아프리카 트리파노좀의 글리코솜 역학은 전자 및 형광 현미경과 같은 전통적인 세포 생물학 기술로는 연구하기 어렵습니다. 동적 소기관 거동을 관찰하는 수단으로, 형광 소기관 리포터 시스템이 유세포 분석법과 함께 사용되어 살아있는 기생충의 실시간 배당체 역학을 모니터링했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
Trypanosoma brucei는 가축 일에, 인간의 아프리카 트리파노소마 증 (HAT) 또는 수면 질병 및 소모성 질환, nagana 원인 kinetoplastid 기생충이다. 포유류의 호스트의 혈류와 체체 파리 벡터 사이의 기생충 번갈아. 많은 세포 소기관의 구성은 서로 다른 세포 외 조건 2-5에 대한 응답으로 변경됩니다.
Glycosomes은 작용에 관여하는 효소의 많은 실형되는 고도로 전문화 페 록시이다. 개발과 환경 규제 방식 4-11 Glycosome 구성이 변경됩니다. 현재 glycosome 역학을 연구하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 기술은 전자와 형광 현미경 아르; 비싸고, 시간과 노동 집약적 및 고 처리량 분석에 쉽게 적응하지 않은 방법.
이러한 제한, 형광등 glycosome 기자 시스템을 극복하기 위해12 glycosomes하는 융합 단백질을 지시하는 퍼 옥시 대상 시퀀스 (PTS2)에 융합되는 노란색 형광 단백질 (EYFP)를 강화하는 설립되었습니다. PTS2eYFP 융합 단백질의 수입시에, glycosomes 형광된다. 소기관 저하 및 유동 세포 계측법에 의해 측정 될 수있는 형광 손실 재활용 결과. 셀은 다수의 (5000 세포 / 초)와 같은 고정 및 장착으로 광범위한 샘플 준비없이 실시간으로 분석 할 수있다. 이 방법은 환경 조건의 변동에 응답하여 소기관 조성의 변화를 검출 신속한 방법을 제공한다.
서론
Trypanosoma brucei 소 아프리카 인간 수면병 및 소모성 질환, nagana을 발생합니다. 이들 질환의 치료에 사용되는 약물은 백신을 사용할 수없는, 낡은 매우 독성이며, 약제 내성의 개발을위한 잠재적 인 신규 한 약물 표적에 대한 검색을 필요로한다.
수명주기, T. 중 brucei, 곤충 벡터와 포유류의 호스트 번갈아; 기생충이 생존해야하는 매우 다른 환경을 제시 두 호스트. 기생충이 상이한 환경 조건에 노출되는 형태로 대사 및 변경이 발생할 수. 가장 극적인 변화 중 일부는 단일 막 경계 기생충 특정 microbodies에서 관찰되고, glycosomes 13 불린다.
포도당 수준이 상대적으로 높은 아르 (~ 5 mM)을 혈류와 혈류 기생충 (BSF)의 작용도 ë 통해 독점적으로 ATP를 생성ILE 미토콘드리아 대사는 14을 억압한다. 다른 진핵 달리하는 작용은 세포질에서 발생 T. brucei는 glycosomes (14, 15)에서 당분 해 효소의 대부분을 compartmentalizes. 기생충은 bloodmeal 동안 체체 ....
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프로토콜
1 일반 Trypanosome 축산
- SDM79 미디어 준비 (표 1)에 대한 고체의 무게를 측정.
- 4 50 ML 원뿔에서 °의 C 또는 지퍼락 백에 보관하십시오. 참고 : 시약 6 개월 이상 안정적이다.
- 해동 소 태아 37 ° C의 수조에서 혈청 (FBS), 그리고 반전에 의해 주기적으로 섞는다. 참고 : FBS는 멸균 솔루션으로 공급 업체에서 수신된다. FBS 살균 필터 기생충의 성장을 지원하는 능력을 감소시킨다.
- 전체 병 해동되면, 열은 혈청 성분의 석출을 최소화하기 위해 주기적으로 혼합, 56 ° C의 수조에 30 분 동안 혈청을 비활성화한다.
- 해동 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액 (펜 / 연쇄상 구균), 헤민 (50 mM의 수산화 나트륨 2 ㎎ / ㎖) 및 실온에서 기본 배지 독수리 비타민 솔루션입니다.
- 1,000 ml의 눈금 실린더에, 액체 성분 (표 2)에 SDM79 고체 (표 1) 20.2 g을 추가하고 저어 접시에 잘 섞는다.
- 7.35로 산도를 조정하고, 물을 850 ml의 볼륨을 가지고.
- 필터는 필터 병의 바닥에 진공 호스를 연결하여 미디어....
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결과
이 시스템에서, glycosome 조성물 글루코스 의존적 변화가 관찰되었다. 세포가 포도당 함유 미디어에서 재배 될 때,이 인구가 관찰된다; 한 밝고 한 희미한 (그림 2A). 희미한 세포는 밝은 세포가 성숙하고 미성숙 glycosomes (12)의 혼합물을 항구 동안 PTS2eYFP을 가져 오지 않은 미숙 glycosomes를 항구. 포도당 미디어에 존재하는 경우, glycosome 단백질의 mislocalization는 15,28 치명적이고 glycosome 단백질 발현 가능성이 수입과 밀접하게 연결되어있다. 이 꽉 규제 세포 충분한 수입 능력 부족시 glycosome 단백질 발현이 억제 된 세포의 희미한 외관 담당한다. glycosome 수입 기계가 완벽하게 조립 및 작동되면, 세포는 형광 세포를 산출 glycosomes로 가져 glycosome 단백질을 표현한다. 포도당 고갈 미디어에서 glycosome 단백질의 mislocalization은 허용.......
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토론
Glycosomes은 필수, 동적, 기생충 특정 세포 기관이다. 이러한 세포 소기관의 생합성, 유지 보수, 증식과 리모델링을 조절하는 과정은 가능성이 치료 목적으로 악용 될 수 약물 표적을 포함한다. 이러한 약물 표적의 가능성이 높은 풍부 불구 glycosome 생합성의 필드는 주로 급격한 동적, 소기관 반응을 모니터링하는 다루기 쉬운, 높은 스루풋 시스템의 부족으로, 다른 유기체와 유사한 프로세스를 연구 뒤쳐 살아있는 세포에서.
형광등 - 세포 소기관 기자 시스템은 효모, 식물, 곰팡이와 포유류 23 ~ 25로 높은 진핵 생물의 세포 기관의 역학을 연구하는 데 사용되었다. 우리는 형광 세포 기관을 산출 glycosomes 성숙을 대상으로 PTS2eYFP을 표현 PCF 기생충의 유전자 변형을 생성 한. glycosome 조성의 변화는 다음과 같은 세포의 형광을 통해 모니터링 할 수 있습니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 특히 글루코스 환경 조건, glyc.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 학부 연구를 위한 창의적 탐구 프로그램(Creative Inquiry Program for Undergraduate Research)과 클렘슨 대학교(Clemson University)의 칼훈 아너스 칼리지(Calhoun Honors College)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아데노신 | 아보카도 연구 화학 물질 회사 | A10781 | SDM79 성분 |
| L-알라닌 | 아보카도 연구 화학 물질 주식 회사 | A15804 | SDM79 성분 |
| L-아르기닌 | CalBiochem | 1820 | SDM79 성분 |
| p-아미노 벤조산 | ICN Biomedicals | 102569 | SDM79 성분 |
| 기초 매체 독수리 비타민 용액 (100x) | 시그마 | B6891 | SDM79 성분 |
| 비오틴 | 피셔 | BP232-1 | SDM79 성분 |
| 염화칼슘 | VWR | BDH0224 | Cytomix |
| EDTA | 피셔 | S311-100 | Cytomix 성분 |
| EZNA 젤 추출 키트 | 오메가 Biotek | D2500-01 | DNA 정제 |
| 연구 학년 혈청 | 피셔 | 03-600-511 | SDM79 성분 |
| 엽산 | ICN Biomedicals | 101725 | SDM79 성분 |
| 글루코사민 HCl | ICN Biomedicals | 194671 | SDM79 성분 |
| 포도당 | GIBCO | 15023-021 | SDM79 성분 |
| L-글루타민 | CalBiochem | 3520 | SDM79 성분 |
| 글리세롤 | Acros 유기물 | Ac15892-0010 | 냉동 매체 |
| 그레이스 곤충 세포 매체 분말 | GIBCO | 11300-043 | SDM79 성분 |
| Hemin | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 성분 |
| 구아노신 | 아보카도 Research Chemicals Ltd | A11328 | SDM79 성분 |
| HEPES | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 성분 |
| 마그네슘 | Fisher | BP214-500 | Cytomix 성분 |
| L-메티오닌 | Fisher | BP388-100 | SDM79 성분 |
| MEM 아미노산 (50x) | Cellgro | 25-030-CI | SDM79 성분 |
| NEAA 혼합물 (100x) | Lonza | 13-114E | SDM79 성분 |
| 최소 필수 매체 (1x) with L-glutamine | Cellgro | 10-010-CM | SDM79 성분 |
| MOPS | Fisher | BP308-500 | SDM79 성분 |
| 바이오 탄산 나트륨 | Fisher | S233-500 | SDM79 성분 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 | Cellgro | 30-002-CI | SDM79 성분 |
| L- 페닐알라닌 | ICN Biomedicals | 102623 | SDM79 성분 |
| 염화칼 | Fisher | P217-500 | Cytomix 성분 |
| 인산 칼륨, 이염기성 무수 | Fisheer | P290-212 | Cytomix 성분 |
| : L-Proline | Fisher | BP392-100 | SDM79 성분 |
| : L-Serine | Acros Organics | 56-45-1 | SDM79 성분 |
| : Pyruvic acid, sodium salt | Acros | Organics 113-24-6 | SDM79 성분 |
| : L- 타우린 | TCI America | A0295 | SDM79 성분 |
| L-Threonine | Acros Organics | 72-19-5 | SDM79 성분 |
| L-티로신 | ICN Biomedicals | 103183 | SDM79 성분 |
| E.Z.N.A. 사이클 퓨어 키트 | Omega Biotek | D6492-02 | DNA 정제 |
| 결합 완충액 | Omega Biotek | PDR041 | DNA 정제 |
| SPW 세척 완충기 | Omega Biotek | PDR045 | DNA 정제 |
| 유전자 펄서 Xcell | Biorad | 165-2660 | 트리파노솜 변환 |
| 4mm 전기천공법 큐벳 | VWR | 트리파노솜 변환 |
참고문헌
- Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
- Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei.
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