방법 논문

이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜 제자리에서 애벌레 바다 장어의 하이브리드

DOI:

10.3791/51494

⸱

2014년 10월 14일

 ,  ,  , 
1Centre for Neuroregeneration, School of Biomedical Sciences, University of Edinburgh, 2Shriners Hospitals Pediatric Research Center (Center for Neural Repair and Rehabilitation), Temple University School of Medicine, 3Department of Neurology, Temple University School of Medicine

이 논문에서

요약

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칠성 장어는 완전 척수 손상 후 운동을 복구 할 수 있습니다. 그러나 일부 척추 - 투사 뉴런 좋은 재생기하고 다른 사람은 없습니다. 이 문서는 완전한 척수 transections 생산 및 현장 하이브리드에 대한 wholemount 뇌와 척수를 준비, 주택 바다 칠성 장어 유생 (최근 변화 성인)에 대한 기술을 보여줍니다.

초록

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완전 척수 손상 후 처음 바다 칠성 장어는 절개의 수준 이하로 마비된다. 그러나, 몇 주 후에 운동력을 복구하고,이 propriospinal 축삭 및 뇌간으로부터 돌출-척수 축삭의 재생 단거리 (몇 mm)을 동반한다. 36 대 식별 척추 - 투사 신경 세포 중 일부는 좋은 재생기가 있고 다른 사람은 나쁜 재생기입니다. 이 신경 세포는 쉽게 wholemount CNS 준비에 식별 할 수 있습니다. 선호하는 신경 세포 고유의 메커니즘을 이해하거나 척추 동물의 중추 신경계에 손상 후 축삭 재생을 억제하기 위해, 우리는 좋고 나쁜 재생기 간의 유전자 발현의 차이를 결정하는 방법과 표현은 척수 절개에 의해 영향을 받는다. 이 논문은 미세한 비전 아래 완전 척수 transections을 생산하고, BR을 준비하고, 신선한 물 탱크에서 주택 애벌레에 대한 기술과 최근 변화 성인 바다 칠성 장어를 보여줍니다아인 및 현장 하이브리드에 대한 척수 wholemounts. 간단히, 동물은 16로 유지됩니다   C를 °와 칠성 장어의 벨소리에 1 %의 벤조 카인에 마취. 척수 등쪽 접근 방식을 통해 홍채 절제술 가위로 가로로하고, 동물은 23 ° C에서 신선한 물 탱크에 복구 할 수 있습니다. 현장 하이브리드의 경우, 동물 reanesthetized하고 뇌와 코드가 지느러미 접근 방식을 통해 제거했다.

서론

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포유 동물에서 척수 손상 (SCI)는 부상 축삭은 외상 영역을 통해 재생과 적절한 대상에 다시 연결하지 않기 때문에 부상의 사이트 아래 기능의 영구적 인 손실로 이어지는 치명적인 조건이다. 포유류는 달리, 칠성 장어는 완전한 척수 손상 후 운동력을 복구. 1 흥미롭게 칠성 장어 때문에 그들의 큰 크기 2,3 (도 1)의 뇌 제제 마운트 전체 36 척수에서 개별적으로 식별되어 뉴런 돌출 세트를 가지고 . 이러한 척추-돌출 뉴런은 모두 높은 수준의 완전한 척수 절개하여 axotomized된다. 우리 그룹 등의 이전의 연구는 다른 일반적으로 손상 부위를 통해 자신의 축삭을 재생하는 동안, 심지어 이러한 뉴런의 일부는 매우 낮은 재생 능력을 보여 SCI 후 기능 회복의 존재 (그들이 "나쁜 재생기를"으로 간주된다) 것으로 나타났다 (그들이 간주된다 "g짐 우드 재생기 "). 2,3이 특성은 칠성 장어에게 차례를 시도 뉴런의 고유 재생 능력의 차이로 이어질 것입니다 좋고 나쁜 재생기 척추 - 투사 신경 세포 간의 유전자 발현의 차이를 연구하는 재미있는 척추 동물 모델을 만드는 같은 외부 환경에서 축삭을 재생. 1

우리가 이전에 보여 주었다이 모델을 사용하여 척추 - 투사 각각 netrin와 RGM의 억제 작용을 매개 UNC5 4,5 및 neogenin, 6 등의 축삭지도 분자 수용체의 낮은 재생 능력 쇼 식 뉴런. 또한,이 방법을 사용하여 우리의 그룹은 단지 좋은 재생기가 손상 후 및 재생 공정 동안에 neurofilaments의 표현의 회복을 보여주는 것으로 나타났다. 최근 부시 모건 7은 나쁜 재생기가 increas를 표시하는 면역에 의해 보여 주었다"나쁜 재생기"척추 - 투사 신경 세포가 서서히 완전한 척수 절개의 5,7,8 후 사망 사실을 저자가 관련되어 부상 후 시누 클레인의 에드 표현. 그래서 완전한 척수 손상의 칠성 장어 모델은 척수 투사 신경 세포 axotomy 후 "나쁜 재생기를"무엇이 이해하는 매우 유용한 모델로 등장했다.

우리는 현장 하이브리드 화에 wholemount 수행 손상 후 원하는 시점에서 완전한 척수 절개 수술 프로토콜과 후방 뇌 해부를 수행하는 우리의 연구를 수행합니다. 본 방법론 기사에서 우리는 애벌레 칠성 장어의 완전 척수 손상 수술의 적절한 성능에 대한 자세한 프로토콜을 제시, 동물의 후속 유지 보수 및 현장 하이브리드 화에 wholemount에 대한 최종 뇌의 해부 및 뇌의 준비. 자세한 프로토콜 퍼가기합니다유생 칠성 장어의 뇌에서 원위치 혼성화 wholemount을 rform는 이전에보고 된 바있다. 9는 또한, 척수 손상 및 뇌 해부 본 프로토콜은 또한 다음, 면역 조직 화학 또는 다른 조직 학적 방법에 대한 뇌를 처리하는 데 사용될 수있다.

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프로토콜

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이 프로토콜에 사용되는 모든 재료는 표 1을 참조하십시오.

실험은 템플 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1 동물

  1. 야생형 애벌레 바다 칠성 장어 (Petromyzon 스 marinus L.)를 얻어, 10 - 메인에서 델라웨어 강 (펜실베니아) 또는 스트림 지류에서 미시간 호수를 공급 스트림에서 - (7 세 4)의 길이는 14 센티미터.
  2. 16 ° C에서 50갤런 담수 탱크 (100) 동물 - 실험실에서, 50 그룹의 유충을 유지한다. 선 자갈 인치와 탱크 애벌레에서 굴을하기 위해, 물은 숯 여과하고 그들 칠성 장어하기 전에 염소 및 기타 불순물을 제거하기 위해 최소 48 시간 동안 공기 돌을 조절한다. 사용 일까지, 자신의 암성 재활용 동물, 먹이를 할 필요는 없다.

2 완전 척수코드 절개

  1. 척수 수술하기 전에 다음과 같은 조성으로 심고 링거 용액 제조 : 110 mM의 염화나트륨, 2.1 mM의 KCl을 2.6 mM의 염화칼슘, 1.8 mM의 MgCl2를, 10 mM 트리스 완충액을; pH가 7.4.
  2. 척수 절개를 수행하려면 작은 용기에 유충을 배치 얼음 차가운 링거 용액 1 % tricaine 메탄으로 마취합니다.
  3. 마취 대신 일단 반 실 가드 (실리콘) 가득 배양 접시에있는 동물과 하나가 꼬리에, 동물의 주둥이에 하나씩 배치 (수술 위치에있는 동물을 잡아 4 곤충 핀 (0.15 mm 직경)를 사용 그리고이 다섯 번째 아가미의 수준에서). 거의 링거 용액으로 가기까지 배양 접시를 채 웁니다. 실체 현미경을 이용하여 수술을 수행하는 동안 얼음에 유충으로 요리를 넣습니다.
  4. 척수 절개에게 등쪽을 수행하려면, 정중선, 5 번째의 레벨 메스 (# 11)와 세로 절개아가미는 척수를 시각화합니다. 초기에 피부가 위로 향하게 척수 이상에서 알 수있는 때까지 근육 조직이 매우 부드럽게 절단 메스 블레이드의 선단을 삽입함으로써 개방된다. 패션이 곤충 핀에서 후크와 척수 절개를 수행하는 동안 몸의 벽이 열려 유지하는 데 사용할.
  5. 완전히 가위 (8 Castroviejo #)를 이용하여 제 5 아가미의 수준에서 척수를 쪼개다 척수에 수직으로 위를 삽입한다. 척수가 완전히 한 깨끗한 잘라 가로로해야합니다. 척수가 완전히 가로로되어 있음을 확인하기 위해 실체 현미경 척수 절단 단부를 시각화. 그리고, 한 쌍의 집게 (# 5)를 사용하여 절개 후 척수의 절단 단부를 재조정.
  6. 척수 절개 미세 집게 한 쌍의 지느러미 몸 벽에 상처를 닫고 상처 t 수 있도록 1 시간 동안 얼음에 유충을 넣어 수행 한 후오 건조. 얼음 및 유충 사이 필터 종이 조각을 넣고 심고 링거 용액에 담가. 낮은 온도는 건조 따라서 감염을 방지 할 수 있도록 공기에 상처를 허용 동시에 살아있는 동물을 유지한다.
  7. 그런 다음 24 시간 동안 얼음 냉수 작은 탱크 유충 (1 조 당 한 유충)를 전송합니다.
  8. 행동면 부상의 사이트에 더 이동 꼬리가 없음을 확인하기 위해 척추 절개 후 병변 애벌레 일일를 검사합니다. 유충 (5 번째 아가미의 수준에서) 부상의 사이트에만 머리의 주동이를 이동할 수 있습니다 경우 척수 절개가 완료된 것으로 간주됩니다. 이 경우는 현재 23 유생 (실온에서 담수와 탱크 (1 조 당 한 유충)으로 전송 될 수있다 ° C)는 그들이 선택한 시점에 복구 할 수 있습니다.
  9. 회복 기간 중 매일 2-3일 물을 변경합니다.

3 뇌 해부 및 준비현장 하이브리드 화에 대한 뇌

  1. 부상 후 원하는 시점에서 애벌레 바다 칠성 장어와 장소를 다시 마취 상기와 같이 뇌 해부를 수행하기 위해 링거 용액과 페트리 접시에 그들을 핀.
  2. 뇌를 해부하려면 먼저 콧 구멍과 뇌의 장기 사이의 메스 횡 절개를합니다. 여기에서 한 쌍의 집게로 잡고 Castroviejo 위의 쌍을 이용하여 뇌를 둘러싸고있는 조직을 절단하기 시작한다.
  3. 뇌가 노출되면, 한 쌍의 집게를 이용하여 맥락총를 제거하고 뇌 신경을 동물의 머리를 확산하고 노출시키는 후크를 사용한다. 이어서, Castroviejo 가위와 척수 횡 절단. 뇌를 해부 두개골 신경을 잘라 집게의 또 다른 쌍을 사용하는 동안 집게 한 쌍의 척수를 잡습니다.
  4. 절개 후, 실리콘의 작은 조각에 뇌를 넣고이 기능을 삽입하여 위치를 잡고척수 후각 전구 및 하나의 요법 핀입니다. 그런 다음, 후방 및 가위로 지느러미 중간 선을 따라 뇌의 cerebrotectal commissures을 절감하고 측면 날개의 판을 편향과 4 곤충 핀 (그림 2)와 실리콘에 평평하게 고정.
  5. 회에 3 시간 동안 방 temparature로 고정 인산염 완충 생리 식염수에 4 % 파라 포름 알데히드 (산도 7.4)를 포함하는 튜브에 뇌와 실리콘의 조각을 전송합니다.
  6. 전술 한 바와 같이 고정 후 현장 하이브리드 화에 wholemount을 위해 뇌를 사용 (스웨인 외., 1994). 제어 또는 허위 조작 동물의 뇌 부상 동물의 뇌와 병렬로 항상 실행해야합니다. wholemounted 애벌레 뇌 때문에 평평하고 얇은 모양과 인해 뇌가 상당히 투명하게 수초 (10)의 부재에 현장 하이브리드 화에 의해 연구 될 수있다.

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결과

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이 방법을 사용할 때 얻을 수있는 결과의 예를 들어, 식별 척수-돌출 제어의 신경 세포와 이주의 neogenin 성적 증명서의 발현을 보여주는 wholemounted 뇌의 대표 이미지는 병변 애벌레 바다 칠성 장어는 그림 2에 나타내었다 게시 할 수 있습니다. 독자는 완전한 척수 절개 및 자세한 사항은 바다 칠성 장어의 신경 세포를 돌출 식별 척수의 재생 능력 후 neogenin의 표현 사이의 관계를보고 이전의 연구 (6)라고합니다. 간략하게, 결과는 식별 척수 손상 후 신경 세포 - 돌출 neogenin 수용체의 발현에 변화가 있음을 보여 주었다. neogenin 수용체 우선적 M1, I1, I2, I4, 또는 M의 뉴런 (도 2b 참조)이 결과는 결과를 보여 같은 나쁜 재생기로 표현되는 완전한 척수 절개 후 두 주및 프로토콜의 neogenin 수용체가 이들 세포의 재생의 실패에 관여 할 수 있음을 시사한다.

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토론

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여기에서 우리는 애벌레 바다 칠성 장어의 완전 척수 절개 후방 뇌 해부를 수행하기 위해 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 원위치 혼성화에 전체 실장 뇌에 의한 척수 손상 후 척수 식별 돌출 뉴런 간의 유전자 발현의 차이를 분석한다. 절차에서 중요한 단계는 부드럽게 한 쌍의 유충의 주둥이를 터치하여 24 시간 후 stereomicrocope 하에서 척수의 절단 단부를 관찰함으로써 제어되고 확인 될 수있는 완전한 척수 절개의 정확한 수행한다 상처 부위에 어떠한 움직임 꼬리가없는 경우 집게 표시한다. 또한, 수술에 사용되는 가위 무딘 아닌 동물의 회복을위한 중요한 한 깨끗한 절단이 완전히 척수 쪼개다 위해 수행된다는 것이다.

부상 후 동물의 생존은 매우 ANIM을 유지하여 개선수술 중 및 제 24 시간 동안 공기 건조한 후 얼음 냉수에 상처를 허용하는 데 사용되는 시간 동안 얼음에 ALS. 이 기간 후에 상처 닫히고 동물은 이미 실온에서 담수와 탱크로 이송 될 수있다.

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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NIH 보조금 NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 Michael E. Selzer 박사의 지원; Shriners Research 보조금 SHC-85220을 Michael E Selzer 박사에게 수여합니다. 및 Shriners Research Grant SHC-85310을 Michael I. Shifman 박사에게 수여합니다. 안톤 바레이로-이글레시아스 박사는 Fundación Barrié(스페인)와 Xunta de Galicia(스페인 갈리시아)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PBS의 트리카인 메탄 설포네이스펙트럼TR108벤조카인 포화 용액
#3Fine Science Tools (FST)10003-12
메스용 블레이드: #11Fine Science Tools 10011-00
Castroviejo 가위 #8Fine Science Tools 15002-08
겸자 #4 & #5Dumont, SwitzerlandRoboz RS4955#4 척수 해부용; #5 수갑 박리용
해부 현미경OlympusSZ51
SylgardDow Corning Co.184
곤충 핀 0.15, 0.20 mmAusterlitz뇌 및 척수 고정을위한 카탈로그 # 0.15 mm; 몸 0.20 mm
캡이있는 7 ml HDPE 섬광 튜브Fisher Scientific03-337-1
파라 포름 알데히드 16 %전자 현미경 과학 (EMS)19210PBS에서 4 %로 희석
희생 메스를 위한 트

참고문헌

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  1. Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
  2. Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
  3. Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
  4. Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
  5. Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
  6. Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
  7. Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
  8. Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
  9. Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
  10. Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
  11. Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neuroscience. 90, 957-965 (1999).

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