Method Article

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법 애기 장대

DOI:

10.3791/51530

⸱

June 19th, 2014

 ,  , 
1Institute of Plant Biology and Zürich-Basel Plant Science Center, University of Zürich, 2Institut de Recherche pour le Développement (UMR 232), Centre National de la Recherche Scientifique (ERL 5300), Université de Montpellier II

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 면역 염색, 형광 제자리 교잡, 전체 마운트 애기 장대 난자의 양적, 고해상도 이미징 다음 DNA 염색 여기를 효율적이고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 성공적 염색질 변형 및 핵 구조를 분석하는데 사용 하였다.

Abstract

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꽃 피는 식물에서 체세포 - 투 - 생식 세포의 운명 전환은 성인 식물의 꽃 장기에 포자 어머니 세포의 사양 (SMCS)로 표시됩니다. 여성 SMC (megaspore 어머니 세포, MMC)는 난자 primordium의 차별화 및 감수 분열을 겪는다. 선택된 반수체 megaspore는 함께 액세서리 세포, 생식 세포에 상승을 줄 것이다 다세포 여성 배우체, 난자와 중앙 셀을 형성하기 위해 유사 분열을 겪는다. 난자 내부의 MMC, meiocyte과 여성 배우체의 제한된 접근성은 세포학에 대한 기술적 도전과 세포 유전은 단일 세포 수준에서 분석한다. 특히, 세포 핵 항원의 직접 또는 간접 면역이 식물 세포 및 단일 세포 이미징 내부의 시약의 가난한 침투에 의해 손상은 전체 마운트 조직에 광학 선명도의 부족에 의해 demised된다.

따라서, 우리는 nucl을 분석 할 수있는 효율적인 방법을 개발전체 마운트 포함 된 애기 장대의 난자에 하나의 셀의 높은 해상도에서 귀 조직과 염색질 수정. 이것은 현미경 슬라이드에 아크릴 아마이드 겔의 박층의 박리 및 고정 난자의 매립에 기초한다. 내장 된 난자는 면역 염색 시약으로 조직의 명확성과 침투성을 향상을 목표로 화학 및 효소 처리를 실시하고 있습니다. 그 치료는 세포 및 염색질 조직, DNA와 단백질 항원을 유지합니다. 샘플은 염색질 면역 염색, 원위치 혼성화 (FISH) 형광 및 이질 분석을위한 DNA 염색 등 다른 하류 세포 학적 분석을 위해 사용될 수있다. 3D 재구성 다음에 높은 해상도를 가진 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) 영상은, 단일 셀 해상도에서 정량 측정 할 수 있습니다.

Introduction

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꽃 식물의 생식 계통의 설립은 SMCS의 차별화, 여성 MMC 및 남성 microspore 어머니 세포로 시작합니다. MMC는 난자 primordium의 원심 끝에서 하위 표피 nucellar 세포에서 개발하고 microspore 어머니 세포 깊은 꽃 기관 (1)의 내부에 위치하는 꽃밥 locule에 sporogenous 조직에서 개발하고 있습니다. SMCS는 유사 분열시 배우체로 야기 반수체 포자를 생산하는 세포의 감수 분열을 받다. 여성 배우체, 또는 배아 골목, 하나의 난자, 하나의 중앙 세포, 두 synergids 세 antipodals으로 구성되어 있습니다. 남성 배우체, 또는 꽃가루는, 하나의 식물 세포와 두 개의 정자 세포로 구성되어 있습니다. 남성 배우체가 상대적으로 접근 객체의 학습 남아있는 동안, 여성 배우체는 자체가 꽃 심피 묶인 난자 내부에 포함하고, 따라서 분자 및 세포 학적 분석에 대한 특정 문제를 제기한다. 그러나 최근에는 레이저를 이용한미세 절제는 transcriptomic는 MMC와 여성 gametophytic 세포 2-4의 분석을 허용하는 훌륭한 솔루션을 제공했다. 후보 유전자 발현뿐만 아니라 세포 학적 분석은 특정 직접 세포의 염색 또는 간접적으로 면역 염색을 사용하여 내인성 세포 구성 요소의 역학을 조사, 현....

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Protocol

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절차는 그림 1에서 워크 플로에 ​​설명하고, 해부 및 조직의 매립에 대한 설정은 그림 2에 나타내었다.

1. 조직 고정

  1. 얼음에 갓 만든 BVO 정착액 버퍼를 포함하는 미세 원심 분리 튜브에 20 ~ 30 심피를 수집합니다.
  2. 부드러운 실온에서 진탕 조직 30 분 수정.
  3. 400 X g에서 벤치 탑 마이크로 원심 1 분에 정착의 심피가 들어있는 튜브를 스핀.
  4. 주의 깊게 정착 버퍼를 제거하고 PBT 1 ㎖​​를 추가, 얼음에 튜브를 배치합니다.

2. 해부 및 포함

  1. 갓 만든, 5 %의 아크릴 아미드의 혼합 각각 200 ㎕ 씩 다섯 에펜 도르프 튜브를 준비합니다.
  2. 다섯 Superfrost 슬라이드를 70 % 에탄올로 미리 청소하고 연필로 표시를 준비합니다.
  3. 한 20 % APS의 나누어지는 얼음에 20 % 낮잠 각을 해동.
  4. 컷 엔드 팁, 장소 4-5 심피을깨끗한 슬라이드에 그들, 액체의 초과를 제거합니다.
  5. 미세 바늘 길이 상처를 확인하고 그림과 그림 2....

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Results

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우리는 전체 마운트의 세포 학적 염색에 적합한 애기 난자의 대규모 준비 및 처리를위한 강력한 프로토콜을 제공합니다. 매립 덕분에, 난자는 3 차원 구조 (그림 3)를 유지한다. 또한, 광학 설명을 포함하여 조직 처리는 높은 해상도로 영상 세포 내 구조를 가능하게한다. 4 이질 염색질이 (더 디컨 볼 루션이 그림에 사용되지 않았다)도 눈에 초점을 정의, 밝은 표시 전체 마운트 난자 원기의 DNA 염색을 보여줍니다. 이러한 이미지는 MMC와 nucellus (그림 4) 21의 이질 염색질의 내용을 분석 하였다.

또한, 우리는 성공적으로 정량적 megaspore 어머니 세포 기능 megaspore 개발, 여성 배우체와 초기 배아 21, 22 ~ 24의 면역 염색에 의해 염색질의 역학을 분석하는이 프로토콜을 .......

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Discussion

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꽃 피는 식물에서 여성의 생식 계통 따라서 기술적으로 도전적인 전체 마운트의 세포 학적 염색법을 렌더링, nucellus와 난자 teguments를 포함한 여러 세포 층에 의해 둘러싸여 있습니다. 여기에서 우리는 전체 마운트의 현장 하이브리드의 면역 염색, DNA 염색 및 형광으로 세포 학적 염색에 적합한 난자의 많은 수의 준비 및 처리를 가능하게하는 효율적인 프로토콜을 제시한다. 우리는 성공적 아라비돕시스 21,22있는 여성 생식 생식선의 분석을 위해 사용 하였다. 여러 슬라이드를 다른 염색에 대한 병렬로 처리 할 수​​있는이 방법은 매우 효율적입니다. 또한 강력하고 균일 한 신호 분배를 제공하고 재현성있는 정량 분석​​ 할 수 있습니다. 이러한 크로 마틴 구조의 변성을 포함 Feulgen 염색 등의 고전적인 방법과는 대조적으로, 우리의 프로토콜은 염색질 조직과 핵 항원을 유지합니다. 추가의ition, 티슈 해명은 단일 세포 수준에서 높은 해상도로 신호를 촬상 가능하게한다........

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Disclosures

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기술적, 재정적 지원을 해주신 Ueli Grossniklaus(취리히 대학교)에게 감사드립니다. 일반적인 실험실 지원을 제공해 주신 Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos 및 Peter Kopf에게 감사드립니다. 이 연구는 취리히 대학교(University of Zürich)의 자금 지원을 받았으며, 스위스 국립재단(Swiss National Foundation)의 CB(31003A_130722) 및 Ueli Grossniklaus(31003A_141245 및 31003AB-126006)의 보조금, Agence Nationale de la Recherche to DG(프로그램 ANR-BLANC-2012)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
용액
BVO 고정 완충액(기준32)2 mM EGTA, pH 7.5, 1%(v/v) 포름알데히드, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT-F1x PBT, 2.5%(v/v) 포름알데히드
30% 아크릴아미드:비스아크릴아미드3 g 아크릴아미드, 0.33 g 비스아크릴아미드, 1x PBS (10 ml를 준비하고 4 °에서 보관하십시오. C)
에 200 ml 5% 아크릴아미드 혼합34 ml 30% 아크릴아미드:비스아크릴아미드, 166 ml 1x PBS (30% 재고에서 신선하게 만들기)
20% 암모늄퍼설프트0.2 g 암모늄퍼설프테, 1 ml 멸균수 (1 ml로 분취액을 준비하고 -20°C에서 보관하십시오. C)
20 % 아황산0.2g, 1ml 멸균 물 (1ml로 부분 표본을 준비하고 -20 °C에서 보관하십시오. C)
세포벽 효소 믹스0.5 % (w / v) 셀룰라아제, 1 % (w / v) 드리 셀라제, 0.5 % (w / v) pectolyase
시약 및 재료
포름 알데히드시그마 - 알드리치F1635
DMSO시그마D5879
트리스아마레스코0497
에탄올SchaurlauET00102500
메탄올SchaurlauME03062500
XyleneROTH4436.1
셀룰라아제시그마1794
Driselase시그마D8037
pectolyase시그마P5936
Tween-20Merck8.22184.0500
EGTA시그마E-4378
아크릴아미드시그마A-3553
비사아크릴아미드시그마M2022독성
과황산시그마A9164
아황산나트륨플루카71988
안티 트리메틸 히스톤 H3 (Lys4)업스테이트07-473
안티 모노메틸 히스톤 H3 (Lys27)업스테이트07-448
Alexa Fluor 488 ~ 염소 ~ 안티 ~ 토끼 (H + L)분자 프로브A11008
ProlongGoldInvitrogenP36934
Propidium iodide시그마P4170독성
DAPI시그마D9542독성
RNAse ARoche10109169001
Coplin jarHuber & CO10.055
겸자DUMONT BIOLOGY
셰이커Heidolph543-12310-00-0
촉촉한 챔버내부에 축축한 종이 타월이 있는 플라스틱 상자, 플라스틱 지지대를 상자에 넣어 슬라이드를 지지하고 슬라이드를 물로부터 보호합니다.
Superfrost Plus 슬라이드Thermo FisherJ1800AMNZMenzel-Glä ser
FISH 태그 DNA 키트InvitrogenF32947
GFP 부스터Chromotek
, PBS나트륨 암모늄

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
  2. Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development.....

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