여기, 우리는 저산소증에 HIF1A - 매개 세포 반응의 새로운 유비퀴틴과 유비퀴틴 같은 규제를 식별 할 수있는 대상의 siRNA "ubiquitome"화면을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 기자 활동 중 강력한 읽기가 사용할 수있는 모든 생물학적 경로에 적용 할 수 있습니다.
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방법 논문
배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영
이 논문에서
요약
초록
유비퀴틴과 유비퀴틴 같은 분자 (UBLs)와 단백질의 번역 후 변형은 저산소증 응답, proteostasis, DNA 손상 반응 및 전사 등 다양한 생물 학적 경로를 조절하는 동적 인 세포 신호 전달 네트워크로 부상하고있다. 더 나은 UBLs이 인간의 질병에 관련된 경로를 조절하는 방법을 이해하기 위해, 우리는 인간의 siRNA를 컴파일 "ubiquitome"모든 알려진 UBL 시스템 경로의 구성 요소를 예측을 대상으로 1,186 siRNA의 이중 풀로 구성된 라이브러리입니다. 이 라이브러리는 UBL 성분은 당해 통로의 포지티브 또는 네거티브 레귤레이터 역할 결정하는 다양한 생물학적 경로의 기자 발현 세포주의 범위에 대해 스크리닝 할 수있다. 여기에서, 우리는 전사 기반의 루시 페라 제 기자를 사용하여 저산소증에 HIF1A - 매개 세포 반응의 ubiquitome - 레귤레이터를 식별하기 위해이 라이브러리를 사용하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 초기 분석 개발 단계1 차, 2 차 및 3 차 / 컨볼 루션 스크리닝 : 세 단계로 화면을 수행하기 전에 세포주의 선별 적합한 매개 변수를 설정하기 위해 수행된다. 그것은 단지 조사가 가장 관심있는 통로의 구성원에 대한보고의 이점을 제공으로 전체 게놈의 siRNA 라이브러리를 통해 대상의 사용은 점점 더 인기를 끌고있다. siRNA의 심사의 본질적인 한계에도 불구하고, 특히 가양는 siRNA를 표적 이탈 효과로 인한 문제의 경로의 진정한 새로운 규제의 식별은주의 깊게 수행 제어 일련의 실험을 수행함으로써 극복 할 수있다 이러한 단점을보다 큽니다.
서론
유비퀴틴과 유비퀴틴 같은 분자 (UBLs)와 단백질의 변형은 다양한 생물 학적 경로와 스트레스 반응을 조절하는 광대 한 생화학 시스템을 나타냅니다. 타겟 단백질에 UBLs의 공유 결합은 안정성, 현지화, 기능 또는 기판 (1)의 interactome를 조절하는 다양한 결과를 가질 수 있습니다. UBL 수정의 기초가되는 효소 단계는 첫 번째 유비퀴틴 설립, 지금 SUMO, NEDD8, ISG15 및 FAT10를 포함한 대부분의 UBLs와 수정을위한 패러다임의 역할을 하였다. 수정이 발생하는 경우, UBL의 diglycine 모티프의 카르 복실 그룹은 제 E2 컨쥬 효소의 활성 사이트에 전송된다 시스테인 고 에너지 티올을 형성하기 위해 E1 활성화 효소에 의해 활성화된다. E2는 (보통) 측쇄 (isopeptide)을 생성 대상 라이신 잔기가 결합이 상 UBL의 이동을 중재하는 기판 - 결합 E3 리가 아제와 상호 작용. 수정의 연속 라운드 선형 유비퀴틴 체인을 만들 유비퀴틴을위한 일곱 라이신의를 통해 발생할 수있는 기판 상에 또는 N-말단 메티오닌을 통해 isopeptide 체인을 구축하기 위해 발생할 수 있습니다. 이러한 수정은 이전의 전문 단백질 분해 효소에 의해 UBL 제거에 새로운 상호 작용 모티브를 생성하고 분해를 위해 단백질을 대상으로 다....
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프로토콜
1. 분석 개발 단계
참고 : 이전에 siRNA의 화면을 시작으로, 분석 개발 단계는 기자 셀 라인과 심사에 중요한 매개 변수를 설정하는 것이 중요합니다. 이것이 화면의 미래의 성공을 뒷받침하므로이 단계에서 상당한 노력을 투자하는 것이 필수적입니다.
- U20S-HRE 기자 세포주의 저산소증 응답의 특성을, 10 % FBS와 보충 이글 중간 (DMEM) 수정 Dulbeccos 80-90 % 년 합류에 2 × 75cm에게 U20S-HRE 세포의 2 플라스크를 성장.
- 기음 셀 중 하나 술병에서 미디어는 10 ㎖의 PBS로 두 번 씻어 2 ML 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가하고 5 분 동안 37 ° C에서 배양하여 세포를 분리. 8 ML의 DMEM 균일 한 세포 현탁액을 만들 수 상하 10 % FBS와 피펫을 Resuspend 세포.
- 피펫 (20) 중복의 셀 카운팅 챔버 정지 μL, 그리고 자동화 된 셀 커플에 실을 삽입NTER. 셀 카운터 소프트웨어의 "디스플레이 이미지"를 클릭하고 세포의 초점이되어 있는지 확인합니다. "횟수"를 클릭하고 셀 밀도를 기록해 둡니다. 다른 중복에 대해이 단계를 반복하고 평균 셀 밀도를 계산합....
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결과
이전 검사에, U20S-HRE 세포의 저산소증 응답이 설정됩니다. U20S-HRE 세포는 하류 저산소증에 노출 (그림 1A)에 HIF1A/HIF1B의 이종 구속 된 저산소증 응답 요소의 세 가지 직렬 사본의 융합 반딧불 루시 페라로 구성된 기자의 구조를 표현한다. 세포를 저산소 노출 스크리닝을위한 가장 효율적인 반응을 생성하는 확립 배의 범위 저산소증 워크 스테이션에 배치된다. U20S 세포는 따라서 루시 페라 제 수치가 저산소증 매개 HIF1A 안정화 7에 크게 의존하고, HIF2A의 낮은 수준을 표현한다. 0 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간과 루시 페라 제 활동의 저산소증 의존 유도 (그림 1B)에서 24 시간의 결과 저산소증에 U20S-HRE 세포의 노출. 활동의 ~ 10 배 유도 (그림 1B)에서 24 시간의 결과 저산소증에 U20S-HRE 세포의 노출, 따라서 이것은을 나타냅니다N의 siRNA 검사에.......
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토론
포유 동물 세포의 게놈 전체의 siRNA 스크린의 사용은 별개의 생물 학적 경로의 새로운 규제를 식별하는 매우 가치있는 것으로 입증되었습니다. 여기서, 우리는 저산소증 HIF1A - 매개 세포 반응의 레귤레이터를 식별하기 위해 타겟 ubiquitome의 siRNA를 화면의 사용을 설명했다. 그들은 일반적으로 저렴 빠르고, 쉽게 관리 할 수 만 수사관 7, 10, 11, 관심있는 통로의 구성 요소에 대한 보고서입니다 타겟이 화면은 점점 매력이되고있다.
그것은 기본 셀 기자가 심사에 적합한 지 확인하기 위해 분석 개발 단계에 큰 노력을하는 것이 중요합니다, 그 재현성과 낮은 변동성을 달성 할 수있다. 이 라이브러리 규제 가을되는 내 분리의 창을 만들 강력한 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 선택하는 것이 중요하다. 또, 이들은 각각의 분석 플레이트에 내부 제어 역할개인 접시에 문제의 신속한 식별을 허용 화면.
높은.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작품은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust), 글락소 스미스 클라인 (GSK)과 세포 신호 전달을위한 스코틀랜드 연구소 (MRC 단백질 인산화 및 Ubiquitylation 단위의 지금 부분)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 자동 액체 디스펜서 | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| 화이트 월 분석 플레이트 | Greiner Bio | One 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| siRNA 라이브러리 | Thermo Scientific | On-Target Plus | , http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| 트랜스펙션 시약 | , Invitrogen | Lipofectamine, RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| 저감 혈청 Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| tryspin-EDTA | 인비트로젠 | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
참고문헌
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10....
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재인쇄 및 허가
