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방법 논문

제대혈 이식을 다음과 IFN-γ 평가하기 ELISPOT 분석을 수두 - 대상 포진 바이러스 - 특정 세포 성 면역의 개발

14.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51643

⸱

2014년 7월 9일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unité d'Immunopathologie Virale, Centre de Recherche du CHU Sainte-Justine, Department of Microbiology, Infectiology & Immunology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 2Infectious Diseases Service, CHU Sainte-Justine, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 3Department of Paediatrics, Université de Montréal

이 논문에서

요약

이러한 단일 세포 수준에서 사이토 카인 생성을 감지하고 T 세포 반응의 양적 및 질적 인 특성을 제공하는 감마 인터페론 (IFN-γ) ELISPOT 등 기능적 분석법 비발 세대 수두 대상 포진 향한 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다 바이러스 (VZV).

초록

수두 대상 포진 바이러스 (VZV)는 탯줄 혈액 이식 (UCBT) 다음과 같은 병적 상태와 사망률의 중요한 원인이다. 이러한 이유로, antiherpetic 예방은 VZV 감염과 관련된 합병증을 방지하기 위해 소아 UCBT받는 사람에게 체계적으로 투여하지만, 최적의 기간을 정의하는 더 강력한 증거 기반의 합의가되지 않습니다. T 세포 성 면역은 UCBT는 예방이 유지되어야하거나 중단 할 수 있는지 여부에 대해 표시를 제공 할 수있는 다음과 같은 VZV 특정 T 세포 반응의 재구성을 평가, VZV 감염의 관리에 대한 책임이 있기 때문이다. 이를 위해, VZV 특정 감마 인터페론 (IFN-γ), 효소 - 결합 immunospot (ELISPOT) 분석은 조사 된 약독 VZV 백신 시험 관내 자극에 반응하여 T 림프구에 의해 IFN-γ 생산을 특성화하기 위해 개발되었다. 이 분석은 VZV 특정 C의 빠른 재현하고 민감한 측정을 제공합니다엘 임상 환경에서 VZV 특정 면역 재구성을 모니터링하고 VZV 항원에 면역 응답 성을 평가하기위한 적절한 면역을 중재.

서론

처음으로 1989 년에 수행 UCBT 점점 아이들 1에서 다양한 종양 및 nonneoplastic 혈액 장애의 치료의 일부로서 사용된다. VZV는 두 개의 서로 다른 질환, 수두 (차 감염 후)과 대상 포진 (활성화 후)를 일으키는 원인이되는 세포 변성 인간 alphaherpesvirus입니다. 차 감염 후, VZV는 후근 신경절의 감각 신경에서 숨겨 호스트의 전 생애에 걸쳐 지속. UCBT 다음 가장 위협하는 감염성 합병증의 하나가 VZV 2-4와 연결되어 있습니다. 우리의 임상 센터에서, VZV 예방의 부재에서 3 년에서 VZV 질환 VZV 질환의 누적 발생률은 postUCBT 46 % 2. 이러한 환자에서 새로이 감염 또는 VZV의 재 활성화는 종종 중추 신경계, 폐, 간 5-7에 내장 보급과 관련이 있습니다. 그 결과, 아 시클로 비르, 팜 시클로 비어 발라 시클로 비르 또는 예방 일반적 UB에 투여함에CT받는 8,9. 그러나,이 치료 전략의 계정에 VZV 특정 T 림프구 또는 VZV 특정 T 세포 반응의 재구성의 반응 속도의 보호 가능성을 고려하지 않습니다. 장기 antiherpetic 예방의 확장 사용과 관련된 잠재적 인 문제는) 환자의 overtreatment를 포함한다; b) 항 바이러스 약제 내성 10, 11의 개발; 및 C) VZV 특정 면역 재구성 (12, 13)의 손상. 기능 VZV 특정 T 림프구의 검출은 이식 후 기간 동안 VZV에 대한 감독 세포 매개 면역 반응을 모니터링, VZV 감염에서 장기 보호의 존재와 개선 된 임상 결과 4,14,15과 관련이 있기 때문에 바이러스의보다 합리적인 사용이 발생할 수 있습니다 VZV부터 혜택을받을 환자를 구별하기 위해 의료인 있도록함으로써 치료는 그의 면역 시스템 VZV 복제 4,13를 제어 할 수있다 것과 예방 치료.

IFN-γ ELISPOT 분석 널리 실험 시스템 및 임상 다양한 조건의 모니터링 세포 매개 면역 반응에 사용됩니다. 스팟은 반응 사이트에 가시적이고 안정적​​ 침전물을 생성, 발색 기질의 절단 뒤에 생성된다. 각각의 자리하여 개별 사이토 카인을 생산하는 셀의 공간을 나타냅니다. IFN-γ ELISPOT은 동족 항원 시험 관내 자극에 응답하여 IFN-γ를 생산하는 개별 세포를 생체의 능력을 측정 할 수있을뿐 아니라 관련 세포 집단 (16, 17)의 셀 응답의 주파수의 추정치를 제공한다. 높은 감도 외에, IFN-γ ELISPOT은 항 바이러스 치료의 개시 또는 정지를 안내 겨냥 개인화 임상 프로토콜 컨텍스트에서 가능한 사용을 만드는 수행 간단하다. 절차는 describ 아래에 자세히 설명ES 구체적 VZV 유래 항원 시험 관내 자극 다음 말초 혈액 단핵 세포에 의해 IFN-γ의 생산을 검출하고 측정하기 위해 설계된 ELISPOT 분석.

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프로토콜

이 연구 프로토콜은 연구가 실시되었다 CHU 세인트 - 저스틴, 몬트리올, 퀘벡, 캐나다의 기관 윤리 심의위원회의 승인을 받았다. 동의가 추구하고 모든 연구 참가자, 부모 또는 법적 보호자로부터 얻은 것입니다. 전체 절차는 1 일에 수행하고 2 (a 층류 후드하에 즉) 멸균 조건 하에서 수행되어야한다. 인간의 혈액을 처리하기위한 표준 안전 절차를 엄격하게 준수해야합니다.

1. 플레이트를 코팅

  1. 각 웰에 1 분 35 % 에탄올 20 μl를 추가하여 96 웰 MultiScreen의 IP 흰색 ELISPOT 플레이트의 하단에 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 막을 투과. 막 약간 반투명하게한다.
  2. MUL을 사용하여, 즉시 1X 인산염 완충 생리 식염수 200 μL (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 2 ㎜ KH 2 PO 4, pH 7.4의 PBS)와 웰을 3 회 세척피펫 또는 유사한 장치를 tichannel. 이 단계는 에탄올 잔기가 세포 생존에 영향을 포획 항체에 결합 할 수있는 관련 중요하다. ELISPOT 판은 연약하고 신중하게 처리해야한다 : 자동 접시 세척기의 사용을 권장하지 않습니다.
  3. 코트 10 μg / ML의 최종 농도에 1X PBS에 희석 정제 된 마우스 항 - 인간 IFN-γ 캡처 항체의 10 μL와 우물. 일반 플라스틱 랩으로 접시를 덮고 4 ℃에서 하룻밤 배양

2. 플레이트 차단

  1. 그들이 건조 도청, 우물을 비우기 및 1X PBS 200 μL와 접시에게 5 번 씻는다.
  2. 전체 RPMI 1640 배지 200 ㎕ 씩 우물을 입력하고 (단계 차단) 37 ° C에서 2 시간 동안 접시를 품어.
  3. 플레이트는 1X PBS 200 ㎕ 씩 5 배 세포 도금 할 준비가 될 때까지 전체 1X PBS의 우물을 계속 씻으십시오.

3. 셀 도금 및 자극

  1. P 준비표준 절차를 사용하여 피콜-Paque 구배 원심 분리에 의해 인간의 정맥 혈액 샘플로부터 eripheral 혈액 단핵 세포 (PBMC). 또한, 표준 방법을 사용하여, 액체 질소에서 냉동 PBMC의 분취 량을 해동. 마지막으로 원심 분리,에 resuspend ml의 2 × 10 6 세포 /의 최종 농도에서 세포와 물 재킷 배양기에서 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 하룻밤 배양 한 후.
  2. 인큐베이터에서 PBMC를 제거하고 완전한 RPMI 1640 배지 5 ㎖의 최종 부피를 재현 탁.
  3. 실온에서 5 분간 세라 티아 마르세 슨스에서 유전자 조작 효소의 10 μL의 존재에 PBMC를 품어.
  4. PBMC의 50 μL 나누어지는을 제거하고 트리 판 블루 염색의 50 μL와 혼합. 세포를 세어 혈구와 현미경 검사 (염료 배제 방식)를 사용하여 %의 가능성을 예상하고있다. 셀 카운팅과 세포 생존 캔 알의 평가를위한 다양한 자동화 된 방법그래서 사용. PBMC는> 95 % 실행 가능해야합니다. 가능성이 95 %보다 낮은 경우 샘플을 폐기하십시오.
  5. 5 분, 폐기 뜨는, 2 X 10 6 세포 / ML의 최종 농도 2 % (V / V) 불 활성화 된 사람의 혈청 (HIS)와 보충 AIM-V 매체에 resuspend 세포 700 XG에 원심 분리기 PBMC. 자극 혼합물이 판에 추가 될 때까지 37 ℃에서 보관하십시오.
  6. , 우물에 한 번에 한 방울, 적절한 자극 혼합물의 100 μl를 추가합니다. 후술하는 바와 같이 세 개의 자극의 혼합물이 사용되어야한다 :
    1. 사용 AIM-V 매체는 2 % (V / V) 불 활성화 된 사람의 혈청 (IHS)와 같은 음성 대조군과 보충.
    2. 0.5 ㎍ / ml로 긍정적 인 제어)의 최종 농도 2 % (V / V) IHS 보충 AIM-V 매체에 희석 항 CD3 단클론 항체 (클론 OKT3)를 사용합니다.
    3. γ-조사 중 하나의 형태로, VZV의 항원을 사용하여 (10,000 Gy를, 30 분의 노출 시간) 감쇠 VZV 백신 (1,350 플라크 형성 단위 [PFU] / ml)에 살고 diluAIM-V 매체의 테드 1:200 2 % (V / V) IHS) 또는 즉시 초기에 VZV의 순서 (IE63) 인 단백질에 따라 합성 67 펩티드 (15 아미노산 잔기)의 몰 혼합물의 1 μg로 보충 . PBMC 배양 4 일 후 세포 변성 효과의 흔적이 없음을 모니터링하여 조사 효과를 제어 할 수 있습니다.
    4. 중복의 모든 우물을 준비합니다.
  7. , 우물에 한 번에 한 방울, 적절한 우물 단계 5.4에서 준비 세포를 100 μl를 추가합니다. 두 우물은 음성 대조군없이 남아 있어야합니다. 물 재킷 배양기에서 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 20 시간 동안 배양한다. 흔들 이동하거나 배양하는 동안 서로의 위에 접시를 쌓아 두지 마십시오.

4. 스팟 개발 및 검출

  1. 세포를 버리고 1X PBS로 접시에게 배 세척 0.05 % (V / V) 트윈 20 (PBST)로 보충. 트윈 20은 PVDF 나에 부착 한 세포를 분리하는 데 도움이하룻밤 배양 한 다음 mbrane.
  2. 멀티 채널 피펫을 사용하여, 0.5 mg의 100 μl를 추가 / ㎖의 바이오틴 결합 된 항-IFN-γ 모노클로 날 항체 (w / v) 소 혈청 알부민 (BSA) 0.5 %를 함유하는 1X PBS에 희석 (4S.B3 클론). 실온에서 2 시간 동안 접시를 품어.
  3. 우물 PBST로 6 배 세척하고 각 웰에게 (W / V) BSA 0.5 %를 포함 1X PBS에서 1:1000 희석 알칼리 포스 파타 아제와 스트렙 타비 딘의 conjugatd 100 μl를 추가합니다. 플레이트를 덮고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
  4. 판을 PBST로 3 배 세척하고 1X PBS로 3 배. 5 - 브로 모 -4 - 클로로 -3 - 인돌 일 포스페이트 (BCIP) / 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 (NBT) 기질 용액 100 ㎕를 추가하고 실온에서 5 분간 배양한다.
  5. 증류수 흐르는 물에 접시를 씻으십시오. ELISPOT 플레이트의 바닥 부분을 제거하고 증류수로 멤브레인의 양면을 씻는다. 공기는 판을 건조.
  6. 우물을 검사하고 입체 D를 사용하여 지점을 열거issection 현미경 또는 자동화 자리 카운터를 사용하여 번호판을 검색합니다. 그들은 동일한 날에 시험 될 수없는 경우에 얻어 빛으로부터 판을 유지한다.
    1. 해당 중복 우물에서 계산 지점의 수를 평균 및 테스트 우물 계산 반점의 수와 부정적인 제어 우물에서 계산 지점의 수 (무 세포)를 뺍니다.
    2. 10 6 PBMC 당 반점 형성 단위 수 (SFU)으로 IFN-γ 생산을 표현한다.
    3. SFU의 수가 대조군 이상> 50 10 당 6 PBMC 2 표준 편차 (SD) 인 경우 그 시료가 긍정적 인 고려 (세포 + AIM-V 매체는 2 % (V / V) IHS 보충).
    4. 장소는 계산이 너무 많은 경우 잘 당 400 SFU의 값을 사용합니다.
  7. 테스트 ELISPOT 데이터는 일반적으로 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트를 사용하여 분산할지 여부. 데이터가 정규 분포를하는 경우, 학생의 t TES를 사용하여 통계적인 비교를 수행T (2 그룹) 또는 ANOVA와 Bonferroni 사후 테스트 (다중 비교). 데이터가 정규 분포를하지 않는 경우는 Mann-Whitney U 테스트 (2 그룹) 또는 크루스 칼 - 월리스 테스트와 던의 사후 테스트 (다중 비교)을 사용합니다.

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결과

위에서 자세히 IFN-γ ELISPOT 프로토콜은 크기 및 VZV 4 향한 세포 매개 성 면역 반응의 품질을 측정하기 위해 개발하고 실험실에서 최적화되었다. VZV 항원의 다양한 소스는 자극 공정에 사용될 수있다. 풍향 :) VZV에서 시판 세제를 불 활성화 추출물 베로 세포 18 감염; IE63 15 ORF4 19을 포함한 특정 VZV 인코딩 된 단백질의 합성 펩티드를 중복 B) 풀; C) 약독 화 수두 대상 포진 백신 20 살; 와 D) VZV의 UV 불 활성화 준비가 중단 VZV의 상층 액 항원 MRC 셀 (14)을 감염. 세포 배양 항원 소스와 준비의 균일 성을 확보하고 임상 원내 변속기에 살고있는 야생형 VZV 균주의 배양 및 조작을 제한하기 위해 VZV 파생을 통해 우리의 경우, 약독 VZV 백신을 희석하는 것이 바람직했다N은 심각한 우려 10. 또한, γ 조사로 인해 전달 될 ​...

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토론

변형 및 문제 해결 : IFN-γ ELISPOT 분석법은 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 (HIV-1) 24, 25, 간염 C 바이러스 (HCV) (26)를 포함하여 미생물 병원체의 종류에 대하여 지시 세포 매개 성 면역 반응을 조사하는 데 사용되어, 27, 및 결핵균 28,29, 그냥 몇 가지 이름을 지정합니다. 여기에서 우리는 소아 UCBT받는 사람을 복구하는 VZV 특정 면역 재구성의 상관 관계를 정의하는 희망으로, 대한 세포 성 면역을 측정하는 IFN-γ ELISPOT 분석의 개발을 설명했다.

이 분석의 주요 특징은 4 배입니다. 첫째, 시간 소모적 인 T 세포의 시험 관내 팽창 이전을 필요로하지 않는다. 둘째, 간 (interassay) 변동을 최소화하는 최선의 동결 보존 PBMC 시료를 사용하여 수행 될 수...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

저자는 연구 참가자와 그들의 부모를 감사드립니다. 우리는 또한 자신의 ELISPOT 리더, 통계 분석 박사 Lubo 알렉산드로에 액세스 박사 Réjean LAPOINTE (미끼 노트르담, 몬트리올, 캐나다) 감사, 데니스 BLAIS, 산드라 카론, Silvie 루아 및 기술 전문가에 대한 마틴 CATY 것 지원. 르 퐁 디부 작업 라 매그 센터 드 cancérologie 찰스 - Bruneau에 의해, HS 및 PO에 레 projets 드 공들인 크리니크 등 디부 인 evalution 데 기술 (CHU 세인트 - 저스틴)를 부어, 그리고 백혈병과 림프종 사회에 의해에서 교부금에 의해 지원 캐나다. ISF는 라 매그 CHU 세인트 - 저스틴 르 퐁 드 라 공들인 뒤 퀘벡 - 상테 (FRQS)에서 장학금으로 지원되었다. AJG 미생물학, Infectiology & 면역학, Université 드 몬트리올 (가브리엘 - 후작 장학금), FRQS학과에서 장학금을받는 사람, 그리고 건강의 캐나다 연구소 R이 esearch (CIHR). 뉴 멕시코 라 매그 CHU 생트 저스틴, 콜 재단과 FRQS에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Leucocep 튜브VWR89048-936/89048-93212 ml 또는 50 ml 튜브는 혈액량에 따라 사용될 수 있습니다.
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-1440-02빛으로부터 보호하십시오.
벤조나아제 뉴클레아제Novagen70746-3-20 °C.
MultiScreenHTS-IP 필터 플레이트MilliporeMSIPS4W100.45의 기공 크기를 가진 멸균 & 마이크로;m. 
마우스 anti-human IFN-γ 항체BD Biosciences551221NIB42 클론을 캡처합니다. 
펩믹스 VZV IE63 JPT Peptide TechnologiesPM-VZV-IE6340 μ에 한 바이알의 내용물을 용해합니다. DMSO의 l. 6개월 이내에 사용하십시오.
비오틴 접합 항-IFN-&감마; 단클론 항체BD Biosciences5545504SB3 클론.
Streptavidin은 알칼리성 인산가수분해효소와 결합되었습니다.Bio-Rad Life Science170-3554당일에 사용하기 위해 희석하십시오.
BCIP/NBTBio-Rad 생명과학170-6432빛으로부터 보호하십시오.

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