방법 논문

Zebrafish의 유충의 여러 어려운 대상 조직을 형질 심장 심실 사출을 사용하여 유전 모르 폴리 노의 접근을 반전

DOI:

10.3791/51595

⸱

2014년 6월 17일

 , 
1DFG-Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden

이 논문에서

요약

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이러한 유전자의 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사를 사용하여 조직 재생 등의 개발 및 생리 학적 항상성 이후 단계에서 유전자 기능을 평가하는 제브라 피쉬에 대한 적응력이 역 유전 방법.

초록

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제브라 피쉬는 세포와 기관 및 부속 기관 재생의 분자 생물학을 이해하는 중요한 모델입니다. 그러나, 역 유전학을 사용하는 분자 전략은 아직 충분히 제브라 피쉬 배아 후 유생 단계 동안 재생 또는 조직의 항상성의 유전자 기능을 평가하기 위해 개발되지 않은, 그리고 제브라 피쉬의 유충 내에서 여러 조직을 대상으로하기 어렵다. 유전자 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사는 유 전적으로 이러한 단계에서 일시적으로 통제 된 방식으로 zebrafish의 유전자를 표적으로하는 현재의 무능력에 대한 대체 방법을 제공합니다. 이 방법은 이전과 같은 유생의 꼬리 지느러미, 종종 비 침습적 조직 재생을 연구하는 데 사용되는 구조에서와 도달하기 불가능했던 구조 등 신체 전반에 걸쳐 다양한 조직에 완전 분산 모르 폴리 노의 연속 편입 할 수 있습니다. 애벌레 finfold 재생하는 동안 활성화 몇 가지 유전자는 프리젠됩니다성인 척추 조직의 재생에 t, 그래서 애벌레는 성인의 재생을 이해하는 데 유용한 모델입니다. 이 모르 폴리 노 분산 방법은 애벌레 조직의 재생뿐만 아니라 배아 후 조직의 항상성을 조절하는 다른 생리 현상에 필요한 유전자를 빠르고 쉽게 식별 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 전달 방법은 배아 발생 후의 유전자 기능의 평가에 시간적 제어에 대한 현재 필요한 전략을 제공한다.

서론

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장기와 부속의 재생은 생존과 피트니스에 대한 근본적으로 중요하다 그러나, 사람 등 여러 가지 척추 동물은 재생 능력을 제한했다. 여러 동물 모델은 광범위한 재생 능력을 가지고 존재하지만, 기관 및 부속 기관 재생하는 동안 유전자 기능을 평가하기 위해 유전자 기술을 반전은 매우 제한적이거나 존재하지 않는 남아 있습니다. 따라서 새로운 접근 방식은 이러한 모델 생물에서 중생의 분자 생물학을 해부하는 데 필요합니다.

제브라 피쉬는 여러 유전자 ​​변형 물고기 라인이 세포를 추적하기 위해 존재하기 때문에 셀 때문에 중요한 여러 장기, 조직 및 부속을 다시 생성 할 수있는 능력뿐만 아니라,의뿐만 아니라 기관 및 부속 기관 재생 1, 분자 생물학을 이해하기위한 기초가 튼튼한 모델입니다 유전자를 과발현하는 것은 2, 3를 구성한다. 그러나, 유생 지브라 피쉬의 유전자 억제는 주로 overexpre에 한정누구의 유전자 제품 유전자의 내인성 활성을 반영하지 않습니다 이득의 기능 효과를 얻을 수있는 모든 관심의 유전자 또는 사용할 수없는 지배적 인 음성 구조의 (투약) 소지. 따라서, 구체적으로 녹아웃 또는 넉다운하여 유전자 발현을 제거하는 다른 방법은 이러한 문제를 극복하기 위해 필요하다.

TALENS은 유전자 기능을 녹아웃 역방향 유전자 수단으로서 존재하여 표적 유전자 특이; 유전자의 초기 요구 사항이 배아 발달의 추가 진행을 방지하기 때문에,이 녹아웃 전략은 매우 자주 초기 배 발생 중에 기능 평가로 제한됩니다. 따라서, 이러한 TALENS를 사용하여 개발 한 후 재생 또는 기관의 항상성 등의 이상 현상을 연구하는 5 4를 배제한다. 따라서 대체 유전자 제거 전략은 완전히 형성 장기 및 구조 유전자 요건을 평가하는 초기 현상 후 유전자 기능을 대상으로하는 필요가있다.

모르 폴리 노를 주사 몇 성인 장기에 유전자를 대상으로하고, 성인이 핀 6-8의 재생에 효과를 볼되었습니다, 그러나이 방법은 전기 충격이 필요하고 많은 내부 장기로 인해 자신의 위치 나 때문에 전기에 대한 민감성에 하나 electroporate하기 어려운 중단. 직접 분사가 구조적 무결성을 방해 할 수 있기 때문에 또는 크기가 제한되어 있기 때문에 또한, 유충의 일부 조직에 직접 주사하기가 어렵습니다. finfold에 직접 분사 할 수 없기 때문에 유충의 꼬리 지느러미는 하나의 구조입니다. 따라서, 전기 천공 및 직접 분사에 대한 대안은 어느 주입 너무 작아서 또는 일렉트로 수없는 조직에서의 유전자를 표적으로 필요했다.

유생 꼬리 지느러미 재생시 특정 유전자의 기능을 대상으로 억제하기 위해, 우리는 모르 폴리 있도록 기존 기술을 수정 한늦은 무대 애벌레 꼬리 지느러미 재생하는 동안 유전자 기능의 ssessment. 이 방법은 함께 엔도 - 포터의 형질 전환 시약 (10)과 형광 태그가 morpholinos와의 심실 전달 9를 사용한다. 일단 심실에, 모르 폴리 노 - 엔도 - 포터 혼합물을 신속하게 혈관을 통해 유충에 걸쳐 퍼져 대상으로 이전에 불가능했을 조직을 입력합니다. 이 주입법은 특정 조직에서의 유전자를 표적으로하도록 변경 될 수 있으며, 아마도 현재의 유전자의 기능을 억제하는 역 유전 방법 부족한 다른 동물 모델에 적용 할 수있다. 따라서, 즉시 유충 단계에서 일반적으로 기관의 항상성 및 재생하는 동안 유전자의 기능을 연구하는 넓은 범위의 사용 가능성이있는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

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프로토콜

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1. 유리 바늘의 준비 (그림 1)

  1. 주사 바늘 (그림 1A)를 준비하기 위해 825 ㎜의 유리 모세관을 사용합니다.
  2. 바늘 풀러에 유리 모세관을 놓고 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 바늘을 당겨 : 난방 사이클 값 : 463; 사이클 값 당기는 : 230; 속도 : 150 밀리 초; 시간 : 150 밀리 초 (그림 1B).
  3. 마이크로 미터의 접안 렌즈와 입체경에서 20 μm의 직경 바늘을 생산하는 시계 제조 핀셋 뽑아 유리 모세관 휴식.
  4. 바늘을 날카롭게하고 20 μm의 경사 (그림 1C 및 1D)를 생산하기 위해 젖은 고무 물레와 선반을 사용합니다. 참고 : 샤프 빗면 바늘 뇌실에 삽입의 용이성을 향상시키고, 따라서 조직에 손상을 최소화하고 천공 근육 바늘 (도 1E-G)의 제거 후에 다시 봉인하는 것을 허용한다.

2. Prepar모르 폴리 솔루션의 ATION

  1. 7.5 mM의 최종 농도로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에서 동결 건조 된 모르 폴리 용해시켜 모르 폴리 콘텐츠를 준비한다. [자세한 내용은 제조업체의 지침 (재료 표)를 참조].
  2. 3.5 MM의 모르 폴리 노 0.5 mM의 엔도 - 포터의 최종 농도 2.8 ㎕의 엔도 - 포터 원액 (1 ㎜) (재료 표 참조) 2.5 μL의 모르 폴리 노 원액 (7.5 mm)를 혼합하여 모르 폴리 노 주입 솔루션을 준비합니다.

3. 모르 폴리 노 주입의 준비 (그림 2)

  1. 10 μL microloader 피펫 팁과 마이크로 피펫을 사용하여이 솔루션의 5 μL와 경 사진 유리 바늘을 넣습니다.
  2. 압축 공기를 넣은 피코 펌프 (그림 2A-C)에 연결된 미세 조작기의 바늘 홀더에 유리 바늘을 삽입합니다.
  3. 다음 현미경으로 바늘 홀더를 놓고 바늘 만 요구되도록유충 (그림 2A)의 심실에 삽입 한 평면 방향으로 이동합니다.
  4. 약 45 °에서 주사의 각도를 조정합니다.
  5. 대기 압력 : 다음과 같이 microinjector 값을 설정 평방 인치 (PSI) 당 20 파운드; 토출 압력 : 15 PSI; 게이트의 100 밀리 초 범위는 1.9의 기간 값 (10.9 밀리 초에 해당).
  6. 1.5 %의 20 ㎖ (w / v) 겔을 생산하는 표준 마이크로 웨이브를 이용하여 1X PBS에서 융해. 10cm 페트리 접시에 녹은 젤을 붓는다. 일단 경화, 아가로 오스가 진정 유충 (11) (그림 2D 및 2E)을 배치 할 수있는 고랑이되도록 따뜻한 아가로 오스에 홈이 분사 형태를 놓습니다.

4. 주사 (그림 3)

  1. 20 ㎎ / L의 tricaine (L-에틸-m-아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이트)가 터치 응답을 중지 할 때까지 수족관 물 100 ㎖에 애벌레를 마취.
  2. 플라스틱 파스퇴르 pipett를 사용복부 측면은 홈 (그림 3A)의 수직 아가 벽에 향하도록 전자 신중하게 젖은 아가로 오스 금형의 홈에 진정 유충을 전송합니다.
  3. 심실 멀리 주사 바늘 (그림 3A)에서 향하도록 실체 현미경 아가로 오스 플레이트를 놓습니다.
  4. 심장 심실에 삽입 바늘을 낮 춥니 다. 만 1 ~ 2 μm의 너무 깊이 바늘 (그림 3B 및 3C)를 삽입되지 않도록주의 심실에 바늘을 삽입합니다.
  5. 바늘이 삽입되면, 하트 (도 3D 및 3E)의 소거를 허용하도록 간격을 기다리고, 4-6 펄스, 용액의 각 전달 3 NL과 심실로 모르 폴리 용액을 주입.
  6. 주사 후 바늘 (삽입의 평면에 평행)를 제거하고 조심스럽게 E3 매체의 혈중 알코올 농도로 채워진 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 유충을 전송E3 신선한 배지를 포함하는 페트리 접시로 케이.
  7. 주입 된 유충을 전송할 때 바늘의 건조를 막기 위해, 1X PBS를 함유하는 페트리 접시로 바늘을 배치.
  8. 반복 4.1-4.6에게 실험 기간 동안 매일 12 ~ 24 시간을 반복합니다. 참고 : 주사를 반복하는 세포의 모르 폴리 노의 흡수 및 유지 보수를 보장합니다.

5. 주사의 분석 (그림 4)

  1. 그들은 터치 응답을 중지 할 때까지 20 ㎎ / L의 tricaine과 수족관 물 100 ㎖에 물고기를 마취.
  2. 평면 젖은 1.5 %에 옆으로 유충을 배치 E3 매체로 덮여 (w / v) 아가로 오스 플레이트.
  3. 시야 및 형광 이미징과 실체 현미경을 사용하여 이미지의 애벌레. 참고 : 유충이 투명으로, 플루 오레 태그 모르 폴리 노를 직접 주사 후 동물에 걸쳐 혈관에 형광 녹색으로 표시되어야합니다. 이 형광 추가하여 혈관 조직으로 분산됩니다15 분 (도 4A-4C).

재생 파생물의 6. 평가

  1. 피지 이미지 J 무료 소프트웨어 (http://fiji.sc/Fiji)를 사용하여 촬영 한 이미지를 평가합니다. 재생을 조사하는, 제어 및 모르 폴리 주입 유충에 발생한 회생 성장의 양을 결정하기 위해 라인 추적 툴을 사용한다.
  2. 이미지를 보정하기 위해, 끌어 주 피지 창에 파일을 드롭하여 피지에있는 원본 이미지 파일 중 하나를 엽니 다.
  3. 다음의 모든 이미지의 배율을 설정하려면 주 메뉴에서 "분석"로 이동합니다.
  4. "설정 규모"에 대한 메뉴를 클릭 드롭 다운.
  5. 이 창에서 체크 박스를 클릭하여 "글로벌"옵션을 설정합니다.
  6. 이제 드래그 앤 드롭 (단계 6.1 참조)에 의해 다시 회생 성장의 양을 측정하기 위해 화상을 연다.
  7. 도구 모음에서 "프리 핸드 선택"도구를 선택합니다.
  8. 측정 할 영역 (FI 둘러싸gures 4J-4L).
  9. Ctrl 키를 누르면 + M. 이 정사각형 픽셀에 둘러싸인 영역의 값을 보여주는 새로운 "결과"창을 엽니 다.

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결과

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(그림 3A) 등쪽으로 접근하면 날카로운, 경 주사 바늘을 ​​쉽게 제브라 피쉬의 유충의 심장 심실에 배치됩니다. 마음은 바늘 (그림 3B 및 3C)의 존재에도 불구하고 펌핑을 계속하고 혈액의 흐름이 유지됩니다. 조심 주사는 심장 (그림 3E)에 모르 폴리 노의 분사에도 불구하고 심실 또는 심장 수축 (그림 3D)의 형태를 방해하지 않습니다.

분 이내, 모르 폴리 노 - 엔도 - 포터 솔루션은 혈관 (그림 4a 및도 4b)를 통해 몸 전체에 배포합니다. 모르가 다음과 같은 최소 12 시간 또는 형광 (그림 4C)에서 관찰 더의 finfold 뇌와 같은 다른 조직으로 혈관에서 배포됩니다.

이 방법에서는, 우리는 일의 ...

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토론

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뇌 실내 주입은 배아 발생 동안 유전자 기능에 영향을주지 않고 전개 또는 신체 항상성의 나중 단계에서 유전자 기능을 테스트하기위한 신속하고 신뢰성있는 평가 방법을 제공한다. 이 기술의 성공을 보장하기 위해, 하나는 네 가지 중요한 점을 알고 있어야합니다 바늘의 중 1) 바늘 크기, 2) 건조, 3) 양을 최소화하고, 진정 솔루션 4) 최소한의 노출 시간. 너무 큰 바늘 심실 손상과 과다 출혈의 원인이됩니다 동안 너무 작은 바늘은 자주 막히게됩니다. 20 μm의 권장하지만, 바늘 이상 5 분의 1 심실 챔버의 크기 않을 것입니다. 두 번째 중요한 점은 건조하고 막히는 바늘을 유지하는 것입니다. 진정, 전송 및 위치 유충에 바늘과 피할 수없는 자주 일시 정지의 작은 크기는 바늘 끝에서 모르가 건조하고 바늘을 방해 할 수있는 충분한 시간을 제공 할 수 있습니다. 방지하기 위해이것은, 하나의 1X PBS의 페트리 접시에 바늘 젖어있다. 세 번째 중요한 점은 볼륨이 너무 높은 의해 심실의 팽만감을 최소화하는 것입니다. 투약은 바늘의 크...

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에 의해 지원되었다, 우리는 기술 지원을 Ayele Tsedeke Taddese을 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3´를 가진 Morpholino; 플루오레세인 태그Gene Tools Inc.맞춤형추가 정보 www.gene-tools.com
Endo-PorterGene Tools Inc.www.gene-tools.com
AgaroseServa120623주사 중 물고기를 놓기 위한 주입 플레이트를 붓고
트리카인(L-에틸-m-아미노-벤제이트-메탄 설포네이트)Applichem마취용
E3 배지(5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl<>sub2; 0.33 mM MgSO4)를
페트리 접시Sarstedt821.472주사 중 물고기를 배치하고 이미징
Thin Wall Glass CapillariesWorld Precision Instruments, Inc.TW100F-3주사 바늘 준비용
Microloader 피펫 팁Eppendorf5,242,956,003바늘 로딩용
파스퇴르 피펫 (3 ml/1 ml)브랜드747760/ 74775유충 이송용
Flaming/Brown needle pullerSutterwww.sutter.com
Watchmaker (Dumont) 핀셋 (크기 5)World Precision 인스트루먼트, Inc.501985날카롭게하기 전에 바늘을 제동하려면
해부 현미경올림푸스, 라이카, 자이스제조업체에 따라 다름전체 주입 설정의 일부
형광 카메라올림푸스, 라이카, 자이스제조업체에 따라 다름injeciton
PicoNozzle 키트 (마이크로 인젝터 홀더)World Precision Instruments5430-12용 미세주입
공압 PicoPump (microinjector)World Precision InstrumentsSYS-PV820미세주입용
을 촬영하기 위해 참조하십시오.

참고문헌

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