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방법 논문

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

12.1K 조회수

DOI:

10.3791/51559

2014년 4월 6일

이 논문에서

요약

급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

초록

급성 뇌 손상은 종종 다른 사고 머리 손상의 결과 및 인구의 상당 부분 영향을 미치지 만, 그것에 대한 효과적인 치료법은 아직 없다. 현재 사용되는 동물 모델의 제한은 병리 메커니즘에 대한 이해를 방해. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 생리적, 병리 적 조건에서 그대로 동​​물의 뇌 내에서 세포와 조직을 연구 할 수 있습니다. 여기서는 외상 조건 하에서 뇌 세포 행동의 이광자 촬상 의해 공부 급성 뇌 손상의 두 모델을 설명한다. 선택된 뇌 영역은 뇌 실질 조직의 제어 폭과 깊이의 외상을 생산하는 날카로운 바늘로 부상하고 있습니다. 우리의 방법은 동시 약 응용과 결합 될 수있는 주사기 바늘로 찌름 정위를 이용한다. 우리는이 방법은 포유류의 뇌에 급성 외상의 병태 생리 학적 결과의 세포 메커니즘을 연구하는 고급 도구로 사용될 수 있음을 제시한다

서론

급성 뇌 손상은 자동차 충돌에서 부상의 높은 발병률과 중요한 공중 보건 문제가 떨어지거나 공격, 이후 만성 장애의 높은 보급. 뇌 손상의 치료에 대한 치료 적 접근 따라서, 병원 전 수술 및 중환자 치료의 효과를 제한하는, 완전히 증상이 남아 있습니다. 이것은 뇌 손상의 사회 경제적 영향은 특히 심각합니다. 여러 가지 이유로, 임상 시험의 대부분은 새로운 치료 방법을 사용하여 뇌 손상 후 회복에 개선을 보여 못했습니다.

동물 모델은 약물 효능은 뇌 손상 환자에서 예상 할 수있는 무대를 향해 새로운 치료 전략을 개발하기 위해 매우 중요합니다. 현재, 두부 외상의 몇 가지 잘 설립 된 동물 모델은 제어 대뇌 피질의 영향 1, 유체 타악기 부상 2, 동적 대뇌 피질의 변형 3, 체중 저하 등의 존재4, 그리고 사진 부상 5. 실험 모델의 숫자는 두부 외상 관련 병리의 특정 형태 학적, 분자 및 행동 양상을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나, 하나의 동물 모델은 새로운 치료 전략을 검증하는 데 완전히 성공하지 않습니다. 뇌 손상, 신뢰성 및 재현성 제어 된 동물 모델의 개발은 복잡한 프로세스 병리학을 평가하기 위해 필요하다.

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프로토콜

여기에 제시된 모든 절차는 동물 보호 (동물 실험 2,006분의 62에 핀란드 법)에 대한 현지 지침에 따라 수행 하였다. 동물 라이센스 (ESAVI/2857/04.10.03/2012)는 지방 자치 단체 (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA)로부터 얻은 것입니다. 1~3개월 세의 성인 마우스, 무게 24~38g은 인증 된 대학의 동물 시설에서 개별 케이지에 보관 음식과 물을 임의로 제공 하였다.

1. 두개골 창을 통해 뇌 손상 이미징

  1. 동물을 마취하고 연산 필드를 준비
    1. 필터 - 멸균 인산 완충 식염수 (PBS), pH를 7.4에 용해 케타민 (Ketalar, 80 ㎎ / kg)과 자일 라진 (Rompun, 10 ㎎ / kg)의 혼합물을 복강 내 주사하여 마우스를 마취. 마취의 깊이를 확인하기 위해 마우스의 반사 신경 정기적으로 (꼬리와 발가락 핀치 프로브를) 확인하십시오. 적절한 때 적절한 마취를 유지하기 위해 용량을 증가하지만 overd을 피하기OSE.
    2. 마취에서 회복 후 수술, 영상 세션 첫 번째 시간 동안 가열 패드를 사용하여 37.0 ° C에서 동물을 유지합니다.
    3. 마르지 마우스의 눈을 보호하기 위해 눈에 윤활제를 적용합니다.
    4. ....

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결과

형질 전환 생쥐의 외상 후 뇌 영상 1) 만성 두개골 창 2) 머리 숱이, 우리는 두 가지 작업 절차를 최적화했다. 실험 준비의 개략도는 그림 1에 제시되어있다. 0.3 mm 외경 (30 G)의 스틸 바늘에 의한 외상 찌르기는 드릴 아니라 (그림 1A)에 적용됩니다. 머리 숱이 약 300 μm의 (그림 1C)의 제한을 적용하는 경향이있는 반면, 성공적인 두개골 창 준비 Thy1-YFP -의 3 차원 재구성에서와 같이, pial 표면 (그림 1B) 아래 650 μm의 최대 깊이에서 촬영을 할 수 있습니다 H 마우스 대뇌 피질의 피라미드 뉴런.

뇌 피질의 조절 볼륨있는 수상 돌기 모세 혈관 망의 파괴의 제거에서 사라지게 외상 결과. 제 이일 동안 병변 면적이 증가하고 외상 유도 수지상에 blebbing 및 수지상 후퇴 B의 형성perilesion 지역에서 UL.......

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토론

뇌 손상은 갑작스러운, 예측할 수없는 이벤트입니다. 여기에서, 우리는 신경 변성, 수상 돌기의 제거, 뇌 부종, 아교 흉터, 초점 지주막 하 출혈과 함께 대뇌 피질의 출혈과 증가 투자율과 같은 뇌 손상 후에 인간의 환자에서 관찰 된 병리학 적 변화의 스펙트럼을 재현 동물 모델을 설명 혈액 - 뇌 장벽. 기본 및 보조 기전뿐만 아니라, 외상 후 회복을 연구하기 위해이 부상 모델은 미세 신경 세포와 신경 교세포 구조의 생체 내 시각화의 길이와 결합했다. 유전자 변형 마우스 라인은 (Thy1-YFP-H) 7, 성상 세포 (GFAP-EGFP) 8 신경 세포에 형광 단백질을 표현하거나, 미세 아교 세포 (CX3CR1-EGFP) 9이 사용되었다. 또한, 우리는 Sulfarhodamine 101 (10)와 두 번째 고조파 발생 (SHG) 이미징 및 성상 세포의 로딩을 사용했습니다.

여기에 설명 .......

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

우리는 GFAP-EGFP와 CX3CR1-EGFP 마우스 균주를 제공하는 프랭크 박사 키르히 호프에 깊이 감사드립니다. 작품은 핀란드의 국제 이동성 센터, Tekes, 핀란드의 신경 과학 대학원 (FGSN), 핀란드의 아카데미에서 교부금에 의해 지원되었다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2A-sa 벙어리 핀셋, 115 mmXYtronicXY-2A-SA
30 G ½ 바늘BDREF 304000
동물 트리머, 면도 기계AesculapIsis GT420
쌍안 현미경ZeissStemi 2000
스테인레스 스틸 가열 패드가있는 생물학적 온도 컨트롤러SupertechTMP-5b
무딘 미세 수술 블레이드BDREF 374769
필라멘트가 있는 붕규산 튜브Sutter InstrumentsBF120-69-10유리 피펫 생산용
CarprofenePfizerRimadyl vet
클로르헥시딘 디글루코네이SigmaC9394
치과 시멘트DrguDent, DentsplyREF 640 200 271
덱사메타손FaunaPharma라피덱슨 수의사
일회용 드릴MeisingerHP 310 104 001 001 008
Dulbeco' s PBS 10xSigmaD1408
Dumont #5 겸자, 110mmFST91150-20
Ealing 마이크로 전극 풀러Ealing50-2013유리 피펫 생산용 수직 풀러
눈 연고NovartisViscotears
Foredom 드릴 제어ForedomFM3545
Foredom 마이크로 모터 핸드피스ForedomMH-145
마우스 용 가스 마취 플랫폼Stoelting50264입체 운동 기구
조립 지혈 콜라겐 스폰지Avitene, Ultrafoam BARDRef 1050050
ImarisBitplane
KetamineIntervetKetaminol vet
Mai Tai DeepSee 레이저Spectra-Physics
금속 홀더Neurotar
Microdressing 겸자, 105mmAesculapBD302R
MicrofilWPIMF34G-5마이크로 주사기 충전 모세관
미네랄 오일SigmaM8410
다광자 레이저 스캐닝 현미경OlympusFV1000MPE
NanoFil 주사기 10 &뮤; l WPINANOFIL해밀턴 주사기
부직포 면봉 5 x 5Molnlycke 건강 관리Mesoft수술용 탬폰
폴리아크릴 접착제HenkelLoctite 401
라운드 유리 커버슬립 전자 현미경 과학
1.5 두께 
작은 동물 입체 기구David Kopf Instruments900
Stoelting 마우스 및 신생아 쥐 어댑터Stoelting51625입체 기구에 조립
학생 홍채 가위, 스트레이트 11.5cmFST91460-11
Sulforhodamine 101분자 프로브S-359
UMP3 마이크로 주사기 펌프 및 마이크로 4 마이크로 주사기 펌프 컨트롤러WPIUMP3-1마이크로 인젝터 및 컨트롤러
XylazineBayer Health CareRompun vet
트 .

참고문헌

  1. Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
  2. Lindgren, S., Rinder, L. Experimental studies in head injury. Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).
  3. Shreiber, D. I., et al.

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