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방법 논문

결합 된 DNA-RNA 형광

27.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51628

⸱

2014년 6월 14일

 , 
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

이 논문에서

요약

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 세포 내에서 네이티브 환경에서의 핵산을 검출 할 수 있습니다. 우리는 여기에 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는 데 사용할 수있는 FISH에 의해 RNA와 DNA의 결합, 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

제자리 혼성화 (FISH)에서 형광 세포의 핵산의 검출을 가능 분자 기법이다. DNA 물고기는 종종 세포 유전학과 암 진단에 사용되며, 종종 중요한 임상 적 의미를 가지고있는 게놈의 수차를 검출 할 수있다. FISH RNA는 세포에서 RNA 분자를 검출하는데 사용될 수 있으며, 유전자 발현의 조절에 중요​​한 통찰력을 제공했다. DNA FISH에 적합한 조건이 깨지기 쉬운, 단일 가닥 RNA 분자에 비해 너무 가혹한 수 있습니다와 같은 세포 내 DNA 및 RNA의 물고기를 결합하는 것은 기술적으로 도전이다. 우리는 여기에서 X 염색체에 의해 인코딩 XIST RNA와 DNA의 결합을 동시에 검출 할 수 쉽게 적용 할 수있는 프로토콜을 제시한다. 이 결합 된 DNA-RNA 물고기 프로토콜 가능성이 RNA와 DNA가 탐지해야하는 다른 시스템에 적용 할 수 있습니다.

서론

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광에 의해 세포와 조직을 공부하는 것은 1970 년대 후반 1 년에 소개 된 이후, 연구자들은 세포 내 수준에서 유전자 염색질 조직 및 유전자 발현을 연구 할 수있다. DNA의 FISH 자주 세포 유전학, 핵형이, 암 진단 (3) 및 착상 전 유전자 검사 (4)에 사용되고, 그것은 그 나라의 환경에서 핵산을 검출 할 수 있으므로 분자 연구 5-6에서 중요한 역할을한다. RNA FISH에 의해 단일 ​​세포 발현 분석은 네이티브 차 전 사체를 검출 할 수 있고, 비 암호화 RNA를 염색체로부터 전사되고, 예를 들면 등 집단 수준에서 유전자 발현을 평가하는 다른 기술에 이점을 제공 정량적 RT-PCR, 게놈 넓은 발현 분석 또는 노던 블롯 . 원래 자신의 사이트에서 직접 발생하는 RNA 전 사체를 시각화함으로써, 예를 들어왔다유전자 발현 확률 7이며, 때로는 8 대립 유전자 특정 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 기술의 개선도 9-11 세포 내에서 하나의 mRNA 분자의 검출과 정량을 허용했다.

FISH의 기본 원리는 매우 구체적인 왓슨과 크릭 염기쌍에 의해 핵산 프로브로 세포 내에서 핵산의 혼성화로 구성된다. 프로브는 직접 또는 간접적으로 검출, 미시적으로 시각화 될 수있는 신호의 결과 일 수있다. 초기 시도는 안전 문제, 제한된 공간 해상도 및 시간 12-14에 하나의 타겟을 검출 할 수있는 능력에 근거 단점이 있었다 방사성 표지 된 프로브로 구성되었다. 형광 색소, 합텐, 효소 등의 비 방사성 라벨의 후속 개발, 일상적인 분자 생물학 기법으로 물고기의 폭 넓은 사용을 허용했다. FISH 프로브는 직접 fluoroch으로 표시 할 수있다산 핵산에 형광 분자의 화학적 연결하여 romes (15)와 형광 표지 된 뉴클레오티드 16 ~ 19, 또는 프로브가 간접적으로 (비오틴과 제닌 포함) 합텐의 통합에 접합 된 합텐 특정 항체에 의해 합텐의 면역 검출 후 시각화 할 수있는 통합을 시퀀스 형광 기자는 20 ~ 21 분자. 후자의 방법은 원래의 신호를 향상시키기 위해 사용되는 형광 표지 된 항체의 여러 계층을 사용하여 신호 증폭이 가능하고, 낮은 수준으로 발현되는 RNA 종의 검출을 가능하게한다. 직접 및 간접 라벨링 기술과 다양한 합텐을 결합하여 여러 가지 목표를 동시에 동일한 셀 내에서 시각화 할 수 있습니다.

FISH 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 대상에 대한 프로브의 하이브리드입니다. 이론적으로, 프로브가 구체적으로 실제로 목표에만 바인딩되지만,이 특이성프로브는 상동 지역에 바인딩 수 있으므로 항상 달성되지 및 하이브리드 조건이 항상 특정 DNA 영역 또는 RNA 종에 적합하지 않을 것입니다. 그들이 FISH 절차의 엄격 성을 증가시킬 수 있고, 배경 잡음의 고레벨 초래 FISH 프로브의 비특이적 결합을 방지 할 수있는 포스트 - 혼성화 세척 따라서 특히 중요하다. RNA 분자가 하나의 좌초로 그들은 쉽게 FISH 프로브에 혼성화 할 수 있습니다. 대조적으로, 이중 가닥 DNA 분자는 먼저 프로브에 혼성화 할 수있는 후 변성 단계를 필요로한다. 이것은 일반적으로 DNA의 변성을 초래 시험편의 가열에 의해 달성된다. 그러나 이러한 가혹한 조건에서, 깨지기 쉬운, 단일 가닥 RNA 분자가 손실 될 수 있습니다. 따라서 결합 된 DNA-RNA FISH는 조건의 상당한 최적화를 필요로하고, 단지 RNA 또는 DNA의 별도의 검출에 비해 기술적으로 도전이다.

여기에서 우리는 프리젠타 자세한 문의는 여성 마우스 배아 줄기 세포에게 22-24 차별화에 X 염색체 불 활성화 (XCI)를 연구 할 수있다 결합, 동시에 DNA-RNA 물고기의 프로토콜입니다. XCI는 중요한 성적인 여성의 배아 발달 (25)에 대한 메커니즘 및 heterochromatinization 결과이며 따라서 여성 개인이 26 ~ 27에있는 두 개의 X 염색체 중 하나의 침묵. 이 과정에 필수적인 RNF12 22 ~ 23과 REX1 24 단백질에 의해 조절되는 비 암호화 RNA XIST 28-30가 있습니다. XIST 표현이 배아 발달 동안이나 체외에서 ES 세포 분화에 미래 비활성 X 염색체 (사이)에 상향 조절된다 와 X 염색체를 따라 확산하여 X 염색체 (31)의 전사 종료 될 염색질 리모델링 효소를 유치 할 수 있습니다. 이 XIST RNA의 확산은 X 염색체의 코팅으로 RNA FISH에 의해 시각하실 수 있습니다일부도 XIST 클라우드라고한다. 여성 ES 세포 게놈 불안정성으로 인해 자신의 X 염색체 중 하나를 잃을 수 있기 때문에, 우리는 다른 사람은 확인 만 되었으면 염색체 안정 세포가이 중요한 과정 (22), (32)의 분석에서 평가하는 것을 확인하기 위하여, XCI을 연구하기 위해 결합 된 DNA-RNA FISH를 이용했다 -34. 모든 분자 생물학 기법으로, 여러 가지 우수한 프로토콜은 35-38을 발표되었다. 여기에 우리가 할 수 있도록 마우스 ES 세포, 세포의 고정, 닉 - 번역, 고정 된 세포의 전처리에 의한 FISH 프로브의 라벨에 분화 유도에서 시작, 우리의 방법을 제시 permeabilization 이후 프로브 흡수,에 프로브의 하이브리드 타겟, 그리고 마지막으로 형광 표지 된 항체에 의해 프로브의 검출. 여기에 제시 프로토콜은 XIST RNA의 충실한 검출 이틀의 기간 내에서 X 염색체를 허용하고,이 기술의 기본 가능성이 오티에 적용 할 수 있습니다그녀의 시스템과 연구의 영역.

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프로토콜

1. 여성 배아 줄기 세포의 분화 유도 X 염색체의 불 활성화를 유도하기 위해

참고 : 여성 마우스 배아 줄기 세포 (요청시 제공)을 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)로 코팅 된 호화 배양 접시에 표준 ES 세포 조건에서 재배하고 있습니다. 우리는 여기에서 독자가 표준 세포 배양 기술에 39-41을 잘 알고 있다고 가정합니다. 분화를 유도하기 위하여, T25 접시에서 성장 ES 세포는 MEFs에서 분리되고, 분화 배지에서 도금 될 것이다.

  1. ES 세포 배양에서 ES 매체를 제거하고 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다.
  2. 1.5 ML 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (37 ° C에서 미리 예열) 추가하고 7 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 5 분 후, 식민지를 깨고 부드럽게 요리를 흔들.
  3. 세포 분화 배지 3.5 ㎖를 첨가하여 트립신-EDTA를 비활성화. 피펫 세포 상하 단일 세포 용액을 수득하고, 수집15 ML 튜브에. 200 XG에 5 분 동안 회전, 분화 매체의 10 ML에있는 세포를 수집합니다.
  4. 비 젤라틴 화 배양 접시에 세포 현탁액을 추가하고 세포 배양 인큐베이터에서 1 시간 동안 배양한다. 참고 : ES 세포 현탁액에 남아 반면 MEFs는, 비 젤라틴 화 배양 접시에 부착 할 수 있습니다.
  5. 한편, 6 - 웰 플레이트에 멸균 유리 커버 슬립 (24 X 24mm)를 추가 0.2 % 젤라틴을 추가하고, 상온에서 최소 5 분 동안 품어.
  6. 1 시간 후, 주로 비 접착 ES 세포로 구성되는, 사전 도금 ES 세포 배양의 상층 액을 수집합니다. 커버 슬립을 포함 6 - 웰 플레이트에 플레이트 ES 세포. 참고 : 사용 ⅙ 6 잘 플레이트의 6 우물 합류 T25 접시의 일. 이 잘 분화의 3 일 후에 합류 차별화 수 있습니다. 매일 매체를 변경합니다. 더 이상 차별화 시간 코스, 세균 요리에 차별화 매체 접시 사전 도금 ES 세포와 incub에 대한세포 배양 인큐베이터에 통합 된 세포의 진탕 먹었다. 이 세포는 1-2 일 전에 고정으로 커버 슬립으로 도금 될 수 배아 체를 형성하도록 허용 할 것이다.

이후 DNA-RNA의 FISH 분석을위한 차별화 된 ES 세포의 2. 고정

  1. 차별 문화에서 차별화 매체를 제거하고 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다. 참고 : 세포가 씻겨지지 않도록 조심스럽게 PBS를 추가합니다.
  2. 세포 배양 PBS를 제거하고 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) / PBS를 첨가하여 세포를 고정하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다. 주의 : PFA는 독성과 흡입하거나 피부 나 눈에 접촉 될 때 중요한 건강 위험을 일으킬 수 있습니다. 또한, PFA는 발암 물질이다.
  3. 4 % PFA / PBS를 제거하고 70 % 에탄올로 커버 슬립 배 씻는다. 주 : PFA의 흔적 후속 FISH 단계에 방해가되므로 올바른 세척이 중요합니다. 커버 슬립 전에 F에 몇 개월 -20 ° C에서 70 % 에탄올에 저장 될 수있다ISH 분석.

FISH 실험에 대한 DNA 프로브의 3. 레이블

참고 : 관심의 유전자 (최소 길이> RNA FISH, 또는> DNA의 물고기를 20킬로바이트 2 KB), 또는 관심있는 유전자를 포함하는 BAC의 DNA 조각을 얻습니다. 대부분의 전사가 동시에 검출 할 수있는 여러 사본에 원인이되므로 RNA 검출을 위해, 작은 프로브, DNA 검출에 비해 충분히 할 수 있습니다. 단일 복사본 DNA 가닥의 강한 신호에 대해서, 더 긴 프로브 혼입 합텐의 충분한 수를 검출 할 수 있도록 요구된다. 바람직하게, 비 - 전사 된 게놈 영역은 DNA 프로브를 설계를 위해 선택된다. RNA를 검출하기 위하여 더 작은 프로브를 사용할 때, 이는이 완전히 배제 할 수는 없지만 RNA가 전사되는 게놈 로커스 결합 DNA-RNA의 FISH 방법으로 검출되는 것을 방지 할 것이다. 마우스 XIST을 검출하기 위해, 5.5 킬로바이트 된 cDNA 프로브를 사용 하였다. DET에 대한X 염색체의 ection 여러 BAC 프로브가 사용될 수있다. 좋은 결과는 XIST의 현장 가까이에있는 BAC RP23-100E1 및 BAC CT7-474E4의 혼합물로 얻어졌다. 관심의 유전자 또는 염색체에 따라 여러 가지 프로브는 최적의 결과를 얻기 위해 필요할 수 있습니다. , RNA-FISH에 사용되는 재료로 작업 깨끗한 환경에서 살균 필터 팁, 이는 RNAse 무료로 H 2 O 및 작업을 사용할 때마다.

  1. DNA 1 μg을 16 μL의 총 부피에 H 2 O에서 희석. 4 제닌 ㎕의 또는 비오틴 라벨링 솔루션 (시약 참조) 추가 소용돌이로 교반하여 혼합하고 90 분 동안 16 ° C에서 알을 품다. 참고 : 비타민 B 복합체 또는 제닌 표지 뉴클레오티드 지금 흠 번역에 의해 통합됩니다.
  2. 한편, 비 통합 세포핵을 제거하기 위해 G50의 열을 준비합니다. , 2 ML의 주사기를 타고 스탬퍼을 제거하고 주사기로 멸균면을 추가합니다. 솔루션 t에서 G50 공 추가O 1 분 642 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 주사기를 배치, 주사기를 채우십시오. 참고 : 주사기의 약 80 %가 현재 G50로 가득해야합니다. 이하 G50이 존재하는 경우 반복합니다.
  3. 90 분 후, 닉 - 번역 반응 혼합물을 H 2 O의 40 μL를 추가 한 G50 컬럼에 반응을 추가한다. 열에서 빈 튜브를 추가하고 2 분 642 XG에 원심 분리기. 반응 튜브를 통하여 흐름을 수집한다.
  4. 펫을 통해 흐름의 양을 측정하고, 200 μL의 총 볼륨에 도달하는 H 2 O를 추가합니다. 13.3 μL 연어 정자 DNA (10 ㎎ / ㎖), 13.3 μL 효모의 tRNA (10 ㎎ / ㎖), 26.7 μL 마우스 침대-1 DNA (1 ㎎ / ㎖) 28 ㎕의 2 M NaAc, 산도를 추가를 통해 흐름을 침전 5.6. 소용돌이로 교반하여 혼합하고, 533 ㎕의 얼음에게 차가운 100 % 에탄올을 추가합니다. 4 ℃에서 30 분 동안 16,200 XG에서 튜브와 원심 분리기를 흔들어
  5. 뜨는을 제거하고 70 % 에탄올로 두 번 펠릿 씻는다. 5 분에 대한 16,200 XG에 원심 분리기4 ° C, 공기 펠렛을 건조. 50 + 하이브리드 솔루션의 50 μl를 추가하고 용해를 촉진하기 위해 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 참고 : 레이블이 프로브는 -20 ℃에서 몇 년 동안 저장 될 수있다 주의 : 50 + 하이브리드 솔루션, 독성, 피부, 눈과 호흡기에 자극을 줄 수 있으며, 또한 기형이다 포름 아미드가 포함되어 있습니다.

4. Permeabilization, 결합 DNA-RNA 물고기를 고정 세포의 전처리 및 하이브리드

  1. 70 % 에탄올 및 10 - 웰 플레이트에 세포 배양 PBS의 첨가를 제거하여, 커버 슬립에 고정 된 세포를 재수. 5 분 동안 품어. 총 세 번 반복합니다.
  2. 세포 배양 PBS를 제거하고 세포를 투과하는, 6 - 웰 플레이트에 0.2 %의 펩신을 추가합니다. 4 분 동안 37 ° C에서의 물을 욕조에 6 - 웰 플레이트를 품어. 펩신을 제거하고, 이는 RNAse 무료로 H 2 O와 비활성화
  3. 실온에서 5 분 동안 4 % PFA / PBS와 함께 배양하여 사후 수정 세포. fixati 후에, 5 분 동안 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다.
  4. 3 분 3 분 3 분, 100 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올로 배양하여 세포를 탈수. 전송 6 - 웰 플레이트 밖으로 커버 슬립, 그리고 몇 분 동안 공기 건조 커버 슬립.
  5. 열 접시에 1 시간 동안 65 ° C에서의 coverslips을 배양하여 나이 세포.
  6. 분석 할 수있는 모든 coverslip을 함께 추가하여 마우스 침대-1 DNA와 FISH 프로브를 사전 하이브리드, 50 + 하이브리드 솔루션, 0.5 ㎕의 마우스 침대-1 DNA, 비오틴 표지 XIST 프로브의 1 μL와 제닌의 1 μL의 25 μL X 염색체를 검출하는 표시 BAC 프로브. 소용돌이로 교반하여 혼합하고, 5 분 동안 99 ℃에서 변성. 침대-1 DNA가 프로브에 존재하는 순서를 반복 교배 할 수 있도록 45 분 동안 37 ° C에서 즉시 품어.
  7. 노화 후, 유리 슬라이드에 (SSC/10 MM의 인산 완충 formamide/2x 70 %로 구성) 변성 버퍼의 50 μl를 발견하고, 세포가 towar을 향 상단에 커버 슬립을 넣어변성 버퍼 DS. 2 분 동안 65 ° C에서 알을 품다.
  8. 5 분 동안 얼음 차가운 70 % 에탄올에 배양하여 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립, 사후 수정 세포를 추가합니다.
  9. 3 분 3 분 3 분, 100 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올에 후속 배양 세포를 탈수. 6 - 웰 플레이트에서의 coverslips를 제거하고 몇 분 동안 건조시켜.
  10. 유리 슬라이드에 사전 하이브리드 프로브를 발견하고, 상단에 커버 슬립을 배양한다. 장소 SSC formamide/2x 50 ㎖의 50 %로 가득 찬 가습 실에서 슬라이드 및 37 ℃에서 하룻밤 배양

5. 후 하이브리드 세척 및 검사의 항체 매개 검출

  1. 2X SSC와 6 - 웰 플레이트를 입력하고 미리 따뜻한 42 ° C.까지 하룻밤 배양 한 후 커버 슬립을 추가하고 5 분 동안 42 ° C에서 알을 품다.
  2. 2X SSC를 제거하고, 42 ℃에서 10 분 동안 50 % formamide/2x SSC와 커버 슬립을 품다 총 3 회 (모두 씻어 30 분)에 반복합니다.
  3. SSC formamide/2x 50 %를 제거하고 실온에서 2 × 5 분 트리스 - 식염수 사이 (TST)와 함께 슬라이드를 씻으십시오.
  4. 스팟 50 ㎕의 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 트리스 - 생리 식염수 BSA (TSBSA), 그리고 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 차단하는 거꾸로의 coverslips을 품어.
  5. 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어.
  6. 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 양 - 안티 발굴 항체 (TSBSA에서 1:500)의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 첫 번째 배양 단계의 coverslips을 품어 거꾸로.
  7. 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어.
  8. 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 FITC (TSBSA에서 1:250)가 결합 토끼 반대로 양의 항체의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 제 2 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 품다 .
  9. 트랜스FER 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어.
  10. 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 FITC (TSBSA에서 1:250)가 결합 염소 안티 - 토끼 항체의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 세 번째 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 품다 .
  11. 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어.
  12. 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 마우스 항 비오틴 항체의 μL (TSBSA에서 1:200), 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 네 번째 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 배양한다.
  13. 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어.
  14. 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 로다 민 (TSBSA에서 1:250)가 결합 당나귀 - 항 - 마우스 항체의 μL, 거꾸로 TST-가습 어두운 chamb 실온에서 30 분 동안 다섯 번째 배양 단계의 coverslips을 품어어.
  15. 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어.
  16. 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 로다 민 (TSBSA에서 1:250)가 결합 염소 안티 - 말 항체의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 여섯 번째 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 품다 . 참고 : 염소 안티 - 말 항체는 당나귀 - 항 - 마우스 항체를 인식합니다; 시 연구원에게 제공, 염소 항 당나귀 항체는 잘 작동합니다.
  17. 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. 트리스 - 식염수 (TS)과 추가 5 분을 씻으십시오.
  18. 3 분 3 분 3 분, 100 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올에 후속 배양 세포를 탈수. 6 - 웰 플레이트에서의 coverslips를 제거하고 몇 분 동안 건조시켜.
  19. 유리 슬라이드에 DAPI와 매체를 장착 한 방울 (시약 참조) 스팟, 거꾸로 상단에 커버 슬립을 추가합니다. 손톱 광택과 함께 슬라이드를 밀봉하고형광 현미경으로 FISH 결과를 평가한다 (그림 1).

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결과

결합 된 DNA-RNA 물고기를 위에서 언급 한 프로토콜을 사용하여, 우리는 여성의 배아 줄기 세포를 분화에 X 염색체의 불 활성화를 시각화 할 수있게되었습니다. 1 우리가 XIST (인 모두 검출 DNA-RNA FISH 실험의 대표적인 예를 보여줍니다 비활성 X 염색체에 소위 XIST RNA 구름과 액티브 X 염색체에 기초 전사 핀 포인트), 그리고 핀 포인트의 신호로 볼 수있는 X 염색체의 영역으로 볼 수. 핀 포인트 신호 중 하나가되어 XIST 구름이 참으로 따라 지역화 및 X 염색체를 코팅하는 것을 보여주는, XIST 클라우드 내에 위치하고 있습니다. 세포의 99 % 이상에서, 우리는 프로토콜 올바른 DNA 신호 (데이터 미도시)를 이용하여 검출한다. RNA-FISH에 비해 XIST 구름 변성 된 DNA가 더 큰 영역을 차지하기 위해 보인다 결합 된 DNA-RNA FISH 절차가 ...

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토론

DNA FISH에 적합한 조건이 안정적 RNA 분자에 비해 너무 가혹한 될 수있는 결합 된 DNA-RNA FISH는 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여러 가지 방법은 DNA와 RNA를 모두 검출 프로브와 동시 배양의 필요성을 우회 동일한 셀의 DNA 및 RNA 모두를 연구에 적용되어왔다. 예를 들어, 중첩 방식으로, 첫 번째 RNA 물고기가 수행되고, 셀은 이미지하고, 좌표를 가져옵니다. 그 후, 같은 슬라이드는 RNA FISH의 신호가 손실되는 동안, DNA 물고기에 사용됩니다. DNA의 FISH 후, 균체를 다시 묘화하고, RNA 및 DNA의 FISH 모두로부터 얻어진 사진은 겹쳐있다. 고정 된 세포의 DNA가 안정적이며, 초기 RNA 물고기에 필요한 처리에 의해 영향을받지으로이 방법은 거의 모든 경우에 작동하지만,이 4 일 이상 비용이 매우 힘든 방법입니다. 또 다른 방법으로, 먼저 RNA 물고기가 수행되고, RNA 물고기 신호는 O를 추가로 고정되어DNA의 FISH를 적용한 후에 F 고정 제. 또한,이 방법도 사용할 수...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

저자는 지난 몇 년 동안 유용하고 고무적인 토론을 해준 Erasmus MC의 복제 및 개발 부서의 전현직 구성원 모두에게 감사드립니다. 또한 유용한 피드백을 제공해 주신 세 명의 익명의 검토자에게도 감사드립니다. 그리브나우 실험실에서의 연구는 네덜란드 연구 위원회(NWO-VICI)의 자금 지원과 ERC 시작 보조금으로 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
요청 시 암컷 마우스 배아 줄기세포를 이용할 수 있습니다
.마우스 배아 섬유아세포는E13.5 배아에서 파생되거나 상용 소스예: Millipore
ES 세포 배양 배지를 통해 파생될 수 있습니다.DMEM, 15% 태아 송아지 혈청, 페니실린 100U/ml, 스트렙토마이신 100mg/ml, 비필수 아미노산, 0.1mM γ-메르캅토에탄올 및 1,000U/ml LIF. 필터는 살균하고 4 °에 보관합니다. C는 최대 2주 동안 지속됩니다.
LIFChemiconESG1107
DMEMInvitrogen11960085
태아 송아지 혈청Invitrogen10099141
페니실린– 스트렙토마이신 (100x)인비트로젠15140-122
비필수 아미노산인비트로젠11140-050
γ-메르캅토에탄올시그마-알드리치M7522
ES 세포 분화 매체IMDM-글루타맥스, 15% 열 비활성화 태아 송아지 혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 비필수 아미노산, 37.8 μ l/L monothioglycerol 및 50 μ g/ml 아스코르브산
IMDM-글루타맥스인비트로겐31980-030
아스코르브산(50mg/ml)시그마-알드리치A4403
모노티오글리세롤시그마-알드리치M6145
T25 세포 배양 접시Greiner Bio-one690160
6웰 세포 배양 접시Greiner Bio-one662160
세포 배양 등급 PBSSigma-AldrichD8537
Trypsin-EDTA 0.25%(v/v) 트립신/0.2%(w/v) EDTA PBSGibco25200-056
Falcon 튜브Falcon352196
24 x 24mm 커버슬립Menzle780882
젤라틴Sigma-AldrichG1890-100G는 0.2% 젤라틴/세포 배양 PBS 용액을 준비하고 오토클레이브를 사용합니다
PepsinSigma-AldrichP70000.01M HCl(pH 2.0)
절대 100% 에탄올. Sigma-Aldrich32221-2.5L은 절대 100% 에탄올 및 RNAse 무수를 사용하여 70% 및 90% 에탄올 용액을 만듭니다
RNAse 무수BaxterTKF7114
멸균 필터 팁Rainin Bio CleanGP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin 라벨링 키트 (DIG-Nick 번역)Roche11745816910
biotin 라벨링 키트 (Biotin Nick 번역)Roche11745824910
Sephadex G50Sigma-AldrichG5080
2 ml 주사기BD Plastipak300013
멸균 면
Eppendorf 튜브Eppendorf 튜브
효모 tRNA 10 mg/mlInvitrogen15401-029
연어 정자 DNA 10 mg/mlInvitrogen15632-011
마우스 cot-1 DNA 1 mg/mlInvitrogen18440-016
Eppendorf bench top microcentrifugeEppendorfModel 5417R
Eppendorf 냉장 원심분리기Eppendorf모델 5810R
2 M NaAc, pH 5.6Sigma-AldrichS7670
50+ 혼성화 용액50% 포름아미드, 2x SSC, 50mM 인산염 완충액 pH 7, 10% 덱스트란 설페이트 pH 7
포름아미드 아크로스 유기물3272350000
덱스트란 설페이Fluka31403
10mM 인산염 완충액, pH 71 M Na2HPO4 및 42.3 ml 1 M NaH2PO4 57.7 ml를 추가하십시오. DEPC 처리 된 물 및 오토 클레이브
변성 완충액사용 70 % 포름 아미드 / 2x SSC / 10 mM 인산염 완충액 pH 7
Tween-20Sigma-AldrichP2287
2 M Tris pH 7.5 용액
Tris-Saline-Tween 세척 용액 (TST)100 ml 10x 식염수, 50 ml 2M Tris, 500 &# 956; l Tween-20, 1 L
10x 식염수 용액1 L RNAse 무료 H2O에 85g NaCl을 용해
Tris-saline-BSA (TSBSA)500 μ을 고압증기멸균합니다. l 10x 식염수, 250 μ l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, 정제, 100xNew England BiolabsB9001S
양-안티-파기 항체Roche 진단사용 1:500 TSBSA
토끼-안티 양 항체 FITCJackson labs사용 TSBSA
염소-안티 토끼 항체 FITCJackson 사용 실험실은TSBSA에 희석된 1:250
마우스 항 비오틴 항체Roche 진단사용 TSBSA에 희석된 1:200
나귀 - 항 마우스 항체 RhodamineJackson 실험실은TSBSA에 희석된 1:250
항 마우스 항체 RhodamineJackson 실험실은에 희석된 1:250 사용
10 ml 10x 식염수, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield 마운팅 미디어(DAPIVectorlabsH-1200
네일 바니시
형광 현미경 포함
.은 에 0.2%로 희석합니다. 30120086트 이 시킬 때까지 RNAse 자유수를 추가하고 당 염소 TSBSA Tris-Saline 세척 용액(TS))

참고문헌

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