 위해,이 분석에서는 망막에 존재하는 망막 신경절 세포를 포함 현상 retinogeniculate 시스템 (망막 신경절)의 맥락에서 제시 될 것이라는dLGN (그림 1A)에 시냅스 입력을 전망이다. 시작하기 위해, 리소좀 분해 내성 선행 성 라벨 전략 dLGN에서 RGC 특정 시냅스 입력 (도 1) ^7,21를 시각화하는데 사용되는, 설명한다. 이 설명, 이미징을위한 세부 방법론에 따라 정량적으로 3 차원 (3D) 표면의 볼륨 렌더링과 결합 된 공 초점 현미경을 사용하여 말림을 측정하는 받게 될 것입니다. 이 방법론은 고정 티슈 제조에 기반뿐만 아니라 라이브 영상 연구에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 분석은 건강한, 출생 후의 retinogeniculate 시스템의 맥락에서 검증되었지만 중요한 하나는 다른 뇌로 걸쳐 질병 중에 식세포 신경 세포의 상호 작용뿐만 아니라 다른 장기 시스템의 식세포 기능을 평가하기 위해 동일한 기술을 적용 할 수있다.

프로토콜

RGC 시냅스 입력의 1. 선행 성 라벨

주 : 동물의 사용과 관련된 모든 실험은 모든 NIH의 지침에 따라 검토하고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 감독되었다.

1. 필드와 악기를 소독.
2. 플렉시 유도 챔버에서 4 부피 %의 이소 플루 란 (이 부피 %의 이소 플루 란 신생아 - 성인 마우스 작동)와 마우스를 마취. 오버 마취 방지하기 위해 밀접하게 쥐를 관찰합니다. 주의 : 진공 배기 가스 배출과 흡입을 피할 것.
3. 1-3 분 후, (이전 마우스는 적은 시간이 필요합니다) 마취의 적절한 수준이 꼬리를 곤란하게 (아무 반응이 관찰 될 수 없습니다)와 호흡 속도 (속도가 느리고 꾸준한해야한다) 관찰에 의해 달성되어 있는지 확인합니다.
4. 주둥이에 3-4 부피 % 이소 플루 란 (isoflurane)을 제공하는 측면과 장소 코 콘 스테레오 현미경으로 마우스를 놓습니다 (신생아 <생후 10 (P10) ~ 4 부피 %;> P10 ~ 3 부피 %).
5. 공막을 노출합니다. 신생아의 주입 전에 아이 오프닝에, 눈꺼풀을 열고 공막을 노출 피부를 뒤로 당겨 작은 봄 가위를 사용합니다. 나이가 쥐의 경우, 공막을 노출하는 눈 주위의 피부를 뒤로 당겨 손가락을 사용합니다. 주의 : 신생아에서, 때로는 눈의 구석에 또 다른 수직 절단이 필요합니다. 절단하는 경우, 과도 출혈하는 혈관이 있기 때문에 눈꺼풀의 모서리를 절단 할 때주의하십시오.
6. 공막이 시작되는 줄에서 눈의 측면에 작은 구멍을 천공 멸균 30.5 G 바늘을 사용합니다. 다만 충분히 경사가 눈에가는 것을 바늘을 삽입하여 렌즈가 손상되지 않도록주의하십시오.
7. 유리체는 구멍의 흐름과 액체를 흡수하기 위해 멸균 면봉을 사용할 수 있습니다.
8. 유리체는 구멍에서 흐르는 중지되면, 선행 성 추적 염료로 사전로드 해밀턴 주사기에 부착 된 무딘 엔드 바늘을 삽입구멍에. 주의 : 천천히 눈의 다른면을 천공이나 렌즈의 손상을 방지하기 위해 바늘을 삽입합니다.
9. 천천히 눈에 염료를 주입. 일반적으로, 알렉사 594, 647, 또는 488 (CTB-594, CTB-647, 또는 CTB-488, 5-6 ㎍ / μL)에 접합 된 서브 유닛 β 콜레라 독소 anterogradely 추적 RGC 입력하는 데 사용됩니다. 신생아 (≤의 P10)의 경우 1 ~ 2 μL는 충분하며, 마우스의 경우> P10 ~ 3 μL 충분하다. 참고 : 알렉사 염료 리소좀 저하에 특히 저항
10. 몇 초 동안 구멍에 바늘을두고 천천히 제거합니다.
11. 과잉 유동성을 흡수하고 밖으로 누출 염료를 방지하기 위해 면봉을 사용합니다.
12. 눈에 항생제 연고의 작은 금액을 적용합니다. 눈이 수술 열린 경우 모두 살짝 눈꺼풀의 위치를​​ 변경.
13. 두 눈을 주입하는 경우, 다른 눈에 절차를 반복합니다.
14. 이 anesth에서 회복하기 시작 때까지 다음과 같은 주사 (들), 열 램프 아래 또는 열 패드에 마우스를 남겨ESIA.
15. 깨끗한 집 케이지에 마우스를 반환하고 식민지로 돌아 가기 전에 잠에서 깨어 있는지 확인하기 위해 모니터링 할 수 있습니다.

2. 이미징 조직 준비

이 조직 준비 프로토콜은 식세포가 형광 마커 (예, 미세 아교 세포에 대한 CX3CR1-EGFP)으로 표시되는 기자 마우스에 사용됩니다. 기자 라인을 사용할 수없는 경우, 조사 (토론 참조) 조직 섹션을 immunostain 수 있습니다.

1. ~ 24 시간 주사 후 마우스를 희생하고 두뇌를 해부하다.
2. 밤새 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 채워진 팔콘 튜브에 뇌를 해결 하락 주의 : PFA는 독성이다. 흄 후드 또는 하강 기류 테이블에 사용 및 개인 보호 장비를 착용하여 흡입 및 피부 노출을 피하십시오. 주의 사항 : 고정은 (≥ 4 시간) 단축 될 수 있습니다. 대신 드롭 고정 또한, 4 % PFA 관류 사용 2-24 시간 드롭 수정 올 수 있습니다. 그러나 perfuse의 비교고정 신생아와 성인의 두뇌를 드롭 D는 이미지 품질이나 정량에 차이를 보이지 않았다.
3. 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서 뇌의 3 배를 씻어.
   1. 빈 무게 배에 뇌와 PFA를 붓는다.
   2. 다른 두뇌를​​ 전송하기 위해 주걱을 사용하여 PBS로 가득 보트의 무게.
   3. 두 번 더 PBS에 세척 뇌 (전송 뇌의 두 개 더로는 PBS로 가득 보트의 무게).
4. 30 % 자당 용액으로 채워진 팔콘 튜브에 머리를 전송합니다. 뇌가 튜브 (48 시간)의 바닥에 침몰 할 때까지 4 ° C에서 자당의 두뇌를 남겨주세요.
5. 뇌가 싱크되면 절편의 두뇌를 준비합니다. 다음 단계는 냉동 스테이지 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 40 ㎛의 부동 부분의 제조 (저온 유지 장치도 사용될 수있다)이다.
   1. (dLGN를 들어, 뇌의 주동이의와 꼬리 부분을 제거) 필요하지 않은 뇌의 일부를 제거하기 위해 면도날을 사용합니다.
   2. 브래지어를 고정드라이 아이스에 알루미늄 호일에있는. 이 시간 동안, 마이크로톰 스테이지를 고정하고 0.5 ㎖의 0.1 M 인산 완충액 (PB)를 24 - 웰 플레이트의 각 웰을 채운다.
6. 냉동 무대에서 (이 불투명 나타납니다) 냉동 뇌를 탑재합니다.
   1. 무대에 최적의 절단 온도 화합물 (10 월)의 작은 금액을 적용합니다.
   2. OCT를 동결하기 시작하면, OCT의 두뇌를 놓는다. 절단됩니다 뇌의 끝은 (꼬리 쪽을 얼굴 dLGN 위해, 예를 들어)을 위로 향하게해야합니다.
   3. 매우 미세하게 분쇄 된 드라이 아이스와 뇌와 OCT를 포함한다.
   4. ~ 30 초 동안 뇌 / on 10 월 드라이 아이스를 남겨주세요.
   5. 드라이 아이스를 제거하는 큰 페인트 브러시를 사용합니다. 뇌와 OCT를 무대에 고정되어야한다.
7. 또한 (ROI)의 영역에 도달 할 때까지 조직을 통해 구획 시작한다.
8. ROI에 도달하면, 블레이드의 부분을 제거하고 24 - 웰 플랫폼로 전송할 작은 페인트 솔을 이용E 0.1 M PB (단계 2.5.2)를 포함. 이전의 블레이드에서 섹션을 제거하는 0.1M의 PB에 적셔서 촉촉한 페인트 붓을 유지합니다. 참고 : 섹션 4 ℃에서 하룻밤 0.1 M PB에 남아있을 수 있습니다
9. 섹션가 수집되고 나면, 형광 해부 현미경 선행 성 라벨을 시각화하고 투자 수익 (ROI)을 포함하는 섹션을 선택합니다.
10. 작은 페인트 브러시와 슬라이드 섹션을 탑재합니다.
    1. 충전 된 현미경 슬라이드에 0.1 M PB의 작은 수영장을 적용합니다.
    2. PB의 풀에 조직 섹션을 전송합니다.
    3. 방향을 PB 및 페인트 브러시를 사용하여 조직을 확산.
    4. 초과 PB를 윅 킴 와이프를 사용합니다. 섹션을 심지 않도록주의하십시오.
    5. 완전히 건조 공기 수 있습니다.
    6. 각 섹션에 장착 매체의 작은 방울을 적용하고 (22 × 50 mm의 1.5 호) 상단에 커버 슬립을 탑재합니다.
    7. 영상 세션 때까지 -20 ° C에서 매니큐어 및 저장소와 슬라이드의 가장자리를 밀봉. 참고 : 이미징하지만준비가 좋습니다 일주일에 슬라이드 이전 영상에 몇 주 동안 -20 ° C로 유지 될 수있다.

3. 이미징 조직

모든 이미지는 회전 디스크 공 초점 현미경 (UltraView 복스 회전 디스크 다이오드 레이저 (405 nm의, 445 nm의, 488 nm의, 514 nm의, 561 nm의, 640 nm의)을 갖춘 공 ​​초점 현미경)에 인수됩니다. 이미지는 또한 (예를 들면, 레이저 스캐닝 공 초점 현미경, 디콘 볼 루션 등 뒤에 epifluorescent 현미경)은 고해상도 Z-스택을 획득하는 능력을 가진 임의의 현미경에 취득 할 수있다. 프레임 크기는 일반적으로 1,000 X 1,000 픽셀입니다.

1. 10 배 배율로 투자 수익 (ROI)을 찾아 이미지를 획득. retinogeniculate 시스템에서 미세 아교 세포 이미징의 경우, 투자 수익 (ROI)이 가장 내측 dLGN 섹션입니다.
2. 높은 배율로 이동 (60X 계획 아포 목적, NA 1.4는 일반적으로 사용되는 =).
3. 0.2 μm의 Z-단계를 사용하여 식세포를 포함하는 뷰의 첫 번째 필드 획득의.
4. 동물 당 식세포를 포함하는 15-19 더 많은 필드를 취득.

4. 정량화 (ImageJ에)에 대한 이미지를 준비

1. ImageJ에있는 열기 Z-스택.
2. 이미지 메뉴에서 색상 및 분할 채널로 이동합니다.
3. 가득 채우고 재료를 포함하는 채널에서 배경을 뺍니다.
   1. 가득 채우고 재료 (예를 들면, 시냅스 입력)를 포함하는 채널 창을 선택합니다.
   2. 프로세스 메뉴로 이동 빼기 배경을 선택합니다. dLGN에있는 시냅스 입력의 선행 성 추적 10 픽셀의 롤링 볼 반경을 사용합니다. 참고 : 롤링 볼 반경이 경험적으로 결정된다. 그러나, 일반적으로 배경의 일부가 아닌 이미지에서 가장 큰 개체의 반​​경만큼 커야한다.
4. 식세포를 포함하는 채널을 부드럽게.
   1. 식세포 (예를 들면, 미세 아교 세포)를 포함하는 채널 창을 선택합니다.
   2. 프로세스 메뉴 및 셀프로 이동요법 필터, 평균. 1.5의 평균 필터 (이것은 이후 단계에서 표면의 렌더링 이미지를 부드럽게)를 사용합니다.
5. 식세포를 포함하는 채널에서 배경을 뺍니다.
   1. 식세포 (예를 들면, 미세 아교 세포)를 포함하는 채널 창을 선택합니다.
   2. (설정은 경험적으로 결정해야합니다) 빼기 배경을 선택, 프로세스 메뉴로 이동합니다. EGFP 양성 미세 아교 세포에 대한 50 픽셀의 롤링 볼 반경을 사용합니다.
6. 이미지 메뉴로 이동하고 색상, 채널 병합을 선택하여 채널을 병합합니다.
7. (이것은 빠른 렌더링 표면을 만드는 5 단계 참조) 병합 파일에서 식세포를 포함 자르기 ROI.
   1. 도구 모음에서 직사각형 선택 도구를 사용하여 투자 수익 (ROI)의 주위에 상자를 그립니다.
   2. 이미지 메뉴로 이동하여 자르기를 선택합니다.
8. (단계 4.2 참조) 다시 채널을 분할합니다.
9. 자신의 TIFF 파일로 각 채널을 저장합니다.

5. 정량화를 위해 이미지를 준비Imaris에

1. 열기 Imaris과 볼륨 아이콘이 왼쪽 상단 메뉴 (그림 2)에 선택되어 있는지 확인합니다.
2. 잘라낸 이미지의 열기 첫 번째 채널 (채널 중 하나, 그냥 일관성이 처음 열릴 수 있습니다.)
3. 다른 채널을 추가합니다. 편집 메뉴로 이동하여 채널을 추가하고 파일의 다음 채널을 선택을 선택합니다. (나머지 채널에 대해이 단계를 반복합니다.) 참고 : 색상을 변경하려면 표시 조정 창으로 이동하여 채널 이름 (그림 3A)을 클릭합니다. 이 색상을 조정하는 대화 상자가 나타납니다. 화면 조정 화면이 표시되지 않는 경우, 편집 메뉴로 이동하여 디스플레이 조정을 선택합니다.
4. 픽셀 값을 조정합니다. 편집 메뉴로 이동하여 이미지 속성을 선택합니다. 이 창에서, x, y 및 z 픽셀 값 (이 값은 현미경 대물, 카메라, 및 z 단계 취득에 의존하여 이미지를 획득하는 데 사용되는 소프트웨어에서 찾아 볼 수있다)를 조정.
5. 단계 5.5은 매우 발생합니다작은 이미지. 의 크기를 조절하려면, 오른쪽 하단 모서리에있는 맞춤 아이콘 (그림 2)을 클릭합니다.
6. 화면 조정 창에서 왼쪽과 가운데 삼각형을 사용하여 각 채널의 밝기와 대비를 조정합니다.

식세포의 6. 3 차원 (3D) 표면 렌더링

1. 상단 도구 모음에서 능가 ​​모드 (그림 3C)를 선택해야합니다.
2. 화면 조정 창에서 식세포 채널을 제외한 모든 채널을 선택 취소합니다. 이 시야에서 제거됩니다.
3. 표면 렌더링 아이콘 (그림 2)를 클릭합니다.
4. 작성 창 왼쪽 아래 (그림 4A) 표시됩니다 반드시 세그먼트의 ROI는이 첫 번째 창에서 선택을 취소합니다. 아래에있는 파란색 앞으로 버튼을 클릭하십시오.
5. 스무딩을 조정합니다.
   1. 다음 창에서 풀다운 메뉴 (그림 4B)에서 식세포 채널을 선택합니다. 이것은 조정표면화되고 (0.1 μm의 다듬기는 일반적으로 미세 아교 세포에 사용되는) 경험적으로 결정되어야한다 세부 금액입니다.
   2. 절대 임계 값을 선택합니다.
   3. 아래에있는 파란색 앞으로 버튼을 클릭하십시오.
6. 임계 이미지.
   1. 이미지 (그림 4C) 적절하게 표면화 될 때까지 막대 그래프 및 드래그를 클릭합니다. 이것은 형광 이미지 위에 겹쳐 회색 표면은 정확한 표면 표현 보장하기 위해 이미지를 회전하여 실험적으로 결정된다. 참고 : 회전 화면 (그림 3B)의 상단 오른쪽에있는 포인터 메뉴에서 이동을 선택, 클릭하고 회전 할 이미지를 누릅니다. 원래 방향으로 이미지를 반환하려면 원점을 선택하면 하단보기 메뉴에서 왼쪽.
   2. 아래에있는 파란색 앞으로 버튼을 클릭하십시오.
7. 다음 창에서 이미지가 매우 잡음이되지 않는 등의 크기에 의해 모든 표면을 필터링 할 수있는 옵션이있어, 필터링을 삭제하지 마십시오자동으로 표시 Y 필터. 식세포를 렌더링 표면을 완료 아래에있는 녹색 화살표를 클릭합니다. 탭의 새로운 세트는 (그림 5)가 나타납니다
8. 필요한 경우, 그 식세포의 일부가 아닌 모든면을 삭제합니다.
   1. 선택 옵션이 포인터 메뉴 (그림 3B)에 선택되어 있는지 확인합니다.
   2. 이 노란색으로 변하도록 삭제 될 모든 표면을 클릭합니다. 제어 버튼을 누른 상태에서 여러 개의 표면을 삭제하려면 표면을 클릭합니다.
   3. 연필 탭에서 삭제를 클릭합니다.
9. 를 선택하고 한면에 식세포의 모든 표면을 병합합니다.
   1. 유입 경로 (; 그림 5C, 즉 필터 탭)을 클릭합니다.
   2. 추가를 클릭합니다.
   3. 어떤 필터를 선택까지 (모든 표면은 황색이어야한다) 왼쪽에있는 막대 그래프를 드래그합니다.
   4. 다시 연필 탭으로 이동하여 통일을 클릭합니다.
10. 그래프 탭으로 이동합니다 (그림 5A ) 및 세부 정보를 클릭하고 표시 할 매개 변수를 선택합니다. 볼륨 (그림 5D)을 선택합니다. 여러 매개 변수를 표시, 왼쪽 아래에있는 렌치 아이콘 (그림 2)로 이동하고 기록하는 매개 변수를 선택합니다.
11. 식세포의 볼륨을 기록하고 계속하기 전에 파일을 저장합니다.

가득 채우고 소재의 7. 3D 표면 렌더링

1. 식세포에 의해 침몰 된 재료를위한 새로운 채널을 만듭니다.
   1. 식세포 표면이 선택한 상태에서 연필 탭을 클릭합니다.
   2. 모든 마스크를 클릭합니다.
   3. 표시되는 대화 상자에서 침몰 자료 (; 그림 (b) 예를 들어, 시냅스 입력의 선행 성 추적)에 해당하는 채널을 선택합니다.
   4. 마스크를 적용하기 전에 중복 채널을 선택하고 확인을 누르십시오.
   5. 새로운 채널이 침몰 된 소재만을 포함하고 내부 디스플레이 조정 창에 나타납니다식세포.
2. 표면 렌더링 총 빨아 nonengulfed 물질을 포함하는 채널입니다.
   1. 표면 할 채널을 제외하고 표시 조정 창에있는 모든 채널의 선택을 취소하고 식세포에 대해 생성 된 표면을 취소합니다.
   2. 다시 표면 렌더링 아이콘을 클릭합니다 (단계 6.3 참조) (6.4-6.11 단계) 식세포에 대해 설명한 것과 동일한 단계를 사용하여 채널의 표면을 만들 수 있습니다. 참고 : 이전에 (단계 6.5, 그림 (b))을 부드럽게하고 임계 값에 올바른 채널을 선택해야합니다. 임계 값을 적어 두십시오 (; 그림 4C 단계 6.6 참조). 이 값은 또한 표면 렌더링 후 얻을 수있는 것은 (지팡이 탭, 그림 5A) 완료됩니다.
3. 총 침몰과 비 가득 채우고 재료의 양을 기록하고 계속하기 전에 파일을 저장합니다.
4. 표면 가득 채우고 재료 (식세포 내 소재)를 렌더링합니다.
   1. 만의 형광을 시각화침몰 재료의 새로운 채널 (단계 7.2.1 참조).
   2. 상기와 같은 단계를 (7.2-7.3 단계)에 따라. 참고 : (단계 7.1에서 만든 새 채널을 선택) 이전 평활화 풀다운 메뉴에서 올바른 채널을 선택해야합니다. 임계 창에서 수동 다운로드 잠겼 비 잠겼 재료 (단계 7.2.2 참조) 렌더링 설정된 임계 값을 입력한다.
5. 침몰 물질의 양을 기록하고 계속 진행하기 전에 파일을 저장합니다.

8.보기의 필드의 총 양을 계산

1. 모든 채널의 새로운면을 만듭니다.
2. 전체 필드가​​ 표면화되도록 임계 창 (단계 6.6)에서, 막대 그래프를 왼쪽으로 끝까지 밀어 넣습니다.
3. 전체 필드를 부상 완료하고 (6.7-6.11 단계) 양을 기록한다.
4. 파일을 저장합니다.

9. 포식 재료의 양을 계산

1. 의 농도를 계산다음과 같은 알고리즘을 사용하여 총 침몰과 비 가득 채우고 재료 채널 :
   필드 (8 단계)의 총 가득 채우고과 비 가득 채우고 재료의 양 (7.3 단계) / 볼륨.
2. 다음과 같은 알고리즘을 사용하여 셀 당 %의 말림를 계산
   (가득 채우고 재료의 양 (7.5 단계) / 식세포 (단계 6.11)의 총 양이) × 100
   노트 : 셀의 크기의 변동을 고려하여이 데이터는 식세포의 총 부피로 정규화된다. 단계 9.1에서 숫자 필드에 걸쳐 매우 가변적 인 경우 9.1로 계산 단계 9.2에서 데이터를 정규화 할 필요가있다.

결과

최근에, 우리는 개발 retinogeniculate 시스템의 시냅스 입력의 미세 아교 세포 - 매개 말림 (그림 1) ^7을 시각화하고 정량화이 말림 분석을 사용했다. CX3CR1-EGFP 이형 쥐에서 망막 신경절은 anterogradely 각각 왼쪽과 오른쪽 눈에 CTB-594 및 CTB-647으로 추적했다. 이 추적에 이어, dLGN 내에서 EGFP 양성 미세 아교 세포가 몇 군데 있었다. 이러한 이미지는 이후에 볼륨 측정을 위해 표면 렌더링되었다.

이 기술을 사용하여, 우리는 dLGN (P5) 내에서 개발 시냅스 리모델링의 피크 기간 동안, 시냅스 입력이 미세 아교 세포 (그림 6)에 의해 침몰되는 것으로 나타났습니다. 리모델링 다량 (P9) 거의 완료 될 때 적은 AS 4 일 후, 잠겼 입력의 양의 극적인 감소가있다. 또한, 말림과 가지 치기는 고전적인 보완 폭포에 속하는 단백질이 결핍 된 ...

토론

식균 작용을 정확하게 측정하기 위해, 재료가 잠겼 리소좀 분해가 발생하면 연구자가 그것을 시각화 할 수있는 방식으로 표시하여야한다. 또, 고해상도 영상은 셀 전체의 볼륨을 시각화하고 그 내용을 정량화 연구원있게 소프트웨어의 사용에 선행 요구된다. 이 프로토콜에서는, 우리는 높은 해상도의 공 초점 현미경 및 3D 재건과 함께 가득 채우고 재료 레이블을 알렉사 염료에 접합 CTB를 사용하여 식세포 매개 말림을 측정하는 매우 안정적이고 정량적 인 방법을 설명합니다. 이 방법은 성공적으로 개발 마우스의 뇌 (retinogeniculate 시스템) ⁷ 시냅스 리모델링을받은 시냅스 입력의 미세 아교 세포 매개-말림을 분석하기 위해 실험실에서 사용되었습니다. 또, unde 다른 발달 연령대 걸쳐 말림의 미묘한 변화를 구분할 수있는 매우 민감한 기술로 입증R 비 병적 인 조건과 야생형과 녹아웃 마우스 사이. 약간의 조정으로,이 프로토콜은 시간 경과 영상 살아있는 조직에서 말림을 연구에 적용 할 수 있습니다. 또,이 프로토...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
히트 패드	Vet Equip, Inc.	965500
열 패드 용 온수 원	켄트 사이언티픽	TP-700
스테레오 현미경	DSC 광학	Zeiss Opmi -6 수술
현미경 슬라이딩 마이크로 톰 동결 단계	라이카	SM2010 R
마이크로 톰 블레이드	라이카	14021607100
형광 해부 현미경	니콘	SMZ800 첨부 Epi-fluorescence 부착물
회전 디스크 컨포칼 현미경	Perkin Elmer	UltraView Vox 회전 디스크 컨포칼
10 &마이크로; l Hamilton 가스 꽉 주사기	Hamilton	80030	각 색상 염료 / 추적기에 대해 다른 주사기를 사용하십시오
Hamilton 바늘	Hamilton	7803-05, 사양 : 무딘, 1.5 "
Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB)	Invitrogen	488 : C22841	멸균 식염수, 80 µ에서 재구성; L (488), 100 &마이크로; L (594), 20 &마이크로; l (647)
594: C22842
647: C34778
인산염 완충 식염수 ( PBS)	Sigma	P4417-50TAB
네오마이신 및 폴리믹신 B 황산염 및 바시트라신 아연 안과 연고 USP(항생제 연고)	Bausch & Lomb	24208-780-55
30.5 G 바늘	Becton Dickinson	305106
Spring Scissors	Roboz	RS-5630
Cotton-tipped applicator	Fisher	23-400-125
Paraformaldeyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710	PBS에서 16 %에서 4 %로 희석합니다. 파라포르 말데히는 독성이 있으며 흄 후드에서 사용하고 개인 보호 장비를 착용하십시오.
해부 도구 – 가위, 집게, 주걱	작은 가위: Fine Science Tools	작은 가위:14370-22
큰 가위: Roboz	큰 가위: RS-6820
#55 집게: Fine Science Tools	#55 집게: 11255-20
주걱: Ted Pella, Inc.	주걱 : 13504
설탕	시그마	S8501-5KG	PBS (무게 / 부피)에서 30 % 자당 만들기 (중량 / 부피)
OCT 화합물	VWR	25608-930
무게 보트	USA Scientific	2347-1426
24 웰 플레이트	BD Biosciences	353047
인산 나트륨 일염기	성 시그마	S6566-500G	ddH2O에서 0.2M 인산나트륨 일염기성(PB-A)을 만들고 ddH2O에서 0.2M 인산나트륨 이염기성(PB-B)을 만듭니다. 0.1 M PB를 만들려면 19 ml PB-A와 81 ml PB-B를 결합하고 ddH2O
인산나트륨 이염기성으로	Sigma	S5136-500G
커버 슬립, 22 X 50 mm, No. 1.5	VWR	48393 194
충전 현미경 슬라이드	VWR	48311-703
Vectasheild	Vector Laboratories	H-1200