늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색 초파리 조직 제자리에서

요약

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

초록

초파리에서 수행 연구는 배아 및 유충은 세포의 운명 사양 및 기관 형성 등의 발생 과정에 중요한 통찰력을 제공 melanogaster. 면역 염색은 조직 및 기관의 개발 시각화한다. 그러나 배아의 끝 부분에 형성하는 보호 표피 늦게 단계의 배아 및 유충에 항체의 투과를 방지 할 수 있습니다. 면역 염색 전에 절개 정기적 초파리 유충의 조직을 분석하는 데 사용되는 반면 작은 조직 찾아서 분리하기 어려울 수 있기 때문에, 그것은 어떤 분석 비효율적 증명한다. 초음파는 애벌레 초파리 면역 염색 프로토콜의 해부에 대한 대안을 제공합니다. 늦은 단계의 배아 및 유충의 대량의 빠른 동시 처리 가능하며 현장 형태로 유지한다. 포름 알데히드에 고정 후, 샘플을 초음파 처리한다. 샘플은 다음 항원 특정 기본 개미와 면역 염색을 실시ibodies 및 형광 표지 이차 항체는 형광 현미경을 통해 표적 세포 유형 및 특정 단백질을 가시화한다. 초음파 처리의 과정에서, 상기 시료에 초음파 프로브뿐만 아니라, 초음파의 강도와 지속 시간의 적절한 배치가 중요하다. 표준 면역 프로토콜로 부가적인 약간의 수정은 고품질의 얼룩을 위해 필요할 수있다. 잡음비 낮은 신호에 대한 항체, 긴 배양 시간은 통상적으로 필요하다. 이 초음파 - 촉진 프로토콜에 대한 개념의 증거로서, 우리는 발달 단계의 범위에서 세 가지 조직 유형 (고환, 난소 및 신경 조직)의 면역 염색을 보여줍니다.

서론

초파리의 배아 및 유충은 많은 기관과 조직의 발달 과정을 연구 할 수있는 좋은 모델을 제공합니다. 개별 세포의 세포 이미징을 개발하는 복잡한 환경을 확인하기 위하여, 이들 연구에서 종종 필요하다. 조직에서 세포의 면역 염색을 통해 시각화 달성 될 수있다. 프로토콜 17 시간 달걀 누워 (AEL) ^1-3 후 배아 초파리 조직 <존재하는 면역 염색 잘 설명했다. 효과적인 항체의 투과를 방지하는 배아의 단부를 향해 그러나 보호 표피 형태. 따라서, 이러한 면역 염색 프로토콜은 늦게 단계의 배아에서 조직의 분석과 애벌레 개발 ^{(1 차} 령 (L1), 2 ^차 령 (L2), 및 3 ^차 령 (L3))의 후속 단계에서 비효율적이다. 이 비 효율성이 확장 개발 기간 ⁴ 중 발생하는 동적 프로세스에 대한 우리의 이해에 장벽을 부과한다. 담배 마는UE 절제술이 장벽 ^5-7을 우회 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. 그러나, 해부 비효율적 증명할 수 있습니다. 추출은 위치 또는 배아와 애벌레 조직을 분리하는 어려움에 의해 방해를 할 수있다. 또한, 표적 조직의 물리적 제거를 파열 또는 그 전체를 추출하기 위해 실패에 의해 손상 될 수 있습니다.

프로토콜

컬렉션 케이지의 1 준비

1. CO ₂ 젊은, 비옥 한 파리를 마취. 케이지에 마취 파리를 전송합니다. 최적의 수율을 얻을 수 사에 나이 2~7일에 이르기까지 100-120 성인 파리를 사용하려면 다음과 남성에 대한 여성의 한 비율입니다. 파리에게 적절한 순응 기간을 허용 ~ 24 시간 고정을 위해 샘플을 획득하기 전에. 48 시간 순응 기간 - 케이지가 처녀 여성으로 설정 한 경우 남성에 사용 36를 결합.
2. 케이지의 개방 단부에서 케이지의 구멍에 중심에 효모 페이스트의 한푼 크기의 방울 미리 준비된 사과 주스 한천 플레이트를 배치합니다. 그런 다음, 테이프로 고정합니다. 사과 주스 한천 플레이트와 파라 필름와 케이지의 접합부를 밀봉.
3. 염기로서 사과 쥬스 한천 플레이트와 보조 용기에 케이스를 놓고 실험에 의해 결정된 바와 같이 파리 적절한 기간에 대해 정의 된 온도에서 재현 할 수있다.
   참고 : 시료 채취 시간 위스콘신다를 것이다. 후기 배아 / 초기 L1 유충 수집 할 때 예를 들어, (17-24 시간)를, 파리는 25 ° C에서 17 시간 동안 사전 샘플의 노화에 25 ℃에서 7 시간 동안 사과 주스 한천 접시에 알을 낳기 위해 수 있습니다. 마찬가지로, 중반 후반 첫번째 령 애벌레의 컬렉션 (36-48 ....

결과

마지막 단계의 배아와 현장에서 애벌레 조직의 분석 초음파 기반의 면역 염색의 효능을 입증하기 위해, 야생 형 배아 및 유충은 고환, 난소의 면역 및 신경 조직을 위해 처리 하였다. 샘플은 공 초점 현미경을 통해 몇 군데 있었다 대표적인 결과는 (그림 1과 그림 2)를 나타낸다. 결과는 설명 프로토콜은 초파리 개발의 늦은 배아 초기 통해 / 중간 L3 단계에서 형태 적 특징뿐만 아니라 현장에서 개별 세포를 시각화하는 효과가 있음을 알 수있다.

고환 발현 사이의 결과 :
정소 발달 고환의 성숙이 유충 발달에 걸쳐 동적이기 때문에 프로토콜 효능을 예시하기위한 특히 좋은 시스템이다. 성인 초파리 ^{고환, 13} 참조 (생식 줄기 세포 (GSC) 틈새가 위치해 한 블라인드 끝으로 코일 튜브를 형성리뷰 14). 이 틈새에서, GSC를 허브.......

토론

이 프로토콜은 성공적 따라서 박리를위한 필요성을 제거 반응계에서 초파리 배아와 유충 표적 조직 발현 사이하는 방법을 제공한다. 초기 배아에게 ^1,2,3 염색을 위해 사전 프로토콜에 따라, 융모막 멤브레인은 50 % 표백제 (NaOCl을)를 사용하여 제거한다. 샘플은 포름 알데히드와 메탄올에 고정되어 있습니다. 애벌레 표피가 떠있는 오래된 샘플을 발생하기 때문에, 전체 샘플은 애벌레 보존을 보장하기 위해 셀 스트레이너를 통해 전달됩니다. 샘플은 화학적 등급 메탄올, 원하는 경우, 기억된다. 재수 화 한 후, 적절히 구현 초음파 처리는 유생 표피의 무결성을 방해. 이것은 면역 염색에 필요한 항체의 충분한 침투 수 있도록 표피 형성 한 후 중요합니다. 5 % 정상 혈청 샘플을, 항체를 적용 흔들 전에 / BBTw 솔루션은 과도한 특이 항체 바인딩을 방지 할 수 있습니다. 일차 항체는 특정 단백질을 검출 EXPRES 첨가표적 조직에 나오지. 언 바운드 차 항체를 제거하기 위해 세척 한 후, 형광 물.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
표 1: 시약 및 완충액
인산염 완충제 Triton X-100 (PBTx)			5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. RT에 보관하십시오.
인산염 완충 식염수 10X (PBS 10X)			dH2O에서 1L: 80g NaCl, 2g KCl, 14.4g Na2HPO4, 2.4g KH2PO4. 구성 요소를 추가하고 적절한 볼륨으로 채웁니다. 4 °C에 보관하십시오.
트리톤 10%			50ml: 트리톤 5ml, PBS 10X 5ml, ddH2O 45ml를 섞습니다. RT에 보관하십시오.
PEMS			0.1m 파이프(pH 6.9), 2.0mM MgSO4, 1.0mM EGTA. RT에 보관하십시오.
파이프			: 0.25M 용액 (pH 6.9) 400ml : 30.24g 파이프 dH 2 < / sub>0 NaOH. 파이프를 300ml dH2O에 녹인 다음 NaOH로 pH 6.9로 조정합니다. dH2O 및 오토클레이브로 총 부피를 400ml로 가져옵니다. RT에 보관하십시오.
포름 알데히드			: 메탄올 중량 기준 37 % 포름 알데히드. RT에 보관하십시오. 포름알데히드, 헵탄 및 메탄올 폐기물 혼합물을 기관 지침에 따라 처리하기 전에 흄 후드에 단단히 밀봉된 용기에 보관하십시오.
헵탄		CAS 142-82-5	n- 헵탄. RT에 보관하십시오. 포름알데히드, 헵탄 및 메탄올 폐기물 혼합물을 기관 지침에 따라 처리하기 전에 흄 후드에 단단히 밀봉된 용기에 보관하십시오.
메탄올		CAS 67-56-1	RT에 보관하십시오. 포름알데히드, 헵탄 및 메탄올 폐기물 혼합물을 기관 지침에 따라 처리하기 전에 흄 후드의 단단히 밀봉된 용기에 보관하십시오.
인산염 완충액 트윈 (PBTw)			1 L 만들기 : 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml 트윈 10%. 필터는 모든 구성 요소를 추가한 후 살균합니다. 4 °C에 보관하십시오.
트윈 10%			50ml: 트윈 5ml, PBS 10X 5ml, ddH2O 40ml Rock 혼합. RT에 보관하십시오.
소 혈청 알부민/인산염 완충액 트윈(BBTw)			1 L 만들기: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml 트윈 10%, 1 g 소 혈청 알부민(BSA). BSA를 첨가한 다음 0.2 &mu를 사용하여 살균합니다. M 진공 필터 장치. 4 °C에 보관하십시오.
일반 염소 혈청 (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	10 ml 만들기 : 일반 염소 혈청 10 ml ddH2O. NGS 바이알에 ddH2O를 첨가하고 0.2 &mu를 사용하여 살균합니다. M Syrninge Filter. 부분 표본은 -20 °C에서 저장합니다.
1,4-diazabicyclo [2.2.2] 옥탄 (DABCO)		CAS : 281-57-9	100 ml를 만들려면 : 25 ml ddH 2 < / sub>O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), DABCO 고체 2.5 g, 3.5 ml 6N HCl, 250 μ l 10N NaOH, 70 ml의 글리세롤. 교반 막대가 있는 250ml 비커에 ddH2O, Tris HCl 및 DABCO를 추가합니다. 저어 6N HCl, 10N NaOH 및 글리세롤을 첨가합니다. 그런 다음 용액이 pH 7.5에 도달 할 때까지 10N NaOH를 적가합니다. 부분 표본. 부분 표본은 -20 °C에서 저장합니다.
DABCO + p- 페닐 렌 디아민 (PPD) 용액			1.765 ml NaHCO 3 < / sub>, 0.353 Na2 < / sub>CO3< / sub>, 0.02 g PPD (CAS : 106-50-3). NaHCO3 및 NaCO3 용액에 PPD를 용해합니다. 60 추가 μ l의 PPD 용액 500 μ DABCO의 l. 부분 표본은 -20 °C에서 저장합니다.
사과 주스 플레이트			~ 200 접시를 만들려면 : 45g 한천 (CAS # 9002-18-0), 45g 과립 설탕 (매장 구입), 500ml 사과 주스 (매장 구매), 15ml Tegosept 10 %, 1.5 ml ddH 2< / sub>O. 4L 플라스크에 한천을 ddH 2 < / sub >O에 추가 한 다음 30 분 동안 고압멸균합니다. 가열 된 교반 플레이트에 사과 주스와 설탕을 섞습니다. 점차적으로 사과 주스 혼합물을 오토클레이브 한천에 첨가하십시오. 가열된 교반 플레이트에 혼합한 다음 10ml 부피를 35mm 페트리 접시에 분취하고 RT에 두어 굳힙니다. 4 °C에 보관하십시오.
Tegosept 10 %			100ml를 만들려면 : 10g Tegosept, 100ml 에탄올. 부분 표본은 -20 °C에서 저장합니다.
효모 페이스트			~ 건조 활성 효모 50g. 페이스트 같은 농도가 될 때까지 저으면서 효모가 들어있는 비커에 ddH2O를 점차적으로 첨가합니다. 4 °C에 보관하십시오.
표 2: 염색 재료
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, 5mg/ml의 재고.
토끼 안티 바사			1:250, 루스 레만의 선물.
마우스 anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, Dorthea Godt의 선물(Li et al, 2003).
마우스 안티 프로스페로	발달 연구 하이브리도마 은행(DSHB)	프로스페로 MR1A	1:10
쥐 안티 엘라브	발달 연구 하이브리도마 은행(DSHB)	7EBA10	1:30
마우스 안티 레포	발달 연구 하이브리도마 은행(DSHB)	8D12	1:10
염소 안티 토끼 Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
염소 안티 마우스 Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
염소 안티 구니에 돼지 Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
염소 안티 랫 Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
표 3: 재료 및 장비
플라이 케이지	수제; Genesee Scientific Corporation	해당 사항 없음; 병 : 32-130; 사전 제작 된 케이지 : 59-101	400rpm에서 복합 마이터 톱으로 투명 캐스트 아크릴 튜브 (직경 1 3/4 인치)를 4 인치 높이의 세그먼트로 절단하여 제작되었습니다. 초미세 스테인리스 스틸 스크리닝(아크릴 콤푼드 접착제로 욕조의 한쪽 끝에 부착되었습니다. 빈 파리 사료 병을 사용하는 대체 방법은 Drosophila 프로토콜 ISBN 0-87969-584-4에서 찾을 수 있습니다. 케이지는 Genesee Scientific Corporation에서 구입할 수도 있습니다.
초음파 발생기 : Branson 250 디지털 소닉 파이어	Branson	모델 : Branson Digital Sonifier 250
Sonicator 프로브	Branson	모델 # : 102C (CE)	EDP : 101-135-066; S / N : OBU06064658
주사기 필터	Nalgene	190-25-20	0.2 μ m 셀룰로오스, 아세테이트 멤브레인 필터
이미징 시스템: 다색 광원, 디지털 CCD 카메라 및 이미징 소프트웨어가 있는 스피닝 디스크 컨포칼 현미경	현미경: Olympus, 광원: Lumen Dynamics, 카메라: Q-Imaging, 이미징 소프트웨어: Intelligent Imaging Inc.		현미경: BX51 DSU 회전 디스크 장착, 광원: X-Cite 120Q, 카메라: RETIGA-SRV, 이미징 소프트웨어: Slidebook 5.0
진공 필터 유닛	Nalgene	450-0020	0.2 μ M 셀룰로오스 질산염 멤브레인 필터