방법 논문

에 대한 성별 감정 - 키토산 하이드로 겔의 개발

DOI:

10.3791/51606

⸱

2014년 7월 10일

 , 
1Center for Craniofacial Molecular Biology, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

이 논문에서

요약

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이 문서에서는, 우리는 표면의 에나멜 재건을위한 유전자 성별 감식 - 키토산 하이드로 겔을 제조하는 프로토콜을 설명합니다. 하이드로 겔의 인회석 결정의 현장 성장 조직은 수복물의 효율성과 내구성을 향상하는 조밀 한 에나멜 복원 인터페이스를 형성했다.

초록

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생체 모방 법랑질 재건은 치아 우식 또는 침식 치료를 위한 새로운 접근 방식으로 재료 과학 및 치의학에서 중요한 주제입니다. 아멜로제닌(Amelogenin)은 인회석 결정의 조직적인 성장을 조절하는 데 중요한 단백질로 입증되었습니다. 본 논문에서는 새로운 아멜로제닌-키토산 하이드로겔을 사용하여 표재성 법랑질 재건을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 국소 불소 및 구강 세정제와 같은 다른 기존 치료법과 비교할 때 이 방법은 충치 발생을 예방할 수 있을 뿐만 아니라 중요하고 내구성 있는 법랑질 수복을 촉진할 수 있습니다. 아멜로제닌 어셈블리에 의해 조절되는 조직화된 에나멜과 같은 미세 구조는 에칭된 에나멜의 기계적 특성을 크게 향상시킬 수 있으며, 인회석 결정의 현장 재생에 의해 형성된 조밀한 에나멜-복원 인터페이스는 수복물의 효과와 내구성을 향상시킬 수 있습니다. 또한 키토산 하이드로겔은 사용이 간편하고 충치 발생의 주요 위험 요소인 세균 감염을 억제할 수 있습니다. 따라서 이 생체 적합성 및 생분해성 아멜로게닌-키토산 하이드로겔은 결함 있는 법랑질의 예방, 복원 및 치료를 위한 생체 재료로서 가능성을 보여줍니다.

서론

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치과 법랑질은 인간 치아의 단단한 광물화 된 표면입니다. 그것은 수많은 바늘 모양의 인회석 결정으로 구성되어 있으며, 에나멜이1-2를 제공하는 독특한 기계적 강도와 생물학적 보호를 보장하기 위해 조직화된 평행 프리즘에 번들로 묶여 있습니다. 뼈나 상아질과 같은 다른 광물화된 조직과 달리, 성숙한 법랑질은 무세포성이며, 치아우식증이나 미란으로 자주 발생하는 상당한 미네랄 손실1-2 후에는 스스로 재생될 수 없습니다. 바니시를 함유한 불소, 치약 및 구강 청결제와 같은 상업적으로 이용 가능한 제품은 법랑질을 재광물화하는 데 효과적이지만 그 중 어느 것도 조직화된 인회석 결정의 형성을 촉진할 가능성이 없습니다. 임상적으로 법랑질 복원을 위한 기존 치료법에는 아말감, 세라믹 또는 복합 수지와 같은 인공 재료로 채우는 절차가 포함됩니다 3. 그러나 이러한 물질은 일반적으로 병변을 둘러싼 자연 조직과 잘 접촉하지 못하는데, 그 구조, 구성 요소 및 특성이 자연 법랑질과 다르기 때문입니다. 그 결과, 이차성 충치는 치아와 이물질 사이의 경계면에서 시간이 지남에 따라 발생하는 경우가 많습니다. 그러므로, 조밀한 계면을 가진 법랑질의 제자리 재생은 재료 과학 및 구강학 분야에서 매력적인 대상입니다. 이 목적을 달성하기 위한 특히 유망한 방법 중 하나는 법랑질 표면에서 법랑질과 같은 물질의 생체 모방 합성입니다. 최근에는 나노 인회석 또는 다른 유기 첨가제 4-12를 포함하는 생체 모방 시스템을 사용하여 법랑질과 같은 재료를 제조하기 위한 수많은 시험관 내 시도가 이루어졌습니다. 그러나 완벽한 조밀한 계면을 달성하기 위해 재광화 결정을 촉진하기 위한 최적의 생체 모방 전략을 개발하는 것은 여전히 어려운 과제입니다.

법랑질 광물화 동안, 인회석 결정의 방향성 성장 및 신장은 아멜로제닌이 풍부한 매트릭스 1,13-14에 의해 조절됩니다. 법랑질 개발에서 유기 매트릭스를 모방하기 위해, 본원에서는 미란성 병변의 모델로 사용되는 산 에칭 법랑질 표면에서 현장 법랑질 재성장을 위한 아멜로게닌-키토산(CS-AMEL) 하이드로겔을 제작하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. crystals 15에 대한 "가장 다재다능한 성장 매체"로서, 하이드로겔 매트릭스는 임상적으로 다루기가 더 쉽기 때문에 용액 시스템보다 이점이 있습니다. 또한, CS-AMEL은 생체적합성, 생분해성이며, 치과 응용 분야를 위한 다른 생체 모방 시스템과 비교되는 고유한 항균 및 접착 특성을 가지고 있습니다 16. 중요한 것은, 법랑질 표면에서 인회석 결정의 현장 광물화는 수리된 층과 천연 법랑질 사이에 조밀한 인터페이스를 제공하여 잠재적으로 수복물의 내구성을 향상시키고 수복물의 가장자리에서 새로운 충치의 형성을 방지할 수 있다는 것입니다.

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프로토콜

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인간의 어금니는 남부 캘리포니아 대학의 치과의 스트로우 학교에서 추출을위한 표준 절차에 따라 추출 및 기관 검토위원회의 승인을 처리했다.

1. 산 - 에칭 치아의 준비 조각

  1. 복원 된 모든 충치가없는 사람의 세 번째 어금니를 선택합니다.
  2. 어금니의 뿌리 부분을 제거하고, 길이 방향으로 두께 수냉식 저속 다이아몬드 톱을 사용하여 조각 2mm에 몰의 왕관을 잘라. 초음파로 2 분 동안이 조각을 청소 한 다음 탈 이온수로 3 회를 씻어.
  3. , 미란 성 병변을 시뮬레이트 30 초 동안 30 % 인산으로 치아 슬라이스 에칭 후 즉시 탈 이온수로 헹구어.
  4. 초음파로 2 분 동안 에칭 조각을 청소 한 후 탈 이온수로 3 회를 씻어.

성별 감정 - 키토산 하이드로 겔의 2. 준비

  1. 촬영 준비키토산 원액 N
    1. 1 % 녹여 80 ° CO / N.에서 교반하여 1 % (v / v) 아세트산 용액 (w / v) 키토산 (중간 분자량 75-85% 탈 아세틸)
    2. RT로 용액을 냉각 한 후, 0.45 μm의 필터를 사용하여 키토산 용액을 고를. 1 M NaOH 용액을 첨가하여 5.0으로 pH 값을 조정한다.
  2. 칼슘과 인산 원액의 제조 (0.1 M)
    1. 염화칼슘 (염화칼슘)를 밖으로 달아 0.1 M 용액을 제조 한 후 솔루션가 선명해질 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. 1 M NaOH 용액을 첨가하여 11 pH 값을 조정합니다.
    2. 인산 수소 나트륨 인산염 (Na 2 HPO 4)을 칭량하고 0.1 M 용액을 제조하고 용액을 클리어 할 때까지 소용돌이를 사용하여 혼합한다.
  3. 표현과 재조합 유전자 성별 감식 17-18의 정화
    여기에 사용되는 재조합 전체 길이 돼지 유전자 성별 감식 (rP172)는 172 개의 아미노산을 가지고 있으며, 전체의 아날로그길이 네이티브 돼지를 P173 만 N-말단 메티오닌 등 Ser16 18 인산기 결여.
    1. , 탈 이온수 500 ㎖에 Lysogeny 국물 (LB) 한천 가루 20g을 추가 20 분 동안 121 ° C (액체 설정)에서 솔루션을 압력솥. ~ 55 ° C가, 한천 용액에 암피실린 (100 ㎍ / ㎖) 추가 한천 멋진하자.
    2. 중후 때까지 각 판은 식지, 페트리 접시에 한천 솔루션을 전송 한 후 한천에 응축을 방지하기 위해 플립. 4 ° C에서 비닐 봉투에 보관 판
    3. 글리세롤 재고 재조합 세포 (대장균-BC21)와 행진 LB 한천 플레이트 (-80 ° C). 37 ° C에서 접시 O / N을 품어
    4. NZCYM 미디어 50 ㎖를 준비하고 30 분 동안 121 ° C에서 미디어를 압력솥. 미디어가 식을 때까지 허용, 50 ㎖ 미디어에 100 ㎍ / ㎖의 암피실린 50 μl를 추가합니다.
    5. ampicill 보충 50 ㎖ NZCYM 미디어에 LB 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 접종높은 37 ℃에서 진탕 배양기에서 세포를 O / N을 품어
    6. NZCYM 미디어 1 L를 준비하고 30 분 동안 121 ° C에서 미디어를 압력솥. 1,000 ml의 미디어에 100 ㎎ / ㎖ 암피실린 1 ML을 추가합니다. UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 빈으로 광학 밀도 (OD) 측정 값이 표시됩니다. 참고 : 첫 번째 독서 후이를 폐기하지 마십시오.
    7. 단계 2.3.6에서 1,000 ml로 미디어에 2.3.5 단계에서 세포 배양의 10 ㎖를 접종한다. 즉시 접종 후 595 nm에서 광학 밀도를 참조하십시오. 성장을 추적하기 위해 주기적으로 광학 밀도의 측정 값이 표시됩니다. 참고 : OD이 촬영 될 때마다 빈을 읽어보십시오.
    8. 박테리아의 성장은 595 nm에서 약 0.75 ~ 0.8 OD에 도달 할 때 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG, 1 M) 700 μL로 유도한다.
    9. OD가 1.1에 도달하면 세포를 수확. 6 패트병로 플라스크의 장입 물을 붓는다. 균형과 원심 분리기를 사용하기 전에 병을 무게. 4 ° C에서 8,554 XG에 20 분 동안 원심 분리-20 ° CO / N.에 세포 펠렛을 유지
    10. 세포 알약을 꺼내 50 ㎖ 튜브에 그들을 결합. 발효의 L 당 4M 구아니딘 염산의 3.5 ML를 추가합니다. 1 분 간격으로 얼음, 30 초에 초음파 처리 2 ~ 3 시간마다.
    11. 0.5 % 포름산과 세포 부피의 6 배 희석을 확인하고 2 시간 동안 추운 방에 저어 보자. 4 ℃에서 30 분, 8,554 XG에 원심 분리기 뜨는을 유지합니다. 추운 방에서 포화 원액과 파문을 사용하여 20 % 포화 황산 암모늄을 추가, O / N.
    12. 4 ° C에서 30 분, 8,554 XG에 원심 분리기와 펠렛을 유지합니다. C4 칼럼 (10 × 250mm, 5 μM)에 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA), 부하의 펠릿을 재구성하고,이면 TFA에서 A = 0.1 % TFA 및 B = 60 % 아세토 니트릴의 선형 구배를 사용하여 분별 1.5 ML · 분 -1의 유량.
    13. 드라이 아이스에 단백질 용액을 동결 및 냉동 샘플 O / N을 냉동 건조
  4. 유전자 성별 감식 - 키토산의 제조 (CS-AMEL) hydrog엘 (그림 1A)
    1. 200 ㎍의 rp172을 1 % 키토산 용액 960 μl를 함유하는 튜브에 가입 한 후 용액이 클리어 될 때까지 소용돌이를 사용하여 혼합한다.
    2. 유전자 성별 감식 함유 키토산 용액에 0.1 M 나 2 HPO 4 용액을 15 μL 다음 0.1 M 염화칼슘 용액 25 μl를 추가하고 5 분 동안 소용돌이를 사용하여 섞는다.
    3. 정중 1 M NaOH 용액을 첨가하여 6.5 CS-AMEL 용액의 pH를 조정한다. pH 값이 6.5에 도달 할 때 CS-AMEL 하이드로 겔이 형성됩니다.

성별 감정 - 키토산 하이드로 겔 3. 에나멜 재성장

  1. 인공 타액 용액의 조제
    1. 특정 염화 마그네슘의 양 (MgCl2를, 0.2 ㎜), 칼슘 염화물 (염화칼슘, 1 ㎜), 인산이 수소 칼륨 (KH 2 PO 4, 4 ㎜), 염화칼륨 (KCl을 16 ㎜) 및 염화 암모늄 (디졸브 20 mM의 HEPES에있는 NH 4 망할 CIA, 4.5 ㎜)(4 - (2 - 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1 - 에탄 술폰산) (12)를 버퍼링.
    2. 1 M NaOH로 7.0으로 산도를 조정하고 4 ℃에서 인공 타액 솔루션을 저장
    3. 용액을 사용하기 전에, 불화 나트륨 (NaF로, 300 PPM)를 추가한다.
  2. CS-AMEL 하이드로 겔의 응용 프로그램
    1. 주사기 (그림 1B)를 사용하여 에칭 치아 슬라이스 약 20 μL CS-AMEL 하이드로 겔을 적용합니다.
    2. 2 시간 동안 실온에서 데시 케이 터에서 하이드로 겔 덮인 치아 조각을 건조.
    3. 인공 타액 용액 30 ㎖를 함유하는 비이커에 치아 슬라이스 전송. 알루미늄 호일로 비커를 덮고, 그 후에을 7 일 동안 37 ° C의 오븐에서 비커를 유지합니다.
    4. 치아 조각을 제거하고 실온에서 건조기에 건조.

새로 성장 층과 에나멜 사이의 인터페이스 4. 특성

새로 성장 층과 멜 계면의 미세 구조는 obser이었다전자 현미경 (SEM) 및 높은 회전 투과 전자 현미경 (HR-TEM)을 주사함으로써 VED. TEM 샘플은 집속 이온 빔 (FIB) 기술은 다음과 같이되어있는 절차를 사용하여 제조 하였다.

  1. FIB-SEM 악기로 샘플을로드하고 운영 지침에 따라 모든 정렬을 마무리합니다. 참고 : 미세 Z 조정이 최소 2 번 수행해야합니다.
  2. 기본 구조 (그림 2A)를 보호하기 위해 샘플에 탄소 층 (15 × 3 μm의) 보증금.
  3. 공장은 탄소 층의, 상하과 오른쪽에서 조심스럽게 샘플은 샘플의 얇은 조각을 준비하고, 다음이 얇은 조각의 바닥면을 잘라. 참고 : 각 분쇄 공정 (그림 2B) 전에 이온 빔 정렬을 확인합니다.
  4. 용접 백금 얇은 조각에 팁과 샘플 조각 (그림 3C)를 분리하기 위해 왼쪽을 잘라. 참고 : 용접 단계 이전에 이온 빔 정렬을 확인합니다.
  5. 티셔츠를 들어 올려그는 천천히 샘플 팁 및 리프트 아웃 TEM 그리드에 층상 샘플을 탑재 PT.
  6. 두께가 100nm 이하 (그림 3D)가 될 때까지 샘플과 팁, 얇은 샘플을 분리합니다. TEM 관찰을 수행하는 기기에서 샘플을 제거합니다. 참고 : 각 숱이 프로세스가 완료되기 전에 이온 빔 정렬을 확인합니다.

새로 성장 층의 바인딩 및 기계적 성질 5. 평가

  1. 결합력은 초음파 처리에 의해 평가된다. 10 분 동안 초음파 세척기 (42 kHz에서, 100 W)에 수리 치아 슬라이스 유지하고 후방 산란 전자-SEM 분석을 수리 층과 천연 에나멜 사이의 계면을 관찰한다.
  2. 각 수리 에나멜 표면에 20 테스트 포인트 (N = 3) 베르 코 비치 팁과 나노 압입에 의해에서 경도와 탄성 계수를 측정한다.

6. 면역 형광 염색법

  1. 트리스 buffe와 치아 조각을 세척15 분 동안 R 식염수 (TBS).
  2. 15 분 동안 TBS에서 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단.
  3. 액체를 제거하고 TBS (0.1 % BSA, 0.3 % 트리톤 X-100)에 희석 1 ° AB (1:500 치킨 안티 성별 감정)를 이용하여 시료의 O / N을 배양한다.
  4. 30 분 TBS와 함께 샘플을 세척하고 TBS에 희석 2 ° AB (1:100 안티 닭 FITC)와 O / N을 품어.
  5. 30 분 TBS와 함께 샘플을 세척하고 또 다른 30 ​​분 동안 건조 둡니다.
  6. 형광 현미경으로 관찰한다.

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결과

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여기에 설명 된 프로토콜의 효과는 전자 현미경 (SEM), 선택 영역 전자 회절 (SAED) 및 X 선 회절 (XRD) 분석을 스캔에 의해 입증된다. 칠일위한 유전자 성별 감식-키토산 (CS-AMEL) 하이드로 겔에 의한 수리 후, 15 ㎛의 두께를 에나멜 조의 층이 에칭 된 에나멜 표면에 형성 하였다. 새로 성장 된 층 (도 3a의 화살표) 표면에 수직 인 C 축을 따라 우선적으로 성장하고, 50 ~ nm의 직경이 결정의 고도로 정렬 된 배열을 만들었다. 이들 침상 결정이 천연 에나멜 (그림 3B)의 기본 단위와 유사하다 번들로 구성되었다는 것을 주목할 필요가있다. 수리 층의 SAED 결과는 [002] 방향 (도 3c)을 따라 새로 성장 된 결정의 계층 적 정렬을 드러내는 호형 패턴을 나타내었다. XRD 분석은 새로 성장 된 층을 아파타이트로 이루어지는 것이 확인SEM 및 SEAD 관측 (도 3d)에 따라...

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토론

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에나멜의 미네랄 함량이 높은 그것을 인간의 몸에서 가장 단단한 광물 조직을 만드는 동안,이 바이오 세라믹은 종종 충치 또는 부식으로 발생하는 탈염 공정에 영향을 받기 쉽다. 유전자 돌연변이는 Amelogenesis 부전증 (20)라는 에나멜 기형의 상속 질병의 시리즈로 이어지는 얇은 또는 연약한 사기질을 일으킬 수 있습니다. 불소 또는 CPP-ACP를 포함하는 구강 건강 관리 제품은 몇 년 초기 에나멜 병변의 재석 회화를 촉진하기 위해 (즉, 니스, 치아 페이스트 및 구강 세정제)를위한 시장에왔다. 그러나, 이들 시판품 중에 조직 인회석 결정의 형성을 촉진 할 가능성이 없다. 깊은 에나멜 충치에 대한 기존의 치료는 기계적 드릴링과 같은 아말감, 세라믹 또는 합성 수지와 같은 인공 물질과 이후의 작성을 포함한다. 이러한 접근 방식은 초기 병변의 경우에 적합하지 않을 경우 큰 AR침식의 EAS는 에나멜에 발생합니다. 건강 에나멜의 과도한 양이 치아에 더 손상을 가져 제거해야하기 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 Focus Ion Beam의 조교인 Steven Nutt 교수와 Yuzheng Zhang 교수, 전자 현미경을 담당한 USC의 전자 현미경 및 미세분석 센터(CEMMA)에 감사드립니다. 연구는 NIH-NIDCR 보조금으로 지원되었습니다. DE-13414 및 DE-020099에서 J.M.O.로

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인간의 세 번째 어금니 서던캘리포니아대학교 오스트로 치과대학 N/A서던캘리포니아대학교(University of Southern California)의 오스트로 치과대학(Ostrow School of Dentistry)에서 발치를 위한 표준 절차에 따라 인간의 어금니를 발치했으며 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받아 처리했습니다.
재조합 포신 아멜로제닌발현 및 정제  실험실에서N/ArP172, 전체 길이 
키토산 Sigma-Aldrich448877중분자량, 75-85% 탈아세틸화
인산 VWRAA033266
아세트산 빙하VWRA036289
수산화나트륨VWRBDH9292
염화칼슘 Sigma-Aldrich223506
이염기성 나트륨 인산 무수VWRBDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP 애질런트 테크놀로지스 Inc.
230255 황산 암모늄VWRBDH8001
트리플루오로아세트산VWRAAAL06374
아세토니트릴VWRBDH1103
염화마그네슘 VWRBDH0244
인산이수소칼륨 VWRBDH9268
염화칼륨 VWRBDH0258
염화암모늄 VWRAAAA15000
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid)VWRAAA14777
Sodium fluoride VWRAA11561
Tris-buffered salineBio-Rad170-643510회; TBS
소 혈청 알부민EMD Millipore 12659CalBioChem, 알부민, 소 혈청, 분획 V, 저중금속 
트리톤 X-100EMD 밀리포어 TX1568-1
닭 안티 아멜로게닌N/AN/A서던 캘리포니아 대학교 말콤 스니드 교수의 선물
소 닭 방지 IgY-FITC산타 크루즈 생명 공학sc-2700
고성능 액체 크로마토그래피 시스템Agilent Technologies Inc.Varian Prostar 210
C4 열Phenomenx 목성 5μ 300A
주사 전자 현미경 절 JSM-7001
FIB-SEM 절 JIB-4500
투과 전자 현미경 JEOLJEM-2100F
디지털 저속 다이아몬드 톱MTI CorporationSYJ-150
형광 현미경 라이카DMI3000 B
초음파 세척기 브랜슨 251042kHz, 100W
나노 인덴터 애질런트 테크놀로지스 Inc.MTS XP

참고문헌

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