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방법 논문

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용

14.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51627

⸱

2014년 6월 19일

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

이 논문에서

요약

생체 내에서 상세히 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 발전을 위해 중요하다. 여기에서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 동시에> 250 매개 변수를 평가하는 생체 내 T 세포의 분석에서 형광 타겟 어레이 (FTA 체결)의 사용을 설명한다.

초록

생체 내에서 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 개발 및 면역 요법의 설계에 중요하다. 과 적색 레이저 흥분 염료 (셀 확산 염료 eFluor 670 : 여기 우리는 카르복시 숙신 에스테르 (CFSE), 바이올렛 레이저 흥분 염료 (CTV CellTrace 바이올렛)과 같은 중요한 염료를 활용 형광 대상 배열 (FTA) 기술의 사용을 설명 CPD )> 250 뚜렷한 형광 세포 클러스터로 레이블 마우스 림프구 된 조합입니다. 이러한 자유 무역 협정 내에서 세포 클러스터는 주요 조직 적합성 (MHC) 클래스-I과 MHC 클래스 II 바인딩 펩타이드와 펄스함으로써 각각 CD8 +와 CD4 + T 세포에 대한 표적 세포의 역할을 할 수있다. 이러한 FTA 세포는 실행 가능하고 완전한 기능을 유지하며, 따라서 FTA 대상 세포와 CD4 + T 세포 묵상 헬의 CD8 + T 세포 - 매개 살인의 평가를 할 수 있도록 마우스로 관리 할 수 있습니다유동 세포 계측법에 의해 생체 내에서 실시간으로 FTA B 세포 표적 세포의 P. > 250 표적 세포가 동시에 평가 될 수 있기 때문에, 기술은 여러 가지 농도의 복수 복제물 여러 항원 에피토프 대한 T 세포 반응의 모니터링을 허용한다. 이와 같이, 기술은 정량적 (반응의 예 누적 크기) 및 정 성적 (예. 기능적 결합력 및 응답의 에피토프 - 교차 반응성) 수준 모두에서 T 세포 반응을 측정 할 수있다. 여기서, 우리는 이들의 FTA가 생성 그들은 재조합 수두 바이러스 백신에 의해 유도 된 T 세포 반응을 평가하기 위해 적용 할 수있는 방법의 예를 제공하는 방법을 설명한다.

서론

T 세포는 적응성 면역 반응에서 중심적인 역할을하고 종종 면역 요법의 조작 대상이된다. CD4 + 이펙터 T 세포는 면역의 여러 측면을 조절하고 직접 항체를 생산하는 B 세포를 도울 수 사이토 카인을 분비하여 외부 항원에 반응한다. CD8 + 세포 독성 T 세포 (CTL을)도 사이토 카인을 분비뿐만 아니라 직접 외국 항원을 발현하는 세포를 죽이는의 중심 역할을하여 외부 항원에 응답 할 수 있습니다. 이러한 T 세포의 효과기 기능을 개시 기본적인 상호 작용은 세포의 표면에서 MHC 분자에 표시 외래 펩티드와 T 세포 수용체 (TCR)의 상호 작용을 수반한다. CD4 + T 세포는 일반적으로 미생물에 감염된 세포에 표시되는 MHC 클래스-I 분자에 표시된 펩티드를 인식하는 항원 제시 세포 및 CD8 + T 세포의 MHC 클래스 II 분자에 표시된 펩티드를 인식한다.

순서대로T 세포는 면역 반응에서 재생 역할을 평가하기 위해, 그들의 이펙터 기능은 신뢰성과 민감한 기술에 의해 측정하는 것이 필수적이다. T 세포 반응 평가를위한 일반적인 방법은 다음과 같습니다; MHC class-I/II/peptide 사량의 반응; ELISPOT 및 세포 내 사이토 카인 염색에 의한 사이토 카인 생성; 51 크롬 출시 분석하여 용량을 죽이는. 이러한 분석은, 그러나, 일반적으로 시험관 내 자극 생체를 수행하거나, T 세포 기능에 한정 통찰력을 제공한다. T 세포 반응을 측정 할 때 시험 관내 자극을 통해 발생할 수있는 기능적인 파라미터 변화를 피하기 위하여 그들이 T 세포에 대한 조작에 따라 발생하는 이상적으로는 생체 내에서, 원위치에서 그들을 평가하는 것이 유익 할 것이다. 가장 일반적으로 생체 내 T 세포 기능 분석에 사용 된 일부는 생체에 열거되어 MHC 클래스 I 결합 펩티드로 펄스 표적 세포의 CTL 매개 살해를 측정에 기초같은 CFSE 같은 중요한 염료와 형광 표지를 통해 자신의 감지를 통해. 이들은 생체 내에서 일어날 때 분석법 이러한 유형의 표적 CTL 매개 살해를 모니터링 할 수 있지만, 이들은 이전 정성 파라미터는 허용하도록 요구되는 다른 농도와 펩타이드 에피토프의 다른 유형을 제시하는 복수의 타겟의 살해를 평가하는 비교적 제한된 용량 있었다 같은 기능 갈망과 에피토프 변형 교차 반응을 평가한다. 이 분석은 또한 CD4 + T 세포 매개 반응에 대한 정보를 제공하지 않습니다.

우리가 최근에 의해 동물에서 일제히> 250 표적 세포에 대한 T 세포 반응의 모니터링을 허용 형광 타겟 어레이 (의 FTA)에 기초하여 다중 분석법을 개발, T 세포 반응을 평가하기 위해 사용되는 현재의 방법에 많은 한계를 극복하기 위해 1, 2, 유동 세포 계측법. 자유 무역 협정은 SEV으로 표시 림프구로 구성되어 있습니다독특한 형광> 250 셀 클러스터가 생성 될 수 있도록 CFS​​E, CTV 및 CPD 같은 중요한 염료 ERAL 농도 및 이들의 조합. 이러한 세포가 생존하고 완전한 기능을 유지하기 때문에, 이들은 생체 소재 효과기 T 세포와의 상호 작용의 모니터링을 허용하는 동물에 주입 될 수있다. 예를 들어, FTA 셀 클러스터는 표적 세포의 한 항원 특이 CTL 매개 살해의 평가를 허용하는 MHC 클래스-I 결합 펩티드로 펄스 화 될 수있다. 또한, FTA 세포 클러스터는 허용, MHC 클래스-II 결합 펩타이드와 펄스 수있는 항원 특정 T 헬퍼 세포와 같은 CD69, CD44 및 / 또는 활성 마커의 평가에 의해 (활성을 평가하여 (T H) 활동의 평가 동족 펩타이드 2 베어링 FTA 내에서 B 세포의 CD62L). 250 개 이상의 타겟을 동시에 검출 할 수 있기 때문에, N으로 펄싱 많은 타겟 셀 클러스터에 대해 CTL 및 T H 응답을 측정 할 수있다상이한 농도의 많은 반복 실험의 포함에 umerous 펩타이드. FTA 분석은 따라서 생체 내에서 T 세포 이펙터 반응 평가의 전례없는 수준을 제공합니다.

여기서는 상세히 FTA의 구성을 설명하고 그들이 생체 내 T 세포 반응을 평가에 적용 할 수있는 방법을 보여준다. 절차는 MHC 클래스-I 및 II-​​결합 펩티드와 펄싱 42 셀 클러스터 6 반복으로 구성된 세 개의 중요한 염료의 사용을 통해 (252) 뚜렷한 세포 클러스터로 구성 FTA의 구성을 설명한다. 라벨의 양을 줄임으로써 필요한 42 셀 클러스터의 라벨이 튜브 바닥 10 ㎖ 원추형 발생하고, 표 1에 나타낸 바와 같이 튜브 랙에 이러한 레이아웃에 도움이된다.이 방법은 식별 가능한 클러스터의 작은 숫자 조정될 수있다 각 염료 1을 수행 하였다.

우리는 응 답을 측정 할 수있는 방법을 표시하여 분석의 유용성을 강조생쥐의 작은 일대에 여러 항원에 대한 재조합 수두 바이러스 예방 접종에 의해 생성 된 에스. 이것은 FTA 분석은, 각각을 통해 곡선 (AUC) 평가 및 반 최대 응답 (EC 50)을 생성하는 데 필요한 효과적인 펩타이드 농도 측정 용 영역의 사용을 누적 반응과 기능적 결합력을 측정하기 위하여 이용 될 수 있는지 보여준다.

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프로토콜

참고 :이 프로토콜에서 사용하는 마우스는 호주 국립 대학교 동물 실험 윤리위원회의 지침과 마우스에 따라 처리 하였다는 자궁 전위에 의해 안락사했다.

1. 염료 및 펩타이드 준비

  1. 염료 준비
    참고 : 염료가 분리 된 형광 강도의 세포의 라벨링을 할 수 있도록 서로 다른 농도에서 prediluted됩니다. CFSE 3.5 배 연속 희석을 통해 만든 일곱 농도로 사용하고, CTV와 CPD는 (2-4 표 참조) 3.7 배 시리얼 희석을 통해 만든 여섯 가지 농도로 사용된다. 표 2-4에 나열된 염료 스톡 농도를 표 2-4에 나열된 최종 염료 농도에서 표적 세포에 라벨을 사용한다. 염료는 수성 용액에 노출시 반응. 그것은 병이 이전에 응축에 염료의 노출을 최소화하기 위해 열을 RT 평형을 할 수 있다는 것이 중요하다.
    1. CFSE
      참고 : CFSE는 카르복시 디 아세테이트 숙신 이미 딜 에스테르 (CFDA, SE, MW 557.47)로 구매되는 일반적으로 25 ㎎ / 유리 병에.
      1. 10 mM의 주식 솔루션을 얻기 위해 4.48 ㎖의 DMSO에 CFSE의 25 밀리그램을 Resuspend.
      2. 직렬 CFSE 희석 : DMSO의 87.5 μL에 10 mM의 CFSE 주식의 35 μl를 추가하고 표 3에 각각의 염료 농도가 묽은 원액이 작업을 반복합니다.
    2. CTV
      참고 : CTV는 일반적으로 염료의 10 mM의 솔루션을 생성 할 수 DMSO 10 μL로 재구성 할 수있는 각각의 9 유리 병의 팩 구입.
      1. 재구성 및 10 mM의 솔루션을 제공하기 위해 DMSO 90 μL와 CTV의 9 튜브를 풀.
      2. 직렬 CTV를 희석 : DMSO의 29.7 μL에 10 mM의 CTV 주식의 11 μl를 추가하고 표 2에 각각의 염료 농도가 묽은 원액이 작업을 반복합니다.
    3. CPD
      참고 : CPD (MW 792.6)은 전형적인LY는 0.5 ㎎ / 유리 병으로 구입했습니다.
      1. 10 mM의 솔루션을 얻을 수 DMSO의 63 ML의 CPD의 재현 탁 0.5 밀리그램.
      2. 직렬 CPD를 희석 : DMSO의 29.7 μL에 10 mM의 CPD 주식의 11 μl를 추가하고 표 4에 각각의 염료 농도가 묽은 원액이 작업을 반복합니다.
        참고 : 염료의 주식은 몇 달 동안 -20 ° C에 저장할 수있는 기능에 상당한 손실없이 여러 번 해동하고 다시 냉동 할 수 있습니다.
  2. 펩타이드 준비
    주 : 1 μM (표 5)의 시작 농도에서 10 배 희석액을 사용하여 만든 MHC 클래스 I-바인딩 펩타이드는 일반적으로 6 개의 농도에서 표적 세포를 펄스하는 데 사용됩니다. 400 μM (표 5)의 시작 농도의 3 배 희석액을 사용하여 만든 MHC 클래스 II - 바인딩 펩타이드는 일반적으로 6 개의 농도에서 표적 세포를 펄스하는 데 사용됩니다. 각각의 펩티드가 PBS 등 그쪽에서 2X 최종 농도로 만든다T 모든 펩타이드 농도는 250 μL의 최소 볼륨이 있습니다. 펩타이드 주식 이전에 FTA의 건설 준비 및 기능에 상당한 손실없이 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
    1. 준비 재고 MHC 클래스-I 결합 펩티드
    2. 2 μm의 주식 솔루션 (배 1 μM)에 각각의 펩타이드 항원의 높은 농도를 준비
    3. 직렬 MHC 클래스 I-바인딩 펩타이드를 희석 : PBS 400 μL에 2 μM 펩티드 원액의 44.4 μl를 추가합니다. 표 5에 각 펩타이드의 농도가 묽은 원액이 작업을 반복합니다.
    4. 준비 재고 MHC 클래스-II 결합 펩티드
    5. 800 μM 원액 (2 배 400 μM)에 각각의 펩타이드 항원의 높은 농도를 준비합니다.
    6. 직렬 MHC 클래스 II - 바인딩 펩타이드를 희석 : PBS 300 μL에 800 μM 펩티드 용액 150 μl를 추가합니다. 표 5에 각 펩타이드의 농도가 묽은 원액으로이 과정을 반복합니다 .

2. FTA 준비

참고 : 아래 절차는 252 뚜렷한 세포 클러스터를 생성하기 위해 6 회 반복 6 개의 농도 (. 즉, 42 셀 클러스터)에서 7 개의 다른 펩티드 에피토프와 펄스 세포로 구성된 FTA의 구조를 설명합니다. 각 반복 내에서 어떤 항원 (무기 호)과 펄스하지 셀 클러스터는 컨트롤로 포함되어 있습니다. 자유 무역 협정은 분석시 항체의 표지에받는 사람의 세포에서 그들의 차별을 허용하는 호스트 동물에서 CD45의 동종 이형의 차이를 가지고하는 것이 도움이됩니다. 그렇지 않으면 자유 무역 협정 (단계 2.6 참조)이 목적에 대한 PKH-26 같은 다른 염료로 표시 할 수 있습니다. 일반적으로 FTA 준비 절차가 앉는 동안 처음부터 끝까지 수행된다.

  1. 라벨 (42), 10 ㎖ 원뿔 (예를 들어 표 1에서와 같이) 플라스틱 튜브에게 1-42를 바닥.
  2. 세포의 준비
    1. 비장 및 / 또는 lymp을 분리마우스의 HNODE가 표시됨. 5 ML의 주사기의 플런저 자체를 논의한 70 μm의를 통해 매쉬업에 의해 조직에서 단일 세포 현탁액을 준비하고 혈구를 사용하여 셀을 계산합니다.
    2. (RPMI, 또는 동급) 5 % 소 태아 혈청 (FCS)를 포함하는 로체스터 파크 기념 연구소 1640 11.5 ML에서 최대 200 X 10 6 세포 / ml에서 림프구를 Resuspend. 주 : 셀 3에 염료 독성을 최소화하기 위해 하이 아민 함량으로 버퍼를 사용하는 것이 중요하다.
  3. CTV 라벨링
    참고 : 세포가 처음 CTV의 6 농도가 표시되어 있습니다.
    1. 철저 튜브를 여러 번 반전시킴으로써, 세포를 재현 탁. 튜브의 위쪽 절반을 적시 않도록주의하면서, 37 ~ 42를 표시 10 ML 튜브의 6 세포 현탁액의 1.9 ML을 추가합니다.
    2. CTV와 세포 레이블을 지정하려면, 관 뚜껑을 제거하고 수평 튜브를 놓습니다.
    3. 튜브의 상단에있는 비 젖은 부분에 PBS의 83 μl를 추가하고 여기에 주식 CTV의 17 μl를 추가 (탭보기 참조원액이있는 관)에 할당되는 르 2. 주 : 비 습윤 튜브 염료 용액으로 세포 현탁액 이동 및 세포 용액의 조기 혼합을 방지하기 위해 중요하다.
    4. 튜브를 씌우고 텍싱하여 신속하고 철저하게 염료로 세포 현탁액을 섞는다.
    5. 단계를 반복 2.3.2-2.3.4 표 2에 설명 된 지정 튜브 CTV의 주식 솔루션.
    6. RT (20 ℃)​​에서 최소 5 분에 대한 세포를 품어.
  4. CFSE 라벨
    1. CTV 라벨링 후, 각 튜브에 5 % FCS를 함유하는 RPMI 5 ㎖를 첨가하고 잘 볼 텍싱하여 세포를 재현 탁.
      1. 튜브 튜브에 37 전송 세포 현탁액 1 ㎖에서 31, 25, 19, 13, 7, 1.
      2. 튜브를 튜브 (38) 전사하는 세포 현탁액 1 ㎖를 32, 26, 20, 14, 13, 및 2.
      3. 튜브 고정상에 전사 39 세포 현탁액 1 ㎖에서 33, 27, 21, 15, 9, 및 3.
      4. 셀의 튜브 (40) 전송 1 ㎖에서튜브 34, 28, 22, 16, 10, 및도 4를 현탁액.
      5. 튜브를 튜브 (41) 전사하는 세포 현탁액 1 ㎖를 35, 29, 23, 17, 11, 및 5.
      6. 관 (42)으로부터 이송 튜브 36, 30, 24, 18, 12 및 6의 세포 현탁액 1 ㎖
        참고 : 단계 2.4.1.1-2.4.1.6 동안 튜브의 위쪽 절반을 적시하지 않도록주의하십시오.
    2. CFSE와 세포 레이블을 지정하려면, 튜브의 캡을 제거하고 수평 튜브를 놓습니다.
    3. 튜브의 상단에있는 비 젖은 부분에 PBS의 103 ML을 추가하고, 여기에 (원액하는 튜브에 할당 된 표 3 참조) 재고 CFSE 7 ML을 추가합니다.
    4. 튜브를 씌우고 텍싱하여 신속하고 철저하게 염료로 세포 현탁액을 섞는다.
    5. 표 3에 기재된 지정된 튜브 CFSE의 스톡 솔루션 단계 2.4.2-2.4.4하세요.
    6. RT (20 ℃)​​에서 최소 5 분에 대한 세포를 품어.
    7. 세포를 세척 : 20 ° C의 9 ml의 세포 현탁액을 희석RPMI 포함 5 % FCS, 20 ° C에서 10 분 300 XG에 원심 분리하여 침전물과 전송 피펫으로 흡입하여 상층 액을 제거합니다.
  5. 펩타이드 펄스 및 세포 세척
    참고 : 세포 CTV와 CFSE로 표지 한 후, 그들이 MHC 클래스-I 및 / 또는 MHC 클래스 II (1.2에서 준비) 결합 펩타이드와 펄스된다. 세포 집단의 하나는 (표 1의 예. 무기 호) 펩티드로 펄스 및 T 세포 반응의 계산을위한 음성 대조구로 사용할 수 없다.
    1. 펩티드 펄스
      1. 5 % FCS를 함유하는 RPMI 중에서 250 ㎕의 총 부피에 재현 탁 세포. 참고 : 일반적으로 세포 현탁액의 50 μL, 스텝 2.4.7의 끝 부분에 상층 액의 흡인 후 남아, 따라서 펠렛 셀에 배지 200 μl를 추가합니다.
      2. 적절하게 (표 1에서와 같이) 관을 지정하는 (표 5)을 미리 준비 펩타이드 주식 250 μl를 추가 할 쉬르PBS의 제어 튜브를 포함하는 전자는 무기 호 제어로 펩타이드없이 혼자 덧붙였다.
      3. 소용돌이와 세포 현탁액을 섞는다. 주 : 각 펩티드 에피토프 각 펩타이드의 농도는 하나의 튜브에 할당되는 것이 중요이이 클러스터의 형광 서명이 표에서와 같이 (이 펩티드를 정의하는 것이기 때문에,이 관의 세포의 예상 된 형광 기반으로 분명히 기록 예를 들어 1).
      4. 1 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어.
    2. 셀 세척
      1. 얼음 냉 5 ㎖를 (4 ° C) RPMI 튜브를 반전하여 세포 현탁액과에 resuspend 세포를 5 % FCS를 포함하는 추가합니다. 조심스럽게 얼음 감기 (4 ° C) FCS 3 ㎖와 세포 현탁액을 밑받침.
      2. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 침전 FCS의 인터페이스를 보장하기 위해 느린 가속 및 제동을 사용하여 세포 현탁액을 용액으로 유지된다.
      3. 조심스럽게 다음 RPMI를 대기음방해받지 않고 세척 세포 펠렛을 떠나는 전송 피펫과 FCS. 참고 : 세포를 씻어 FCS 언더의 사용은 많은 펩티드 용액이 가능한 세포에서 제거되었는지 확인하는 데 도움이 세포가 풀링 할 때 이에 여러 무료 펩티드에 세포 인구의 노출을 제한.
      4. 다시 세포를 씻어 : 5 % FCS를 포함하는 4 ° C RPMI 10 ㎖의 세포 펠렛을 Resuspend. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 침전 상층 액을 붓는다.
      5. 풀의 모든 세포 함께 5 % FCS를 포함하는 4 ° C RPMI 6 ㎖를 사용하여 피펫 하나의 튜브에 인구. 침전물은 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 풀링 전송 피펫으로 뜨는을 대기음.
  6. CPD 셀 라벨
    참고 :이 시점에서 여섯 내부 분석은 복제가 CPD의 6 가지 농도로 표시 펩타이드 펄스 세포에 의해 생성 될 수있다.
    1. 20 ° C의 11.4 ML을 추가RPMI 철저 피펫을 사용하여 풀링 된 세포 펠렛을 재현 탁하고 5 % FCS를 함유.
    2. 튜브의 위쪽 절반을 적시 않도록주의하면서, 10 ㎖ 튜브 AF를 표시, 6 세포 현탁액의 1.9 ML을 추가합니다.
    3. CPD와 세포 레이블을 지정하려면, 관 뚜껑을 제거하고 수평 튜브를 놓습니다.
    4. 튜브의 상단에있는 비 젖은 부분에 PBS의 92 μl를 추가하고 여기에 (각 튜브에 할당 된 원액의 양은 표 4 참조) 재고 CPD를 추가합니다.
    5. 튜브를 씌우고 텍싱하여 신속하고 철저하게 염료로 세포 현탁액을 섞는다.
    6. . CFSE와 CTV 달리 CPD 라벨링 농도가 정확하게 직선 표지화 된 세포의 결과 형광 강도에 관련되지 않고, 표 4에 기재된 지정된 튜브 CPD의 스톡 솔루션 단계 2.6.3-2.6.5 주 마 그래서 여러 레이블 인구의 등거리 형광 피크를 얻기 위해 사용되는 라벨의 농도가있다(표 4 참조) 경험적으로 결정.
    7. RT (20 ℃)​​에서 최소 5 분에 대한 세포를 품어.
    8. 두 번 세포를 씻으을 Resuspend 세포를 10 ㎖에 20 ° C RPMI 5 % FCS를 함유하는. 20 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 침전 전송 피펫으로 뜨는을 대기음. 반복합니다.
    9. 풀 함께 펫을 5 % FCS를 포함하는 8 ㎖를 4 ° C의 RPMI를 사용하여 하나의 튜브에 모든 셀. 침전물은 4 ° C에서 10 분 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 모아서 전송 피펫으로 뜨는을 대기음.
  7. (선택 사항) PKH-26 셀 라벨
    참고 : FTA에 쥐를 호스팅하는 CD45 allotypic 차이를 발현하는 세포를 생성 할 수없는 경우,받는 사람의 세포에서 그들의 차별을 허용하는 PKH-26으로 표시 할 수 있습니다.
    1. 풀링 된 세포 펠렛 2.9 20 ° C PBS의 ML을 추가하고 펫을 철저하게 재현 탁.
    2. 노에 세포 현탁액을 추가n은 튜브의 위쪽 절반을 적시 않도록주의하면서, 10 ㎖ 튜브를 침수.
    3. 튜브의 캡을 제거하고 수평 튜브를 놓습니다.
    4. 튜브의 상단에있는 비 젖은 부분에 (PKH-26 염료 키트) 희석제 C의 58 μl를 추가하고, 여기에 1 ㎜ 주식 PKH-26의 42 μl를 추가합니다.
    5. 튜브 캡을 철저하게 소용돌이로 교반하여 염료로 세포 솔루션을 섞는다.
    6. RT (20 ° C)에서 10 분의 최소 세포를 품어.
    7. 두 번 세포를 씻으을 Resuspend 세포를 10 ㎖에 20 ° C RPMI 5 % FCS를 함유하는. 20 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 침전 전송 피펫으로 뜨는을 대기음. 반복합니다.
  8. 호스트 동물로 자유 무역 협정을 주입
    주 : 생체 내 T 세포 반응을 측정하기 위해 FTA 체결은 활성 면역 반응을 가지고 있고, 최대 24 시간 동안 동일 반응계에서 왼쪽 동물에 주입된다. 그것은 자유 무역 협정도 부정적인 컨트롤과 같은 순진한 동물에 주입하는 것이 중요합니다.
    1. 카운트와 PBS에 ML 당 2.5 × 10 8 세포에서 세포를 재현 탁. 컨트롤과 같은 순진한 동물을 포함, 정맥 호스트 생쥐에 세포를 200 μl를 주입한다.

3. 유동 세포 계측법

  1. FTA 주입 수확 혈액 또는 비장 (또는 관심의 다른 조직) 호스트 마우스의 후 18 ~ 24 시간.
  2. 70 μm의를 통해 매쉬업에 의해 조직에서 단일 세포 현탁액을 준비는 5 ML의 주사기의 플런저 자체를 논의한.
  3. 0.1 % BSA가 포함 된 PBS에서 최대 65 X 10 6 세포 / ML에 세포를 Resuspend.
  4. 항체 라벨링 마이크로 타이 플레이트의 우물에 세포 현탁액 100 ㎕의 분취 량을 분배.
  5. CFSE, CTV 및 CPD에 스펙트럼 호환 형광과 형광 색소 표지 항체와 형광 생존 프로브와 라벨 세포. 참고 사항 : B220과 같은 CD69 등의 활성화 마커로 세포 마커를 B에 대한 항체는 FT를 사용하는 경우 B 세포의 활성화를 측정하는 것이 필수적입니다T H 세포 반응을 측정하는 2. 자유 무역 협정과 호스트 마우스 CD45 allotypic 차이가있는 경우 CD45.1 및 / 또는 CD45.2에 대한 항체를 포함합니다.
  6. 잘 혼합하고 30 분 동안 얼음 (4 ° C)에서 배양, 세포 100 μL 씩 분주로 (0.1 % BSA가 포함 된 PBS의) 항체 / 생존 염료의 2 배 원액 100 μl를 추가합니다.
  7. 4 ° C에서 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 침전물 세포와 뜨는을 제거 : 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 200 0.1 % BSA가 포함 된 PBS의 μL, 침전 세포에서 세포를 재현 탁하고 뜨는을 제거합니다.
  8. 70 ㎛의 메쉬를 통해 0.1 % BSA, 필터 세포를 포함하고 관련 형광 염료와 접합체를 검출 할 수있는 플로우 사이토에서 유세포 분석 PBS 400 μl의 총 부피에 재현 탁 세포. 각 FTA 세포 클러스터를 해결하기 위해 3 × 10 6 림프구 이벤트까지 수집 및 통계적위한 충분한 세포를 얻을 수칼 분석. 참고 : 흐름 (예 : 하나의 스테인드 컨트롤과 같은) 모든 일반적인 컨트롤을 확인 세포 계측법에 사용된다. 일반적으로, CFSE는 블루 레이저 소스 (일반적으로 488 nm의)와 520 nm의 위에 중심 대역 통과 필터를 탐지에서 자극을 필요로; CTV는 바이올렛 레이저 소스 (일반적으로 405 nm의) 450 nm의 위에 중심 대역 통과 필터를 사용하여 검색에서 여기가 필요; 와 CPD는 빨간색 레이저 소스 (일반적으로 633 nm의 640 nm의)와 670 nm의 위에 중심 대역 통과 필터를 탐지에서 여기가 필요합니다.

4. 데이터 분석

  1. 표준 유동 세포 계측법 소프트웨어를 사용하여 데이터 유세포 분석 (고용 게이팅 전략의 유형의 예를 들어 대표적인 결과 참조).
  2. % 특정 죽이는, MHC 클래스 I-결합 펩타이드 ( "무기") 펄스 펩타이드되지 않은 FTA 클러스터와 펄스 각각의 FTA 세포 클러스터에있는 세포의 수를 계산하고 계산하려면 다음 공식을 사용하여% 특정 살해.
    % 특정 살해 figure-protocol-1
    참고 : "준비가 끝났다"위의 공식은 "순진"는 "펩타이드는"펩타이드 "무기"로 펄스 대상을 의미한다, 순진한 동물에서 대상을 지칭 대상 펩타이드에 대한 면역 반응이 생각하는 동물에서 대상을 의미에서 어떤 펩타이드와 펄스하지 대상을 의미한다.
  3. B 세포 활성화를 들어 T의 H 활성의 척도로서,의 GMFI 빼기 "프라이머"동물에서 MHC 클래스 II-결합 펩타이드 및 이로부터 펄스 FTA B 세포상의 CD69 항체 형광의 기하 평균 형광 강도 (GMFI)를 계산 T의 H 활동의 측정 값을 제공하기 위해 "원시적"동물에 대응 FTA B 세포상의 CD69 발현.
  4. 단계 4.2 및 4.3, 사용에서 발생하는 통계에서이러한 곡선과 EC 50 아래 지역 (이러한 계산은 AUC에 대해 수행하는 방법에 대한 깊이있는 설명과 다른 양적 및 질적 매개 변수를 계산하는 등의 그래프 패드 프리즘과 같은 수학 스프레드 시트 소프트웨어에서 찾을 수 있습니다
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm 및 EC50 점 : http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. HTM? reg_the_ec50.htm).

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결과

FTA 분석의 사용 예를 들어, BALB / C 마우스는 HIV-I CTL의 항원 결정기에 HIV-I 항원 결정기 (VV-HIV)과 응답을 표현하는 재조합 우두 바이러스 (VV)와 예방 접종을하고, 발언 금지, 발언 금지 MUT, 봉투와 폴, VV CTL 에피토프 F2L과 F2L의 MUT 및 HIV-I T H 세포 에피토프, 개그 목은 (2에 설명 된대로) 252 매개 변수 FTA 분석 (그림 1B)를 사용하여 평가 하였다. 개그 (개그 MUT) 및 F2L (F2L의 MUT)의 에피토프 변종은 VV-HIV 벡터로 표현하기 때문에 이러한 항원에 대한 반응은 항원의 변형 교차 반응성 T 세포 반응의 반사되어 있지 않습니다. 순진 마​​우스는 음의 컨트롤과 FTA 주사했다. FTA는 유동 세포 계측법 (그림 1A 및 1B)를 통해 B220 항체 염색으로 차별 PKH-26 라벨 및 FTA B 세포에 의해 ...

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토론

FTA 기반 분석의 장점은 유동 세포 계측법에 의해 하나의 호스트 동물에서> (250) 실행 가능하고 완전한 기능을 대상 세포 집단의 차별을 허용하는 것입니다. 이는 이전에 불가능했습니다 생체 유동 세포 계측법 기반 분석의 복잡성의 수준을 제공합니다. 이 6 농도에서 7 별개의 바이러스 항원에 대한 반응 등 AUC와 EC 50과 같은 매개 변수가 생체 내에서 T 세포 반응에 대해 결정 할 수 있도록 하나의 동물에서 동시에 6 복제물 모니터링 할 수있는 위의 2 동물 실험에서 강조 .

생체 내에서 T 세포 반응을 측정하는 이외에, FTA 기반 분석법은 시험관 내에서 하나의 응답을 측정하기 위해 수정 될 수있다. 이것은 본질적으로 체외에서 몇 시간에 걸쳐 반응을 측정하기 위해 문화에서 T 세포에 자유 무역 협정을 추가하는 작업이 포함됩니다. 자유 무역 협정...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 프로젝트 보​​조금 # 1010395 (BQ와 CP) 및 # 525431 (CR), 호주, 간염 및 HIV 바이러스학 EOI를 위해 호주 센터의 국립 보건 의학 연구위원회에서 프로그램 부여 # 455395 (CP)에 의해 지원되었다 2012 그랜트 (CR 및 RJJ)와 고든과 그레텔 목동 재단 (BQ와 CR)에서 부여. 우리는 JCSMR FACS 실험실의 그들의 우수한 유지 보수를 위해 Harpreet VOHRA 마이클 Devoy을 감사드립니다, 펩타이드 합성 호주 암 연구 재단 생명 자원 시설, JCSMR, ANU, 박사 데이비드 보일, CSIRO 동물 건강 연구소, 질롱, 호주 부모 HIV 백신의 주식을 제공.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMISigmaR8758
태아 송아지 혈청SeranaFCS-500
CTVInvitrogenC34557
CFDA, SEInvitrogenC1157
CPDeBioscience65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5eBioscience110730
anti-CD69 brilliant violet 605Biolegend104529
PKH-26SigmaPKH26GL-1KT
VortexScientific Industries Inc
원심분리기Eppendorf
유세포 분석기 (Fortessa 또는 파란색, 빨간색 및 보라색 레이저 소스와 동급)BDBioscience

참고문헌

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