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방법 논문

동적 칼슘의 자동 분석

16.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51560

⸱

2014년 6월 16일

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Department of Physiology, University of South Alabama

이 논문에서

요약

여기에서는 2차원 타임랩스 이미지 시퀀스 내에서 양의 신호 영역에 할당된 최적의 타원 정렬을 기반으로 하는 새로운 관심 영역 분석 프로토콜이 시연됩니다. 이 알고리즘을 통해 연구자는 최소한의 사용자 입력 및 바이어스로 생리학적 Ca2+ 신호를 종합적으로 분석할 수 있습니다.

초록

세포 내 칼슘 2 + 신호는 일반적으로 형광 칼슘 2 + 지표 염료 및 현미경 기술을 연구한다. 그러나, 칼슘 2 + 영상 데이터의 정량 분석 시간과 바이어스에 따라 달라질 수 있습니다. 또한 (ROI)의 검출 영역에 기초하여 자동화 된 신호 분석 알고리즘은 일차원 라인 스캔 측정에 대해 구현되어 있지만 이차원 이미지 시퀀스에서 최적화 된 신분증과의 ROI 분석을 통합 전류 알고리즘은 없다. 여기서 이미지 시퀀스에서 수집 및 급속의 ROI 분석을위한 알고리즘을 설명한다. 이 타원이 최적의 투자 수익 (ROI)의 위치를 결정하기 위해 노이즈 필터링 된 신호에 맞게 활용하고, 진폭, 시간 및 공간 확산의 칼슘 2 + 신호 파라미터를 계산한다. 이 알고리즘은 ImageJ에 (NIH) 소프트웨어를 자유롭게 사용할 수 플러그인으로 구현되었습니다. 함께 오픈 소스 통계 처리 소프트웨어 R 용으로 작성된 분석 스크립트와,이러한 접근법은 실험 출력 퀵 통계 분석을 수행하기위한 고용량 파이프 라인을 제공한다. 저자는이 분석 프로토콜의 사용은 생리적 칼슘 2 + 신호의보다 완전하고 공정한 특성으로 이어질 것입니다 것이 좋습니다.

서론

칼슘 2 +는 분자 및 세포 내 칼슘 2 + 수준을 높게 조절되는 신호 유비쿼터스 두 번째 메신저입니다. 세포 내 칼슘 2 + 신호가 복잡하고 고립 과도, 진동, 파도 1 전파 포함 - 4. 칼슘 2 +의 공간과 시간 제어 생체 신호 특이성을 기초로 생각, 따라서 칼슘 2 + 신호 패턴의 분석은 여러 필드 5의 조사에 상당한 관심입니다.

예컨대 플루오 (Fluo) -4의 Fura-2와 같은 칼슘 2 + 인디케이터 염료는 일반적으로 형광 현미경 5-12로 내 Ca 2 + 신호를 측정하기 위해 사용된다. 16 - 일반적으로, 시간적 칼슘 2 + 신호는 시간에 따른 사용자 정의 지역 내의 평균 형광의 변화, 또는 관심 영역 (ROI) 5,6,13로 평가됩니다. 현재, 수동 ROI 분석은 시간과 노동력에19 -가 많은 로아를 확인하고 반복적 인 연산 17을 수행하는 사용자가 필요로하기 때문에 긴장의. 이 기술은 인공 신호 모드와 낮은 진폭 또는 확산 신호 (18, 20)의 배제의 도입을 포함, 많은 사용자의 오차가있을 수 있습니다.

, 자동 ROI 검출 알고리즘은 이전에 최적의 투자 수익 (ROI)의 위치를 결정하기 위해 통계적 다양한 접근 방법을 사용하여 구현되었지만, 일반적으로 라인 스캔 또는 의사 선 시간이 17에서 하나의 공간 차원으로 분석을 제한 스캔 이미지의 분석에 국한되어 19-22. 또한, 기존의 많은 알고리즘 캘리포니아주기, 지역화 과도에서 전파 파도 (23, 24)에 이르기까지 다양 2 + 릴리스 이벤트의 다양성을 포괄하기에 충분하지 않습니다. 생리 칼슘 2 + 신호의 종합 평가는 종종 더 큰 이미지의 인형도 만들고의 존재에 의해 복잡그 많은 실험 시스템의 잡음 차별 신호를 혼동 역할을합니다.

이전에, 캘리포니아에 자동 ROI 검출 알고리즘 솔루션 2 +는 (건강, 베데스다, MD의 국립 연구소)가 개발하고 (25), (26)을 검증 된 NIH ImageJ에 소프트웨어를위한 플러그인으로 구현, 과도 감지 신호. LC_Pro 불리는이 알고리즘은 두 가지 차원의 시간 경과 이미지 시퀀스에서 칼슘 2 + 과도 신호를 포괄의 ROI를 확인하고 분석 할 수 있도록 설계되었습니다. 여기서 실제 실험 프로토콜 및 돼지 관상 동맥 내피의 알고리즘의 적용이 가능한 대표적인 데모 그래픽 출력을 생성하기 위해 오픈 소스 통계 처리 소프트웨어 R을 후 처리하여 추가로 제공된다.

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프로토콜

1. 선박의 해부 및 이미징

  1. 마틴 등 27에 설명 된대로 국내 청소년 돼지에서 수확 조직. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) HEPES는 생리 식염수 (PSS)를 버퍼 포함 아래 해부 접시에 수확 돼지 우심실을 놓습니다.
    1. 실체 현미경의 도움으로, 해부 주위 심장 조직의 층에서 혈관 세그먼트를 제거하여 집게와 봄 가위를 사용하여 주변 조직에서 관상 동맥 (~ 8mm 길이 0.5 mm 직경) 좌전 하행의 세그먼트를 제거합니다. 참고 : 혈관 벽에 구멍을하지 않도록주의하십시오.
    2. 해부 접시에 PDMS 블록 (1 × 0.5 × 0.5 cm)를 배치하고 바닥에 핀 바늘을 사용합니다. 마이크로 핀들을 형성, 열두 ~ 0.3 cm 길이의 세그먼트로 약 40 μm의 직경의 텅스텐 와이어를 잘라 접시에 이것들을 배치합니다. 집게를 사용하여, micropi 가진 블록 용기 세그먼트의 한쪽 끝을 고정N.
    3. 조심스럽게 혈관 내강에 작은 봄 가위를 삽입하고 완전히 엽니 용기의 한 쪽 아래로 길이 방향으로 잘라. 내피 위로 열린 용기 세그먼트의 방향을.
    4. 선박이 평평한 사각형을 형성하도록 차단하는 열린 용기 세그먼트의 경계를 확보하기 위해 나머지 마이크로 핀들을 사용합니다. 참고 :, 마이크로 탑은 90 °로 구부려 블록 표면과 같은 높이까지 삽입해야합니다. 케어 overstretching로하지 않고 용기 준비 스트레칭주의해야한다; 최종 폭 ~ 시작 연신 폭을 1.5 배되어야한다.
    5. 134 염화나트륨, 6의 KCl : HEPES에 플루로 닉 (0.03 %)와 DMSO에 용해 플루오 (Fluo) - 오전 4시 (10 μM)를 혼합하여 플루오 (Fluo) - 오전 4로드 솔루션의 작은 볼륨 (~ 1 ㎖)를 준비 밀리미터에 포함 PSS는 (버퍼 1 MgCl2를, 10 HEPES, 10 포도당), 그리고 어둠 속에서 실온에서 약 40 분 동안 로딩 솔루션으로 전체 블록을 삽입합니다.
    6. 로드 한 후, 버퍼 HEPES의 블록을 씻어5 ~ 10 분 PSS.
    7. HEPES가 PSS 버퍼가 포함 된 커버 글라스 바닥 챔버에서 50 ~ 100 μm의 두께 스페이서에 블록을 설치합니다. 참고 : 금속 핀이 스페이서로 사용하고 혈관 세그먼트가 아래로 향하게하고 스페이서를 만지고되지 않도록 할 수 있습니다.
    8. 공 촛점 이미징 장비 거꾸로 현미경의 무대에 실을 배치하고 내피 세포의 층에 초점을 맞 춥니 다.
    9. 3 ~ 20 배 배율 분, 공 초점 이미지 시퀀스 aquisition 소프트웨어를 사용하여 초 당 ~ 8 프레임의 프레임 속도를위한 기초 상대 형광 캡처 시간 경과 이미지 시퀀스.
    10. 기저 형광을​​ 기록 ~ 3 분 후에는 HEPES한다 추가 3 분간 동일 HEPES에서 PSS 버퍼링 용해 물질 P (100 PM)의 부피 (~ 1 ㎖), 및 레코드와 PSS 용액을 버퍼링 대체.

2. 자동 분석

  1. 8 비트, G 등의 공 촛점 수집 소프트웨어에서 형광 칼슘 활동의 이미지 시퀀스 (들)을 렌더링없는 규모의 정보 rayscale '. TIF'형식의 파일.
  2. 오픈 ImageJ에는 파일 메뉴에서 '열기'를 클릭하고, ImageJ에있는 이미지 시퀀스 (들)을 볼 수있는 탐색기 창에서 해당 이미지 시퀀스를 선택합니다.
  3. 이미지 시퀀스 (들) 내의 활동 공간 확산의 상부 및 하부 경계를 추정하는 직사각형 ROI 도구를 사용하여 적절한 ROI 직경을 결정한다. 주 : 평균 직사각형의 직경은 투자 수익 (ROI)의 직경을하는 경우 적합한 선택입니다.
  4. 컴퓨터 하드 드라이브에 새 폴더를 만들고 폴더 디렉토리에 이미지 시퀀스 (들)을 추가합니다.
  5. ImageJ에에서 '플러그인'창을 클릭 한 다음 분석을 시작하는 'LC_Pro'을 클릭합니다.
  6. 투자 수익 (ROI)의 지름 값을 입력하고 필터 임계 값 (0.05 또는 0.01 중 하나)를 선택합니다.
  7. '약물 치료'확인란을 클릭하고 바로 전후에 약이 추가 된 시간 (초) 포인트 값을 입력합니다.
  8. '확인'을 클릭하고파일 탐색기 창에 이미지 시퀀스 디렉토리를 입력합니다.

3. 그래픽 출력

  1. 에서 R 버전 3.0.2을 다운로드 http://www.r-project.org/ .
  2. R.의 32 비트 버전을 엽니 다
  3. "파일"다음 '스크립트 열기'를 클릭하고 그래픽 실험 보고서를 생성하는 'traceplot.R'R 스크립트를 선택합니다.
  4. '패키지'를 선택하여 보정하고, gplots 패키지를 설치, '패키지를 설치', 그리고 appropirate 패키지를 선택.
  5. '디렉토리 변경'명령 다음, '파일'을 클릭하고 LC_Pro 분석 출력에 해당하는 디렉토리를 선택 탐색기 창을 사용합니다.
  6. 스크립트 창을 클릭 한 후 '실행하는 모든'스크립트를 실행하는 명령.

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결과

공초점 이미지 시퀀스에서 Ca2+ 역학의 자동 분석을 수행하기 위해 맞춤형 알고리즘인 LC_Pro가 개발 및 구현되었습니다. 그림 1에 묘사된 바와 같이, 이 알고리즘은 A) 통계적(p < 0.01) 노이즈 이상의 역동적인 Ca2+ 변화 지점을 검출하고 추적하며, B) 활성 지점 중심에 관심 영역(ROI)을 자동으로 정의하고, C) ROI에서의 평균 형광 강도를 계산하여 특정 이벤트 파라미터를 결정하는 순차적 처리 모듈을 활용합니다. 알려진 강도와 위치를 가진 컴퓨터 생성 가우시안 펄스를 사용하여 알고리즘의 그래픽 개요를 보여줍니다(그림 2). 신호 펄스(그림 2A 및 B)는 표준 정규 분포를 위한 z-score를 사용하여 이진법으로 변환되었으며, 신호 임계값 이상의 픽셀 위치에 최적 적합 타원이 할당되었습니다(그림 2C). 최적의 R...

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토론

세포 및 다세포 수준에서 복잡한 Ca2+ 신호를 해독하려면 엄격한 실험 및 분석 접근 방식이 필요합니다. 여기서, Ca2+ 의존성 형광의 시간 분해 공초점 이미지 서열이 온전한 세포 필드 내에서 통계적으로 관련된 Ca2+ 신호를 식별하고 정량화하는 자동 분석에 노출되는 접근 방식을 설명합니다. 제시된 특정 사례에서, 동맥 세그먼트를 돼지 심장으로부터 분리하고, 내피를 노출시키기 위해 핀으로 열고, Ca2+ 표시기 Fluo-4 AM, 공초점 이미징을 받고 맞춤형 알고리즘 LC_Pro로 평가되었습니다. 이 알고리즘은 1) 통계적(p < 0.01) 노이즈를 초과하는 동적 Ca2+ 변화 부위를 감지 및 추적하고, 2) 활성 사이트 센터에서 관심 영역(ROI)을 자동으로 정의하고, 3) ROI에서 평균 형광 강도를 분석하여 특정 이벤트 매개변수를 결정하도록 설계되었습니다. 이 접근 방식은 사용자 오류와 편향을 줄이고, 오프라인 분석 시간을 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535 및 MOP-93676의 일부 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
해부 접시Fisher Sci#08-772-70
폴리디메틸실록산(PDMS)Fisher Sci#NC9644388엘라스토머 키트는
HEPES 완충 PSSSigma#H3375-250GHEPES 산
실체 현미경Nikon Inst.
집게Fine Science Tools#11223-20
스프링 가위Fine Science Tools15003-08
텅스텐 와이어Scientific Inst Svcs#406
Fluo-4 AMLife Tech.#F-14201
플루로닉 F-127라이프테크
금속 핀Fine Science Tools#26002-10
커버 유리 바닥 챔버맞춤형
설계 회전 디스크 컨포칼 현미경Perkin ElmerRS-3
ImageJ 소프트웨어에서 다운로드: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
imageJ 다운로드 : http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html< / a>
R 소프트웨어다운로드 위치: http://www.r-project.org/
R traceplot 스크립트< a href = "https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing"> 다운로드 : https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing< / a>
#MNA42000#P3000MP

참고문헌

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  27. Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).

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