고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

상대적으로 낮은 발병률에도 불구하고, 난소 암은 부인과 질환과 ^{여성, 2} 중 암 사망의 다섯 번째 주요 원인의 치명적인입니다. 이 충실히 질병 ^3의 개시 및 진행을 요점을 되풀이 신뢰할 수있는 도구와 모델의 부족에 주로 기인한다. 난소 암에 대한 우리의 지식 오늘날 대부분 ascitic 유체 ^4-7로부터 회수 불멸화 난소 표면 상피 세포 (잃었 지), 난소 암 세포주 및 일차 난소 암 세포의 사용을 통해 가능했습니다. 불행히도, 그들의 사용은 불멸화 과정 또는 체외 통로에 관련된 유전자와 표현형의 변화의 수와 ascitic 유체 준비로 인한 인구의 이질성 등 여러 가지 제한 사항이 있습니다.

따라서 난소 암의 식별과 특정한 고체 시료 유래 차 난소 암세포 UNIQU을 나타내는난소 암의 진행을 연구하는 전자 도구입니다.

획득이 악성 세포에 관련된 주요 문제는 생존의 손실이 EOC 세포의 배양에서 증식 능력의 조기 부족과 함께 간질 세포 또는 섬유 아세포의 증식에 기인한다. 고형 종양에서 단일 세포 현탁액을 만들 수있는 몇 가지 방법은 현재 기계적인 방법 또는 효소 분해를 통해, 그러나 특정 기술을 선호하는 결과 ^8의 큰 금액을 산출 존재한다. 여기, 우리는 표시가 가능한, 섬유 아세포 무료 EOC 세포의 효과적인 복구 디스 파제 II 결과에 소화 효소. 이렇게 얻어진 EOC의 문화 유전자 조작에 매우 민감하고 또한 약물 선별 검사에 유용하다, 이러한 EOC 문화가 다양한 다운 스트림 애플리케이션에 적합하다는 것을 나타낸다.

윤리 정책
난소 암의 고체 시료는 기관 심사위원회위원회 후 미네소타 대학의 조직 조달 시설 (TPF)으로 하였다 : 인간의 제목위원회 (IRB)의 승인을.

1. 시약 설치

1. 10 % FBS, 100 단위 페니실린 - 스트렙토 마이신과 DMEM을 보완하여 완전한 DMEM 매체를 준비합니다. 4 ° C에서 미디어를 저장하고 따뜻한 37 ° C는 사용하기 전에.
2. 다수의 동결을 방지하기 위해 5 ~ 10 ㎖를 별도의 볼륨으로 나누어지는 디스 파제 II는 nonfrost없는 냉동고에 -20 ° C에서 해동 및 저장.

2. 조직 컬렉션

1. 거시적으로 병리학 자에 의해 암으로 확인 된 지역에서 수술시 난소 암 (크기 ~ 5의 g)의 고체 시료를 수집합니다. 임상 표본 드 식별 및 기관 프로토콜에 따라 등록됩니다.
2. 멸균, 사우스 캐롤라이나에있는 표본을 배치REW 뚜껑, 폴리 프로필렌은 빙냉 PBS 30 ㎖로 채워진 용기 표본. 시험편 컬렉션에서 30 분 (그림 1) 내에서, 얼음 처리를 위해 연구소에 외과 병리 실험실에서 시료를 수송한다.

3. 조직 처리

1. 멸균 조건 하에서 작동하는 페트리 접시 위에 시료 (60mm X 60mm) 신선 빙냉 PBS 10 ㎖를 함유하고 추가로 (2 ㎜ 이하)가 가능한 작은 조각으로 잘라 멸균 면도날을 사용하여 (전송 도 2a 및도 2 B).
2. DMEM에 디스 파제 II (2.4 U / ㎖) (30 분 37 ° C) 데워진 10 ㎖를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송하고 30 분 동안 5 % CO _2와 37 ° C에서 알을 품다. 표본의 최적의 소화를 보장하기 위해, 수동으로 세포 슬러리마다 5 분을 선동.
3. 30 분 배양, 전송 (사용 후10 ㎖의 혈청 피펫) 셀 스트레이너 (70 μM 메쉬) 상으로 세포 슬러리를 50 ㎖ 원추형 튜브의 상단에 배치하고 시린지 플런저를 사용하여 메시에 대해 완만 한 압력을 적용 할 수있다. (메쉬의 상단에 남아있는) 모든 해리되지 않은 조직을 무시하고 50 ㎖ 멸균 원뿔 관에서 얻은 세포 현탁액을 수집합니다. 4 ° C에서 7 분 (그림 3)에 대한 320 XG에 원심 분리기.
4. 상층 액을 버리고 10 % FBS를 함유하는 DMEM으로 10 ㎖ 중에 세포 펠렛을 재현 탁.
5. 셀 5 % CO _2에서 배양 접시에있는 서스펜션과 37 ° C (그림 4)을 품어.
6. 초기 도금에서 24 시간 후 매체를 변경합니다. 이 세포 파편의 제거 및 문화에 존재하는 적혈구의 대부분을 수 있습니다.
7. 매체에게 차 EOC의 문화가 다운 스트림 애플리케이션을위한 준비가 된 후 다음 두 주 동안 매 3 일, 변경합니다.

난소 암의 임상 검체는 신선한 (도 1)는 수술 후 수거하고, 세포 슬러리를 구성하는 작은 조각 (도 2a 및 2b)에서 절단된다. 이 효소 치료에 대한 표본의 최적의 노출을 할 수 있습니다. 셀룰라 슬러리 소화 효소에 노출하고, 30 분간 37 ℃에서 배양된다. 배양 시간 동안 슬러리 (특히 각 교반 후) 점차 구름이되고이 조직 세분화의 표시이다. 배양 시간의 끝에서, 슬러리는 임의의 해리되지 않은 조직 (도 3)로부터 EOC 세포를 분리하는 세포 고사에 전사된다. 회수 된 세포 현탁액은 5 % CO 2와 37 ° C (F의 igure 4)에 배치됩니다. 이 단계에서 세포 배양의 형태는 단일 세포 현탁액과 같은 작은 덩어​​리 모두 EOC 세포의 존재를 드러낸다. 이 시점에서 문화는 또한 프리젠 밝혀 적혈구 및도 5에 도시 된 바와 같이 작은 파편의 세륨. EOC는 천천히 (1 ~ 3 일의 기간 동안) 플라스틱, 적혈구 세포 파편을 준수합니다 중요한 동안하지 않으며 그들은 결국 점진적으로 "문화에서 사라질 것이다". 초기 판에서 3 일으로, EOC의 문화가 부착 EOC 세포 클러스터와 그림 6과 같이 점진적으로 적은 적혈구와 파편을 증가합니다. 일 6-7함으로써, EOC 세포는 소용돌이 형상의 도형 (화살표)을 형성하고,도 7에 도시 된 바와 같이 EOC 세포의 전형적인 조약돌 형태 선도 다세포 큰 응집체를 형성하기 위해 플라스틱으로 확산하기 시작한다. 하루 (14)에 의해, EOC 세포는 일반적으로 합류 (그림 8)가 현재 다운 스트림 테스트 및 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다.

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임상 검체의 그림 1. 컬렉션. 난소 암의 고체 시료는 수술시 수집하고 얼음처럼 차가운 PBS의 30 ML 가득 살균, 나사 뚜껑, 폴리 프로필렌 시료 용기에 배치됩니다.

임상 검체의 그림 2. 처리. A) 신선 빙냉 PBS 1X. B 10 mL를 함유하는 페트리 접시에 전사 단단한 시험편) 임상 검체 더 크기 약 2mm로 절단.

도 4. EOC 세포 현탁액을 결과의 도금. 해리되지 않은 임의의 조직을 제거한 후, 세포 현탁액을 원심 분리하여 DMEM (CONT)에 10 ㎖에 재현 탁aining 10 % FBS와 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양 접시에서 배양

즉시 즉시 도금 후 처리. 세포 현탁액 후 EOC 세포 배양의 그림 5. 형태론은 단일 세포 현탁액으로 EOC를 보여줍니다 덩어리 (모두 화살표로 표시)에, 적혈구 세포의 파편은 아직이 단계에 풍부하다. 원본 확대, 20X.

3 일에 EOC 세포 배양의 그림 6. 형태론 도금 반 부착 EOC의 C를 표시 한 후 3 일에서. EOC 세포 배양을 도금 한 후(화살표로 나타낸) ELL 클러스터 이하 적혈구 오염. 원본 확대, 20X.

그림 7. 초기 도금 후 1 주일. EOC 세포 배양 도금에서 일주일 후 설립 EOC 문화는 조직 배양 플라스틱에 확산 세포의 소용돌이 모양의 클러스터를 보여줍니다. 원본 확대, 20X.

그림 8. 합류 EOC 문화. 문화에서 14 일 후에 일반적인 상피 조약돌 형태를 보여주는 EOC 세포의 플루 단층.

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