결합 된 DNA-RNA 형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는

요약

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 세포 내에서 네이티브 환경에서의 핵산을 검출 할 수 있습니다. 우리는 여기에 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는 데 사용할 수있는 FISH에 의해 RNA와 DNA의 결합, 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

제자리 혼성화 (FISH)에서 형광 세포의 핵산의 검출을 가능 분자 기법이다. DNA 물고기는 종종 세포 유전학과 암 진단에 사용되며, 종종 중요한 임상 적 의미를 가지고있는 게놈의 수차를 검출 할 수있다. FISH RNA는 세포에서 RNA 분자를 검출하는데 사용될 수 있으며, 유전자 발현의 조절에 중요​​한 통찰력을 제공했다. DNA FISH에 적합한 조건이 깨지기 쉬운, 단일 가닥 RNA 분자에 비해 너무 가혹한 수 있습니다와 같은 세포 내 DNA 및 RNA의 물고기를 결합하는 것은 기술적으로 도전이다. 우리는 여기에서 X 염색체에 의해 인코딩 XIST RNA와 DNA의 결합을 동시에 검출 할 수 쉽게 적용 할 수있는 프로토콜을 제시한다. 이 결합 된 DNA-RNA 물고기 프로토콜 가능성이 RNA와 DNA가 탐지해야하는 다른 시스템에 적용 할 수 있습니다.

서론

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광에 의해 세포와 조직을 공부하는 것은 1970 년대 후반 ¹ 년에 소개 된 이후, 연구자들은 세포 내 수준에서 유전자 염색질 조직 및 유전자 발현을 연구 할 수있다. DNA의 FISH 자주 세포 유전학, ^핵형이, 암 진단 ⁽³⁾ 및 착상 전 유전자 검사 ^(4)에 사용되고, 그것은 그 나라의 환경에서 핵산을 검출 할 수 있으므로 분자 연구 ^5-6에서 중요한 역할을한다. RNA FISH에 의해 단일 ​​세포 발현 분석은 네이티브 차 전 사체를 검출 할 수 있고, 비 암호화 RNA를 염색체로부터 전사되고, 예를 들면 등 집단 수준에서 유전자 발현을 평가하는 다른 기술에 이점을 제공 정량적 RT-PCR, 게놈 넓은 발현 분석 또는 노던 블롯 . 원래 자신의 사이트에서 직접 발생하는 RNA 전 사체를 시각화함으로써, 예를 들어왔다유전자 발현 확률 ^7이며, 때로는 ⁸ 대립 유전자 특정 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 기술의 개선도 ^9-11 세포 내에서 하나의 mRNA 분자의 검출과 정량을 허용했다.

FISH의 기본 원리는 ....

프로토콜

1. 여성 배아 줄기 세포의 분화 유도 X 염색체의 불 활성화를 유도하기 위해

참고 : 여성 마우스 배아 줄기 세포 (요청시 제공)을 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)로 코팅 된 호화 배양 접시에 표준 ES 세포 조건에서 재배하고 있습니다. 우리는 여기에서 독자가 표준 세포 배양 기술에 ^39-41을 잘 알고 있다고 가정합니다. 분화를 유도하기 위하여, T25 접시에서 성장 ES 세포는 MEFs에서 분리되고, 분화 배지에서 도금 될 것이다.

1. ES 세포 배양에서 ES 매체를 제거하고 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다.
2. 1.5 ML 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (37 ° C에서 미리 예열) 추가하고 7 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 5 분 후, 식민지를 깨고 부드럽게 요리를 흔들.
3. 세포 분화 배지 3.5 ㎖를 첨가하여 트립신-EDTA를 비활성화. 피펫 세포 상하 단일 세포 용액을 수득하고, 수집15 ML 튜브에. 200 XG에 5 분 동안 회전, 분화 매체의 10 ML에있는 세포를 수집합니다.
4. 비 젤라틴 화 배양 접시에 세포 현탁액을 추가하고 세포 배양 인큐베이터에서 1 시간 동안 배양한다. 참고 : ES 세포 현탁....

결과

결합 된 DNA-RNA 물고기를 위에서 언급 한 프로토콜을 사용하여, 우리는 여성의 배아 줄기 세포를 분화에 X 염색체의 불 활성화를 시각화 할 수있게되었습니다. 1 우리가 XIST (인 모두 검출 DNA-RNA FISH 실험의 대표적인 예를 보여줍니다 비활성 X 염색체에 소위 XIST RNA 구름과 액티브 X 염색체에 기초 전사 핀 포인트), 그리고 핀 포인트의 신호로 볼 수있는 X 염색체의 영역으로 볼 수. 핀 포인트 신호 중 하나가되어 XIST 구름이 참으로 따라 지역화 및 X 염색체를 코팅하는 것을 보여주는, XIST 클라우드 내에 위치하고 있습니다. 세포의 99 % 이상에서, 우리는 프로토콜 올바른 DNA 신호 (데이터 미도시)를 이용하여 검출한다. RNA-FISH에 비해 XIST 구름 변성 된 DNA가 더 큰 영역을 차지하기 위해 보인다 결합 된 DNA-RNA FISH 절차가 .......

토론

DNA FISH에 적합한 조건이 안정적 RNA 분자에 비해 너무 가혹한 될 수있는 결합 된 DNA-RNA FISH는 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여러 가지 방법은 DNA와 RNA를 모두 검출 프로브와 동시 배양의 필요성을 우회 동일한 셀의 DNA 및 RNA 모두를 연구에 적용되어왔다. 예를 들어, 중첩 방식으로, 첫 번째 RNA 물고기가 수행되고, 셀은 이미지하고, 좌표를 가져옵니다. 그 후, 같은 슬라이드는 RNA FISH의 신호가 손실되는 동안, DNA 물고기에 사용됩니다. DNA의 FISH 후, 균체를 다시 묘화하고, RNA 및 DNA의 FISH 모두로부터 얻어진 사진은 겹쳐있다. 고정 된 세포의 DNA가 안정적이며, 초기 RNA 물고기에 필요한 처리에 의해 영향을받지으로이 방법은 거의 모든 경우에 작동하지만,이 4 일 이상 비용이 매우 힘든 방법입니다. 또 다른 방법으로, 먼저 RNA 물고기가 수행되고, RNA 물고기 신호는 O를 추가로 고정되어DNA의 FISH를 적용한 후에 F 고정 제. 또한,이 방법도 사용할 수.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
요청 시 암컷 마우스 배아 줄기세포			를 이용할 수 있습니다
.마우스 배아 섬유아세포는			E13.5 배아에서 파생되거나 상용 소스예: Millipore
ES 세포 배양 배지			를 통해 파생될 수 있습니다.DMEM, 15% 태아 송아지 혈청, 페니실린 100U/ml, 스트렙토마이신 100mg/ml, 비필수 아미노산, 0.1mM γ-메르캅토에탄올 및 1,000U/ml LIF. 필터는 살균하고 4 °에 보관합니다. C는 최대 2주 동안 지속됩니다.
LIF	Chemicon	ESG1107
DMEM	Invitrogen	11960085
태아 송아지 혈청	Invitrogen	10099141
페니실린– 스트렙토마이신 (100x)	인비트로젠	15140-122
비필수 아미노산	인비트로젠	11140-050
γ-메르캅토에탄올	시그마-알드리치	M7522
ES 세포 분화 매체			IMDM-글루타맥스, 15% 열 비활성화 태아 송아지 혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 비필수 아미노산, 37.8 μ l/L monothioglycerol 및 50 μ g/ml 아스코르브산
IMDM-글루타맥스	인비트로겐	31980-030
아스코르브산(50mg/ml)	시그마-알드리치	A4403
모노티오글리세롤	시그마-알드리치	M6145
T25 세포 배양 접시	Greiner Bio-one	690160
6웰 세포 배양 접시	Greiner Bio-one	662160
세포 배양 등급 PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Trypsin-EDTA 0.25%(v/v) 트립신/0.2%(w/v) EDTA PBS	Gibco	25200-056
Falcon 튜브	Falcon	352196
24 x 24mm 커버슬립	Menzle	780882
젤라틴	Sigma-Aldrich	G1890-100G	는 0.2% 젤라틴/세포 배양 PBS 용액을 준비하고 오토클레이브를 사용합니다
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7000	0.01M HCl(pH 2.0)
절대 100% 에탄올	. Sigma-Aldrich	32221-2.5L	은 절대 100% 에탄올 및 RNAse 무수를 사용하여 70% 및 90% 에탄올 용액을 만듭니다
RNAse 무수	Baxter	TKF7114
멸균 필터 팁	Rainin Bio Clean	GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin 라벨링 키트 (DIG-Nick 번역)	Roche	11745816910
biotin 라벨링 키트 (Biotin Nick 번역)	Roche	11745824910
Sephadex G50	Sigma-Aldrich	G5080
2 ml 주사기	BD Plastipak	300013
멸균 면
Eppendorf 튜브	Eppendorf 튜브
효모 tRNA 10 mg/ml	Invitrogen	15401-029
연어 정자 DNA 10 mg/ml	Invitrogen	15632-011
마우스 cot-1 DNA 1 mg/ml	Invitrogen	18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge	Eppendorf	Model 5417R
Eppendorf 냉장 원심분리기	Eppendorf	모델 5810R
2 M NaAc, pH 5.6	Sigma-Aldrich	S7670
50+ 혼성화 용액			50% 포름아미드, 2x SSC, 50mM 인산염 완충액 pH 7, 10% 덱스트란 설페이트 pH 7
포름아	미드 아크로스 유기물	3272350000
덱스트란 설페이	Fluka	31403
10mM 인산염 완충액, pH 7			1 M Na2HPO4 및 42.3 ml 1 M NaH2PO4 57.7 ml를 추가하십시오. DEPC 처리 된 물 및 오토 클레이브
변성 완충액			사용 70 % 포름 아미드 / 2x SSC / 10 mM 인산염 완충액 pH 7
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
2 M Tris pH 7.5 용액
Tris-Saline-Tween 세척 용액 (TST)			100 ml 10x 식염수, 50 ml 2M Tris, 500 &# 956; l Tween-20, 1 L
10x 식염수 용액			1 L RNAse 무료 H2O에 85g NaCl을 용해
Tris-saline-BSA (TSBSA)			500 μ을 고압증기멸균합니다. l 10x 식염수, 250 μ l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, 정제, 100x	New England Biolabs	B9001S
양-안티-파기 항체	Roche 진단		사용 1:500 TSBSA
토끼-안티 양 항체 FITC	Jackson labs		사용 TSBSA
염소-안티 토끼 항체 FITC	Jackson 사용 실험실은		TSBSA에 희석된 1:250
마우스 항 비오틴 항체	Roche 진단		사용 TSBSA에 희석된 1:200
나귀 - 항 마우스 항체 Rhodamine	Jackson 실험실은		TSBSA에 희석된 1:250
항 마우스 항체 Rhodamine	Jackson 실험실은		에 희석된 1:250 사용
			10 ml 10x 식염수, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield 마운팅 미디어(DAPI	Vectorlabs	H-1200
네일 바니시
형광 현미경 포함

.은 에 0.2%로 희석합니다. 30120086트 이 시킬 때까지 RNAse 자유수를 추가하고 당 염소 TSBSA Tris-Saline 세척 용액(TS))