미세 아교 세포는 세포 외 환경에서 소재를 탐식거나 삼키는 고용량으로 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포이다. 여기 시냅스 구성 요소의 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화 및 측정 광범위하게 적용, 신뢰성, 높은 정량 분석은 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
식균 작용은 세포가 주변 세포 환경에서 자료 (전체 세포, 세포, 이물질 등의 일부를) 침몰 이후에 일반적으로 리소좀의 분해를 통해이 물질을 소화하는 과정이다. 미세 아교 세포는 식세포 기능 신경 퇴행성 질환 건강한 뇌의 발달 (알츠하이머 병의 예, 베타 - 아밀로이드 클리어런스) (즉, 시냅스에서의 조건의 넓은 범위에 설명 된 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포 아르 가지 치기) 1-6. 다음 프로토콜 개발 마우스 retinogeniculate 체제 7 연접 입력 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화하고 계량화하기 위해 개발 말림 분석법이다. 이 분석은 특정 컨텍스트에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하기 위해 사용되었지만, 유사한 접근법은 뇌 (예를 들어, 성상 교세포) 및 신체의 나머지 다른 식세포를 평가하기 위해 사용될 수있다(예를 들어, 말초 식세포)뿐만 아니라 시냅스 리모델링이 발생하는 다른 문맥 (예, 뇌 손상 / 질병).
서론
시냅스 회로는 동물의 생활 전반에 걸쳐 리모델링. 개발 두뇌에서 시냅스가 초과 형성하고 시냅스의 일부를 선택적으로 제거 및 8-10 유지하는 시냅스의 유지 및 강화를 포함 시냅스 가지 치기를 받아야한다. 이 프로세스는 성인 신경계의 정확한 연결 특성을 달성 할 필요가있다. 성인에서, 시냅스 또한 특히 학습 및 기억의 맥락에서 플라스틱 일 수있다. 이 가소성의 구조적 상관 관계가 돌기 쪽과 연접 BOUTONS 11 ~ 13의 추가 및 / 또는 제거를 포함하는 것으로 생각된다. 건강한 신경 시스템의 이러한 역할뿐만 아니라, 시냅스 리모델링은 신경계 질병 / 상해 12,14,15에 참여하고있다. 예를 들면, 척수 손상 후, 절단 축삭이어서 개조 및 기능적 회복 16-19을 달성하기 위해 새로운의 시냅스를 형성한다.
NT는 "> 시냅스 가소성의 중요한 부분으로 신흥 식균 작용 또는 제거 3,5,20 향하는 시냅스의 말림하는 과정입니다. 우리는 최근 건강, 출생 후 마우스의 뇌 7 시냅스 가지 치기의 맥락에서이 현상을 보였다. 특히 , 미세 아교 세포는 상주 CNS 면역 세포와 대 식세포는 피크 기간 동안 발달 시냅스 가지 치기, 시상의 출생 등의 측면 굽은 핵 (....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
RGC 시냅스 입력의 1. 선행 성 라벨
주 : 동물의 사용과 관련된 모든 실험은 모든 NIH의 지침에 따라 검토하고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 감독되었다.
- 필드와 악기를 소독.
- 플렉시 유도 챔버에서 4 부피 %의 이소 플루 란 (이 부피 %의 이소 플루 란 신생아 - 성인 마우스 작동)와 마우스를 마취. 오버 마취 방지하기 위해 밀접하게 쥐를 관찰합니다. 주의 : 진공 배기 가스 배출과 흡입을 피할 것.
- 1-3 분 후, (이전 마우스는 적은 시간이 필요합니다) 마취의 적절한 수준이 꼬리를 곤란하게 (아무 반응이 관찰 될 수 없습니다)와 호흡 속도 (속도가 느리고 꾸준한해야한다) 관찰에 의해 달성되어 있는지 확인합니다.
- 주둥이에 3-4 부피 % 이소 플루 란 (isoflurane)을 제공하는 측면과 장소 코 콘 스테레오 현미경으로 마우스를 놓습니다 (신생아 <생후 10 (P10) ~ 4 부피 %;> P10 ~ 3 부피 %).
- 공막을 노출합니다. 신생아의 주입 전에 아이 오프닝에, 눈꺼풀을 열고 공막을 노출 피부를 뒤로 당겨 작은 봄 가위를 사용합니다. 나이가 쥐의 경우, 공막을 노출하는 눈 주위의 피부를 뒤로 당겨 손가락을 ....
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결과
최근에, 우리는 개발 retinogeniculate 시스템의 시냅스 입력의 미세 아교 세포 - 매개 말림 (그림 1) 7을 시각화하고 정량화이 말림 분석을 사용했다. CX3CR1-EGFP 이형 쥐에서 망막 신경절은 anterogradely 각각 왼쪽과 오른쪽 눈에 CTB-594 및 CTB-647으로 추적했다. 이 추적에 이어, dLGN 내에서 EGFP 양성 미세 아교 세포가 몇 군데 있었다. 이러한 이미지는 이후에 볼륨 측정을 위해 표면 렌더링되었다.
이 기술을 사용하여, 우리는 dLGN (P5) 내에서 개발 시냅스 리모델링의 피크 기간 동안, 시냅스 입력이 미세 아교 세포 (그림 6)에 의해 침몰되는 것으로 나타났습니다. 리모델링 다량 (P9) 거의 완료 될 때 적은 AS 4 일 후, 잠겼 입력의 양의 극적인 감소가있다. 또한, 말림과 가지 치기는 고전적인 보완 폭포에 속하는 단백질이 결핍 된 .......
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토론
식균 작용을 정확하게 측정하기 위해, 재료가 잠겼 리소좀 분해가 발생하면 연구자가 그것을 시각화 할 수있는 방식으로 표시하여야한다. 또, 고해상도 영상은 셀 전체의 볼륨을 시각화하고 그 내용을 정량화 연구원있게 소프트웨어의 사용에 선행 요구된다. 이 프로토콜에서는, 우리는 높은 해상도의 공 초점 현미경 및 3D 재건과 함께 가득 채우고 재료 레이블을 알렉사 염료에 접합 CTB를 사용하여 식세포 매개 말림을 측정하는 매우 안정적이고 정량적 인 방법을 설명합니다. 이 방법은 성공적으로 개발 마우스의 뇌 (retinogeniculate 시스템) 7 시냅스 리모델링을받은 시냅스 입력의 미세 아교 세포 매개-말림을 분석하기 위해 실험실에서 사용되었습니다. 또, unde 다른 발달 연령대 걸쳐 말림의 미묘한 변화를 구분할 수있는 매우 민감한 기술로 입증R 비 병적 인 조건과 야생형과 녹아웃 마우스 사이. 약간의 조정으로,이 프로토콜은 시간 경과 영상 살아있는 조직에서 말림을 연구에 적용 할 수 있습니다. 또,이 프로토.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
,,, NRSA (DPS F32-NS-066698) 작업은 스미스 가족 재단 (BS), 다나 재단 (BS), 존 머크 학자 프로그램 (BS), NINDS (BS RO1-NS-07100801)에서 교부금에 의해 지원되었다 낸시 루리 마크 재단 (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC 이미징 코어).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 히트 패드 | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| 열 패드 용 온수 원 | 켄트 사이언티픽 | TP-700 | |
| 스테레오 현미경 | DSC 광학 | Zeiss Opmi -6 수술 | |
| 현미경 슬라이딩 마이크로 톰 동결 단계 | 라이카 | SM2010 R | |
| 마이크로 톰 블레이드 | 라이카 | 14021607100 | |
| 형광 해부 현미경 | 니콘 | SMZ800 첨부 Epi-fluorescence 부착물 | |
| 회전 디스크 컨포칼 현미경 | Perkin Elmer | UltraView Vox 회전 디스크 컨포칼 | |
| 10 &마이크로; l Hamilton 가스 꽉 주사기 | Hamilton | 80030 | 각 색상 염료 / 추적기에 대해 다른 주사기를 사용하십시오 |
| Hamilton 바늘 | Hamilton | 7803-05, 사양 : 무딘, 1.5 " | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488 : C22841 | 멸균 식염수, 80 µ에서 재구성; L (488), 100 &마이크로; L (594), 20 &마이크로; l (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| 인산염 완충 식염수 ( PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| 네오마이신 및 폴리믹신 B 황산염 및 바시트라신 아연 안과 연고 USP(항생제 연고) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G 바늘 | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring Scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PBS에서 16 %에서 4 %로 희석합니다. 파라포르 말데히는 독성이 있으며 흄 후드에서 사용하고 개인 보호 장비를 착용하십시오. |
| 해부 도구 – 가위, 집게, 주걱 | 작은 가위: Fine Science Tools | 작은 가위:14370-22 | |
| 큰 가위: Roboz | 큰 가위: RS-6820 | ||
| #55 집게: Fine Science Tools | #55 집게: 11255-20 | ||
| 주걱: Ted Pella, Inc. | 주걱 : 13504 | ||
| 설탕 | 시그마 | S8501-5KG | PBS (무게 / 부피)에서 30 % 자당 만들기 (중량 / 부피) |
| OCT 화합물 | VWR | 25608-930 | |
| 무게 보트 | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24 웰 플레이트 | BD Biosciences | 353047 | |
| 인산 나트륨 일염기 | 성 시그마 | S6566-500G | ddH2O에서 0.2M 인산나트륨 일염기성(PB-A)을 만들고 ddH2O에서 0.2M 인산나트륨 이염기성(PB-B)을 만듭니다. 0.1 M PB를 만들려면 19 ml PB-A와 81 ml PB-B를 결합하고 ddH2O |
| 인산나트륨 이염기성으로 | Sigma | S5136-500G | |
| 커버 슬립, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| 충전 현미경 슬라이드 | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
참고문헌
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. ....
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