방법 논문

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색 초파리 조직 제자리에서

DOI:

10.3791/51528

⸱

2014년 8월 14일

 ,  , 
1Department of Biology, College of William & Mary

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

초록

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초파리에서 수행 연구는 배아 및 유충은 세포의 운명 사양 및 기관 형성 등의 발생 과정에 중요한 통찰력을 제공 melanogaster. 면역 염색은 조직 및 기관의 개발 시각화한다. 그러나 배아의 끝 부분에 형성하는 보호 표피 늦게 단계의 배아 및 유충에 항체의 투과를 방지 할 수 있습니다. 면역 염색 전에 절개 정기적 초파리 유충의 조직을 분석하는 데 사용되는 반면 작은 조직 찾아서 분리하기 어려울 수 있기 때문에, 그것은 어떤 분석 비효율적 증명한다. 초음파는 애벌레 초파리 면역 염색 프로토콜의 해부에 대한 대안을 제공합니다. 늦은 단계의 배아 및 유충의 대량의 빠른 동시 처리 가능하며 현장 형태로 유지한다. 포름 알데히드에 고정 후, 샘플을 초음파 처리한다. 샘플은 다음 항원 특정 기본 개미와 면역 염색을 실시ibodies 및 형광 표지 이차 항체는 형광 현미경을 통해 표적 세포 유형 및 특정 단백질을 가시화한다. 초음파 처리의 과정에서, 상기 시료에 초음파 프로브뿐만 아니라, 초음파의 강도와 지속 시간의 적절한 배치가 중요하다. 표준 면역 프로토콜로 부가적인 약간의 수정은 고품질의 얼룩을 위해 필요할 수있다. 잡음비 낮은 신호에 대한 항체, 긴 배양 시간은 통상적으로 필요하다. 이 초음파 - 촉진 프로토콜에 대한 개념의 증거로서, 우리는 발달 단계의 범위에서 세 가지 조직 유형 (고환, 난소 및 신경 조직)의 면역 염색을 보여줍니다.

서론

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초파리의 배아 및 유충은 많은 기관과 조직의 발달 과정을 연구 할 수있는 좋은 모델을 제공합니다. 개별 세포의 세포 이미징을 개발하는 복잡한 환경을 확인하기 위하여, 이들 연구에서 종종 필요하다. 조직에서 세포의 면역 염색을 통해 시각화 달성 될 수있다. 프로토콜 17 시간 달걀 누워 (AEL) 1-3 후 배아 초파리 조직 <존재하는 면역 염색 잘 설명했다. 효과적인 항체의 투과를 방지하는 배아의 단부를 향해 그러나 보호 표피 형태. 따라서, 이러한 면역 염색 프로토콜은 늦게 단계의 배아에서 조직의 분석과 애벌레 개발 (1 차 령 (L1), 2 차 령 (L2), 및 3 차 령 (L3))의 후속 단계에서 비효율적이다. 이 비 효율성이 확장 개발 기간 4 중 발생하는 동적 프로세스에 대한 우리의 이해에 장벽을 부과한다. 담배 마는UE 절제술이 장벽 5-7을 우회 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. 그러나, 해부 비효율적 증명할 수 있습니다. 추출은 위치 또는 배아와 애벌레 조직을 분리하는 어려움에 의해 방해를 할 수있다. 또한, 표적 조직의 물리적 제거를 파열 또는 그 전체를 추출하기 위해 실패에 의해 손상 될 수 있습니다.

초음파는 분자간 상호 작용을 방해 음파를 이용하는 방법입니다. 이는 신경 세포 유형 6을 개발하기 위해 발현 사이 초파리 유충 표피의 무결성을 파괴하는데 사용되어왔다. 이 프로토콜은 늦게 단계 배아 직경 8 ~ 10 년으로 50μm 작게 할 수있다 애벌레 생식선을 발현 사이하도록하고있다. 이러한 연구를 통해, 수컷 생식선 줄기 세포 (GSC) 틈새 형성 과정이 말기에있어서 한 줄기 세포 발달과 DIF 조절 초파리 배아 8-10 및 메커니즘후기 배아 생식선 및 유충의 ferentiation 9-12을 밝혀왔다. 따라서, 초음파로 인해 조직의 크기가 어려울 수 있습니다 조직 절개에 대한 효율적인 대안을 제공합니다. 또한, 전체 유기체의 컨텍스트 내에서 셀을 떠나 시츄 형태로 유지 시츄 초파리 조직의 면역 염색을 가능하게한다. 여기에, 우리는 현장에서 초 / 중반 L3 조직을 통해 늦게 단계 배아의 형광 면역 염색에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 초파리 생식선 및 신경 조직의 분석은이 프로토콜의 효능을 입증하기 위해 대표 결과에 나타낸다. 또한,이 면역 프로토콜은 외부 표피와 기타 다른 초파리 생물 조직뿐만 아니라 조직을 분석하도록 구성 될 수있다.

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프로토콜

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컬렉션 케이지의 1 준비

  1. CO 2 젊은, 비옥 한 파리를 마취. 케이지에 마취 파리를 전송합니다. 최적의 수율을 얻을 수 사에 나이 2~7일에 이르기까지 100-120 성인 파리를 사용하려면 다음과 남성에 대한 여성의 한 비율입니다. 파리에게 적절한 순응 기간을 허용 ~ 24 시간 고정을 위해 샘플을 획득하기 전에. 48 시간 순응 기간 - 케이지가 처녀 여성으로 설정 한 경우 남성에 사용 36를 결합.
  2. 케이지의 개방 단부에서 케이지의 구멍에 중심에 효모 페이스트의 한푼 크기의 방울 미리 준비된 사과 주스 한천 플레이트를 배치합니다. 그런 다음, 테이프로 고정합니다. 사과 주스 한천 플레이트와 파라 필름와 케이지의 접합부를 밀봉.
  3. 염기로서 사과 쥬스 한천 플레이트와 보조 용기에 케이스를 놓고 실험에 의해 결정된 바와 같이 파리 적절한 기간에 대해 정의 된 온도에서 재현 할 수있다.
    참고 : 시료 채취 시간 위스콘신다를 것이다. 후기 배아 / 초기 L1 유충 수집 할 때 예를 들어, (17-24 시간)를, 파리는 25 ° C에서 17 시간 동안 사전 샘플의 노화에 25 ℃에서 7 시간 동안 사과 주스 한천 접시에 알을 낳기 위해 수 있습니다. 마찬가지로, 중반 후반 첫번째 령 애벌레의 컬렉션 (36-48 시간) 파리 25 ° C에서 36 시간 동안 사전 샘플의 노화에 25 ° C에서 12 시간 동안 알을 낳기 위해 수 있습니다.
  4. 기간이 완료되면 파리 마취없이 떨어져 사과 주스 한천 플레이트에서 드롭 있도록 테이블에 새장을 누릅니다. 신속 효모 페이스트의 방울을 함유 한 신선한 플레이트로 사용을 대체. 테이프와 파라 필름으로 신선한 판을 고정베이스로 사과 주스 한천 플레이트와 케이지를 저장합니다.
  5. 조심스럽게 금속 주걱 사용 된 플레이트에서 효모 강하를 제거합니다. 실험적으로 필요한 경우 장소 사용되는 사과 주스 접시에 뚜껑 나이에 배아를 마련 할 수 있습니다.
    참고 : 샘플을 노화 동안 판은 25 ° C에서 저장 될 수있다 높은 온도가 experimenta가 아니라면에서야이 필요합니다. 상기 기술 한 바와 같다 수집을위한 배아를 나이하는 방법의 예 (단계 1.3 참고 사항을 참조하십시오). 노화를 샘플링하기 전에 효모 페이스트의 제거는 효모에 크롤 링 아래 한천을 깨는에서 유충을 방지하기 위해 수행된다. 나머지 사과 주스 한천과 효모 붙여 넣기 잔류 애벌레 성장을위한 영양분을 제공합니다. 효모 페이스트에 직접 배치 배아 효모 페이스트 제거를 통해 손실되는 반면,이 손실은 염색 효율을 줄일 수있는 샘플 효모 및 한천 잔류하는 것이 바람직하다. 하나는 효모 페이스트를 제거하지 않도록 선택한 경우, 효모는 페인트 브러시와 혼합, 인산염 버퍼 트리톤 X-100 (PBTx)와 액화 한 후 이전에 고정에 셀 스트레이너를 사용하여 샘​​플에서 제거 할 수 있습니다.

2 고정

  1. 사과 주스 한천 플레이트에 배치 배아가 원하는 시점에 세되면, 조심스럽게 일에서 샘플을 제거 인산 버퍼 트리톤 X-100 (PBTx) 용액에 적신 작은 붓을 사용하여전자 판.
    참고 : 이전 애벌레 이동하고 뚜껑의 안쪽에 크롤링 할 수 있습니다. 이 샘플은 페인트 브러시와 제거에 의해 유사하게 수집 할 수있다.
  2. 셀 스트레이너의 내부를 향하는 능선에 대한 샘플을 함유 한 페인트 브러시를 닦아주십시오. 그런 다음, 스트레이너의 벽과 PBTx 솔루션을 포함하는 물총 병 붓을 씻어. PBTx 솔루션을 캡처 여과기 아래에 배양 접시 덮개를 놓습니다.
  3. 모든 샘플은 여과기로 전송 된 후, 메쉬 오프 샘플 인상 여과기로 충분히 PBTx을 붓는다. 그리고, 스트레이너를 올려 액체 폐기물 컨테이너로 페트리 접시의 내용을 붓는다.
  4. 단계를 반복 2.3 세 번 효모를 제거하고 샘플과 함께 전송 된 수 있습니다 폐기물을 비행.
  5. 메쉬를 유충을 제기하기에 충분한 50 % 표백제 여과기에 (의 NaOCl) / 물 (DDH 2 O) 용액을 붓는다. 유충은 5 분 동안 용액에 앉아 할 수 있습니다. 그런 다음, 스트레이너를 들어 올려 t을 부어그는 액체 폐기물 용기에서 배양 접시의 내용을 표시합니다.
    참고 : - 융모막 막을 제거하기 위해 22 시간 표백제는 0 세 배아 샘플이 필요합니다. 이전 샘플 표백제 애플리케이션은 생략 할 수 있지만, 그것의 포함은 유해하지 않다. 누락이 필요한 경우, PBTx이 단계에서 표백제를 대체. 희석 표백제 용액 준비 24 시간 이내에 사용하시기 바랍니다.
  6. 메시 오프 샘플을 높이기 위해 스트레이너에 충분한 PBTx을 부어 PBTx와 여과기에 샘플을 씻으십시오. 샘플 3 분 동안 용액에 앉아 할 수 있습니다. 그리고, 스트레이너를 올려 액체 폐기물 컨테이너로 페트리 접시의 내용을 붓는다.
  7. 반복 단계 2.6 다섯 번.
  8. 셀 스트레이너 건조의 바닥 DAB 후 붓을 사용 PEMS 용액 1.75 ㎖에 함유하는 섬광 바이알로 샘플을 전송.
  9. 환기 흄 후드에서 작업, 37 %의 포름 알데히드 250 μL와 섬광 유리 병에 시약 등급 헵탄의 8 ML을 추가합니다.
    참고 : 포름 알데히드 및​​ 헵탄이 위험합니다. 3.3 - 안전을 위해 통풍이 잘되는 흄 후드 작동 및 단계 2.9에 적합한 장갑을 착용하는 것을 계속한다.
  10. 유리 병은 200 rpm으로 20 분 동안 비슷한 적당한 속도로 흔들 수 있습니다.
  11. 이전의 성상을 제거하지 않고 섬광 유리 병에 메탄올 10 mL를 넣고 유리 병은 1 분 동안 500 rpm으로 흔들어 할 수 있습니다.
    참고 : 메탄올은 위험합니다. 환기 흄 후드에서 작업하고 적절한 장갑을 착용 계속합니다.
  12. 후드에서 액체 폐기물 용기 위에 셀 스트레이너에 내용을 부어 바로 통에서 유리 병을 제거하고. 바이알에 여분의 메탄올을 첨가하고 모든 샘플이 제거되었는지 확인하기 위해 필요한 셀 스트레이너를 통해 실행.
    참고 : 셀 스트레이너 천천히 방전 될 수 있습니다. 이를 해결하기 위해,보다 빠르게 여과기를 통해 용액을 그리기 위해 셀 스트레이너의 바닥 실험실 조직을 터치. 메탄올, 포름 알데히드, 헵탄이 있어야한다제도적 지침에 따라 적절한 폐기 될 때까지 적절한 폐기 용기에 보관.
  13. 실험실 조직을 사용하여 셀 스트레이너의 마른 바닥, 메탄올 0.5 ㎖에 들어있는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 스트레이너에서 캡처 샘플을 전송하기 위해 붓을 사용합니다.
    참고 : 여러 섬광 유리 병을 사용하는 경우 단계를 완료 2.12 한 번에 2.13 한 병 셀 스트레이너에 건조에서 샘플을 방지 할 수 있습니다.
  14. 샘플이 microcentrifuge 관에 추가되면, 피펫과 메탄올을 제거합니다. 확인 샘플 튜브의 바닥에 침전되었다.
  15. 튜브의 메탄올 0.5 ㎖에 첨가하여 microcentrifuge 관에 샘플을 헹군다. 다음 정착 피펫 메탄올을 제거하는 샘플 기다립니다.
  16. 단계를 반복하여 15 세 번.
  17. 에서 관에 메탄올 0.5 ML을 추가 한 다음 저장 -20 나중에 사용하기 위해 C 냉동고 °.

3 재수 및 면역 염색을위한 시료의 준비

  1. 튜브 샘플을 떠나, 피펫 microcentrifuge 관에서 메탄올을 제거합니다. 적절한 폐기 때까지 적절한 폐기 용기에 보관 메탄올 폐기물.
    , 초음파 처리 효율을 향상시키기 위해 시료의 더 이상 3mm가 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브의 바닥에 침전 없음 사용 참고. 과잉 시료 위 재수 화 공정을 시작하기 전에 피펫 분리 튜브로 이송 될 수있다. 깨끗한 면도날과 피펫 팁을 절삭하는 피펫 팁의 막힘을 방지하기 위해 사용될 수있다.
  2. 3 분 동안 튜브와 바위에 50 % 메탄올 / 인산 버퍼 트윈 (PBTw) 솔루션의 1.0 ML을 추가합니다.
  3. 적절한 폐기물 용기에 메탄올 용액을 제거하고 두 번 PBTw의 1.0 μl를 씻어. 각 린스 후, 샘플 피펫 PBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다.
  4. 소 혈청 알부민 / 인산염 완충 트윈 (BBTw)의 1.0 ML을 추가 바이알과 바위에 섞는다. 로커에 3 분 후, SAMP를 허용르 정착과 피펫 BBTw를 제거합니다.
  5. 단계를 반복 마지막 세척 후 샘플을 잃지 않고 가능한 한 많은 BBTw을 제거 돌보는 3.4 두 번.
  6. 튜브에 BBTw의 0.5 mL를 넣고 얼음에 튜브를 배치합니다.

샘플의 4 초음파 처리

  1. 10 % 최대 진폭에 초음파기를 2 초 일정 초음파의 실행 시간을 지정합니다.
    참고 :이 설정은 재료 및 장비 표에 표시된 초음파기에 고유 한 다른 sonicators에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.
  2. 이전 시료의 초음파로, 프로브를 청소하는 탈 이온수 및 실행 초음파기 가득 50 ML 원뿔 튜브에 프로브 팁을 배치하여 초음파기 프로브를 청소합니다. 실행 한 후 실험실 조직과 드라이 초음파기 프로브.
  3. 이 시료 위에 약 3-4mm 배치되도록 샘플을 함유하는 마이크로 원심 튜브에 프로브를 담그고 초음파 처리를 시작한다.
  4. m을 제거icrocentrifuge 튜브 초음파로부터 열을 소산 샘플 microcentrifuge 관의 하단에 정착 할 수 있도록 적어도 30 초 동안 얼음에 배치하고.
  5. 반복 4.3 및 처리되는 샘플의 연령에 따라 필요에 따라 4.4 단계를 반복합니다.
    참고 : 최적의 초음파 샘플 볼륨의 경우, 초음파를 필요로하지 않는 미만 17 시간 배아, 그러나 그 시간 17 사이의 24 (/ 17 단계 초기 L1)이이 sonications이 필요합니다. 애벌레 사이 24-36 (초 / 중반-L1), 36-48 (중 /-L1 후반) 48-60 (초 / 중반 L2), 60-72 (중 / 후반 L2), 72-84 ( )-L3 초, 84-96 (초 / 중반 L3), 96-108 (중 / 후반 L3) 시간이 필요 5, 9, 11, 13, 각각 15, 18, 22 sonications. 초음파 시간에 더 정교에 대한 설명을 참조하십시오.
  6. BBTw 두 번 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 BBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다.
  7. 유리 병 바위에 BBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에 3 분 후, 샘플 정착 피펫 BBTw를 제거 할 수 있습니다.
  8. 단계를 반복 4.7 두 번.

(5) 면역 염색

  1. microcentrifuge 관에 BBTw에 희석 5 % 정상 혈청을 추가하여 샘플을 차단합니다. 1 시간 동안 락을 한 후 블록을 제거합니다.
    참고 : 보조 항체가 생성되는 종에서 정상 혈청을 사용합니다.
  2. 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액에 농도를 적절한 작업하는 차 항체를 희석.
  3. 4 ° C에서 또는 (약 22 ° C 실온에서 적어도 3 시간 동안 차 항체 솔루션 O 락 샘플 / N.
    주 : 항체 배양 시간 및 온도는 다를 수 있습니다. O / RT에서 N 4 ° C에서 배양 또는 3 시간은 일반적으로 충분합니다. 그러나,이 일의 잠복기는 특히 오래된 샘플 또는 낮은 친화력 차 항체를 사용하는과, 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다. 긴 인큐베이션은 일반적으로 4 ° C에서 수행됩니다. 이차 항체 (5.10 참조)을 사용하면 유사한 고려가 이루어져야합니다.
  4. 샘플에 정착 할 수 있도록 허용미세 원심 분리 튜브의 바닥. 피펫 차 항체를 그립니다. 원하는 경우 재사용에 대한 항체를 저장합니다.
  5. 두 번 BBTw의 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 BBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다.
  6. 유리 병 바위에 BBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에 3 분 후, 샘플 정착 피펫 BBTw를 제거 할 수 있습니다.
  7. 반복 단계 5.6 다섯 번.
  8. microcentrifuge 관에 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액을 첨가함으로써 차단 샘플. 1 시간 30 분 동안 흔들 후 블록을 제거합니다.
    이러한 추가적인 차단 단계가 필요하지 않고, 특정 항체 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다.
  9. 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액에 농도를 작동하는 적절한 보조 항체를 희석.
  10. 빛 노출로 인해 변색 줄이기 위해 알루미늄 호일에 microcentrifuge 관을 감 쌉니다. 4 ° C에서 12 시간 48 2 차 항체 용액 또는 RT (약 22 ° C에서 적어도 3 시간 동안 바위 샘플.
  11. 샘플 미세 원심 분리 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 피펫 차 항체를 그립니다.
  12. 두 번 PBTw의 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 PBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다.
  13. 유리 병 바위에 PBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에서 5 분 후, 샘플 정착 피펫 PBTw를 제거 할 수 있습니다.
  14. 단계를 반복 5.13 세 번.
  15. 옵션 : 1,000 PBTw에 : DAPI 1 희석 추가합니다. 록 샘플은 3 분 동안 알루미늄 호일에 싸서; 다음 피펫 DAPI 솔루션을 제거합니다. 샘플 피펫 PBTw를 제거하기 전에 정착 할 수 있도록 PBTw의 1.0 mL를 다섯 번 씻어.
  16. -20 ° C에서 microcentrifuge 관 및 저장소에 1,4 - 디아 자비 시클로 [2.2.2] 옥탄 (DABCO) 용액 100 ㎕ - 80를 추가합니다.
    주의 : 다른 글리세롤 계 안티 - 페이드 에이전트가 대신 할 수있다.

(6) 분석

  1. DABCO / P-페닐의 10 μL - 슬라이드에 샘플을 설치하기 전에 여분의 5를 추가ylenediamine (PPD) microcentrifuge 관에 antifade 솔루션입니다.
    참고 : 샘플 절개없이 슬라이드에 추가 할 수 있습니다. 슬라이드에 추가 샘플 볼륨을 커버 슬립의 크기에 따라 달라집니다. 슬라이드 상에 샘플을 피펫 때 피펫 팁은 시료 전단 않도록 면도날을 이용하여 차단 될 수있다. 그것은 쉬운 분석을위한 행 샘플을 정렬하는 것이 유용하다. 추가 antifade 제로 PPD의 첨가는 필요하지 않을 수 있지만, 샘플 장기 photobleaching에 저장되어있는 경우를 방지 할 수있다.
  2. 부드럽게 샘플을 통해 유리 커버 슬립을 배치합니다. 그런 장소에 보안 커버 슬립은 매니큐어를 사용.
  3. 보기는 형광 현미경을 이용하여 시료를 탑재.

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결과

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마지막 단계의 배아와 현장에서 애벌레 조직의 분석 초음파 기반의 면역 염색의 효능을 입증하기 위해, 야생 형 배아 및 유충은 고환, 난소의 면역 및 신경 조직을 위해 처리 하였다. 샘플은 공 초점 현미경을 통해 몇 군데 있었다 대표적인 결과는 (그림 1과 그림 2)를 나타낸다. 결과는 설명 프로토콜은 초파리 개발의 늦은 배아 초기 통해 / 중간 L3 단계에서 형태 적 특징뿐만 아니라 현장에서 개별 세포를 시각화하는 효과가 있음을 알 수있다.

고환 발현 사이의 결과 :
정소 발달 고환의 성숙이 유충 발달에 걸쳐 동적이기 때문에 프로토콜 효능을 예시하기위한 특히 좋은 시스템이다. 성인 초파리 고환, 13 참조 (생식 줄기 세포 (GSC) 틈새가 위치해 한 블라인드 끝으로 코일 튜브를 형성리뷰 14). 이 틈새에서, GSC를 허브...

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토론

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이 프로토콜은 성공적 따라서 박리를위한 필요성을 제거 반응계에서 초파리 배아와 유충 표적 조직 발현 사이하는 방법을 제공한다. 초기 배아에게 1,2,3 염색을 위해 사전 프로토콜에 따라, 융모막 멤브레인은 50 % 표백제 (NaOCl을)를 사용하여 제거한다. 샘플은 포름 알데히드와 메탄올에 고정되어 있습니다. 애벌레 표피가 떠있는 오래된 샘플을 발생하기 때문에, 전체 샘플은 애벌레 보존을 보장하기 위해 셀 스트레이너를 통해 전달됩니다. 샘플은 화학적 등급 메탄올, 원하는 경우, 기억된다. 재수 화 한 후, 적절히 구현 초음파 처리는 유생 표피의 무결성을 방해. 이것은 면역 염색에 필요한 항체의 충분한 침투 수 있도록 표피 형성 한 후 중요합니다. 5 % 정상 혈청 샘플을, 항체를 적용 흔들 전에 / BBTw 솔루션은 과도한 특이 항체 바인딩을 방지 할 수 있습니다. 일차 항체는 특정 단백질을 검출 EXPRES 첨가표적 조직에 나오지. 언 바운드 차 항체를 제거하기 위해 세척 한 후, 형광 물...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 친절 바사 및 트래픽 잼 항체를 공급 루스 리먼과 Dorthea Godt에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 NICHD의 후원하에 개발하고 아이오와의 대학에 의해 관리 제공된 주식과 발달 연구 하이 브리 도마 은행을 유지하기위한 인디애나 대학 블루밍턴 주식 센터에 감사드립니다. 우리는 그들의 조언과 지원을 Wawersik 실험실의 모든 구성원 감사합니다. 이 작품은 먼로 학자 프로그램 그랜트와 NSF (AF 및 LB에) (MW로) IOS0823151을 부여에 의해 투자되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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표 1: 시약 및 완충액
인산염 완충제 Triton X-100 (PBTx)5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. RT에 보관하십시오.
인산염 완충 식염수 10X (PBS 10X)dH2O에서 1L: 80g NaCl, 2g KCl, 14.4g Na2HPO4, 2.4g KH2PO4. 구성 요소를 추가하고 적절한 볼륨으로 채웁니다. 4 °C에 보관하십시오.
트리톤 10%50ml: 트리톤 5ml, PBS 10X 5ml, ddH2O 45ml를 섞습니다. RT에 보관하십시오.
PEMS0.1m 파이프(pH 6.9), 2.0mM MgSO4, 1.0mM EGTA. RT에 보관하십시오.
파이프: 0.25M 용액 (pH 6.9) 400ml : 30.24g 파이프 dH 2 < / sub>0 NaOH. 파이프를 300ml dH2O에 녹인 다음 NaOH로 pH 6.9로 조정합니다. dH2O 및 오토클레이브로 총 부피를 400ml로 가져옵니다. RT에 보관하십시오.
포름 알데히드: 메탄올 중량 기준 37 % 포름 알데히드. RT에 보관하십시오. 포름알데히드, 헵탄 및 메탄올 폐기물 혼합물을 기관 지침에 따라 처리하기 전에 흄 후드에 단단히 밀봉된 용기에 보관하십시오.
헵탄CAS 142-82-5n- 헵탄. RT에 보관하십시오. 포름알데히드, 헵탄 및 메탄올 폐기물 혼합물을 기관 지침에 따라 처리하기 전에 흄 후드에 단단히 밀봉된 용기에 보관하십시오.
메탄올CAS 67-56-1RT에 보관하십시오. 포름알데히드, 헵탄 및 메탄올 폐기물 혼합물을 기관 지침에 따라 처리하기 전에 흄 후드의 단단히 밀봉된 용기에 보관하십시오.
인산염 완충액 트윈 (PBTw)1 L 만들기 : 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml 트윈 10%. 필터는 모든 구성 요소를 추가한 후 살균합니다. 4 °C에 보관하십시오.
트윈 10%50ml: 트윈 5ml, PBS 10X 5ml, ddH2O 40ml Rock 혼합. RT에 보관하십시오.
소 혈청 알부민/인산염 완충액 트윈(BBTw)1 L 만들기: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml 트윈 10%, 1 g 소 혈청 알부민(BSA). BSA를 첨가한 다음 0.2 &mu를 사용하여 살균합니다. M 진공 필터 장치. 4 °C에 보관하십시오.
일반 염소 혈청 (NGS)ackson ImmunoResearch Laboratories005-000-12110 ml 만들기 : 일반 염소 혈청 10 ml ddH2O. NGS 바이알에 ddH2O를 첨가하고 0.2 &mu를 사용하여 살균합니다. M Syrninge Filter. 부분 표본은 -20 °C에서 저장합니다.
1,4-diazabicyclo [2.2.2] 옥탄 (DABCO)CAS : 281-57-9100 ml를 만들려면 : 25 ml ddH 2 < / sub>O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), DABCO 고체 2.5 g, 3.5 ml 6N HCl, 250 μ l 10N NaOH, 70 ml의 글리세롤. 교반 막대가 있는 250ml 비커에 ddH2O, Tris HCl 및 DABCO를 추가합니다. 저어 6N HCl, 10N NaOH 및 글리세롤을 첨가합니다. 그런 다음 용액이 pH 7.5에 도달 할 때까지 10N NaOH를 적가합니다. 부분 표본. 부분 표본은 -20 °C에서 저장합니다.
DABCO + p- 페닐 렌 디아민 (PPD) 용액1.765 ml NaHCO 3 < / sub>, 0.353 Na2 < / sub>CO3< / sub>, 0.02 g PPD (CAS : 106-50-3). NaHCO3 및 NaCO3 용액에 PPD를 용해합니다. 60 추가 μ l의 PPD 용액 500 μ DABCO의 l. 부분 표본은 -20 °C에서 저장합니다.
사과 주스 플레이트~ 200 접시를 만들려면 : 45g 한천 (CAS # 9002-18-0), 45g 과립 설탕 (매장 구입), 500ml 사과 주스 (매장 구매), 15ml Tegosept 10 %, 1.5 ml ddH 2< / sub>O. 4L 플라스크에 한천을 ddH 2 < / sub >O에 추가 한 다음 30 분 동안 고압멸균합니다. 가열 된 교반 플레이트에 사과 주스와 설탕을 섞습니다. 점차적으로 사과 주스 혼합물을 오토클레이브 한천에 첨가하십시오. 가열된 교반 플레이트에 혼합한 다음 10ml 부피를 35mm 페트리 접시에 분취하고 RT에 두어 굳힙니다. 4 °C에 보관하십시오.
Tegosept 10 %100ml를 만들려면 : 10g Tegosept, 100ml 에탄올. 부분 표본은 -20 °C에서 저장합니다.
효모 페이스트~ 건조 활성 효모 50g. 페이스트 같은 농도가 될 때까지 저으면서 효모가 들어있는 비커에 ddH2O를 점차적으로 첨가합니다. 4 °C에 보관하십시오.
표 2: 염색 재료
DAPIInvitrogenD35711:1000, 5mg/ml의 재고.
토끼 안티 바사1:250, 루스 레만의 선물.
마우스 anti-Fasciclin IIIDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)7G101:10
Mouse anti-1B1Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)1B11:4
Guniea pig anti-Traffic Jam1:2500, Dorthea Godt의 선물(Li et al, 2003).
마우스 안티 프로스페로발달 연구 하이브리도마 은행(DSHB)프로스페로 MR1A1:10
쥐 안티 엘라브발달 연구 하이브리도마 은행(DSHB)7EBA101:30
마우스 안티 레포발달 연구 하이브리도마 은행(DSHB)8D121:10
염소 안티 토끼 Alexa546InvitrogenA110101:500
염소 안티 마우스 Alexa488InvitrogenA110291:500
염소 안티 구니에 돼지 Alexa633InvitrogenA211051:500
염소 안티 랫 Alexa488InvitrogenA110061:500
표 3: 재료 및 장비
플라이 케이지수제; Genesee Scientific Corporation해당 사항 없음; 병 : 32-130; 사전 제작 된 케이지 : 59-101400rpm에서 복합 마이터 톱으로 투명 캐스트 아크릴 튜브 (직경 1 3/4 인치)를 4 인치 높이의 세그먼트로 절단하여 제작되었습니다. 초미세 스테인리스 스틸 스크리닝(아크릴 콤푼드 접착제로 욕조의 한쪽 끝에 부착되었습니다. 빈 파리 사료 병을 사용하는 대체 방법은 Drosophila 프로토콜 ISBN 0-87969-584-4에서 찾을 수 있습니다. 케이지는 Genesee Scientific Corporation에서 구입할 수도 있습니다.
초음파 발생기 : Branson 250 디지털 소닉 파이어Branson모델 : Branson Digital Sonifier 250
Sonicator 프로브Branson모델 # : 102C (CE)EDP : 101-135-066; S / N : OBU06064658
주사기 필터Nalgene190-25-200.2 μ m 셀룰로오스, 아세테이트 멤브레인 필터
이미징 시스템: 다색 광원, 디지털 CCD 카메라 및 이미징 소프트웨어가 있는 스피닝 디스크 컨포칼 현미경현미경: Olympus, 광원: Lumen Dynamics, 카메라: Q-Imaging, 이미징 소프트웨어: Intelligent Imaging Inc.현미경: BX51 DSU 회전 디스크 장착, 광원: X-Cite 120Q, 카메라: RETIGA-SRV, 이미징 소프트웨어: Slidebook 5.0
진공 필터 유닛Nalgene450-00200.2 μ M 셀룰로오스 질산염 멤브레인 필터

참고문헌

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