단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부

요약

이 연구 결과는 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 이중 가닥 DNA의 반복 역학을 측정하는 상세한 실험 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 J 인자라는 반복 확률 밀도를 추출하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

이중 가닥 DNA (dsDNA)의 굽힘은 DNA와 단백질의 인식과 뉴 클레오에 DNA 포장과 같은 많은 중요한 생물 학적 과정과 연관되어 있습니다. dsDNA 굽힘의 열역학은 공유 dsDNA의 짧은 끈적 끝을 가입 DNA 리가 아제에 의존하는 방법이라는 고리 화 반응에 의해 연구되고있다. 그러나, 결찰 효율 등의 DNA 결합 끈적 단부를 둘러싸는 구조, 및 연결 효소로 반복 dsDNA 관련되지 않은 많은 요인에 의해 영향을받을 수있다 또한 비특이적 결합과 같은 메커니즘을 통해 명백 반복 레이트에 영향을 미칠 수있다. 여기, 우리는 FRET (형광 공명 에너지 이동)에 의하여 과도 DNA 루프 형성을 감지하여 리가없는 dsDNA의 반복 반응 속도를 측정하는 방법을 보여줍니다. dsDNA 분자 FRET 쌍과 비오틴 링커 간단한 PCR 기반 프로토콜을 사용하여 구성됩니다. J 인자로 알려진 루핑 확률 밀도 두 disconnec 사이 반복 속도와 어닐 레이트로부터 추출테드 스티커 끝. 다른 고유 곡률 두 dsDNAs을 테스트함으로써, 우리는 J 계수가 dsDNA의 고유 형상에 민감하다는 것을 보여줍니다.

서론

dsDNA의 기계적 특성을 이해하는 것은 기초 과학 및 공학 응용 프로그램에서 기본 중요하다. 연속적인 염기쌍 사이의 롤, 상하 이동 및 비틀림 각 시퀀스에 따라 달라질 수 있기 때문에 dsDNA의 구조는 직선 나선형 사다리보다 더 복잡합니다. 열 변동은 dsDNA는, 굽힘 비틀림과 스트레칭 등의 구조적 변동의 다양한 모드를 받아야하는 원인이 될 수 있습니다. 이러한 용융 및 꼬임으로 전환은 극단적 인 조건에서 발생할 수 있습니다.

이러한 움직임 가운데, dsDNA의 굴곡이 가장 눈에 띄는 생물에 미치는 영향 ^{1 있습니다.} dsDNA 구부리는 서로 가까운 두 먼 사이트를 가져와 유전자 억제 또는 활성화와 연결되어 있습니다. 또한 DNA를 세포 핵 내부의 포장 또는 바이러스 캡시드에 중요한 역할을한다. dsDNA의 굴곡 변형은 고해상도 현미경 (AFM ² TEM ^3), 및 thermodyn에 의해 실험적으로 시각화 할 수 있습니다amics과 반응 속도는 화학적으로 dsDNA의 병렬 사이트를 링크 반복 분석에 의해 연구 될 수있다.

하나의 분석은 리가에 의존하는 고리 화 ^4입니다. 이 분석에서 '끈적 끈적한....

프로토콜

1. dsDNA 샘플 준비

1. 10 메르 순서를 반복하여 전 세계적으로 곡선의 DNA를 디자인합니다. 예를 들어, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) ₇ - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 '는 186-BP 곡선 X는 임의의 추가 자료입니다 DNA와 반복 10 메르 순서를 측면에서는 순서가 어댑터 시퀀스입니다이다.
   참고 :.이 예에서 카플란 등으로 대규모 뉴 클레오 점유율 조사 결과를 기반으로 뉴 클레오 솜 형성에 반대 환경과 2 개의 10-MERS ^15이 선택되었다. dsDNA의 나선형 반복 10 BP 부근에 있기 때문에, 10 - 머의 나선 축의 순 편향은 원호 (그림 3A)와 같은 모양을 생산하기 위해 축적됩니다. 헬리컬 기간 10.5 BP에 접근하기 때문에, 여분의 염기는 가능한 한 평면으로 만곡 구조를 유지하기 위해 매 2 반복 후에 삽입된다. 200 BP보다 짧은이 시퀀스는 대기업에서 주문할 수 있습니다의 그 제안의 유전자 합성 서비스를 제공합니다. 그것은 다음 단계에 대한 일반적인 어댑터 시퀀스 이러한 시퀀스를 측....

결과

반복 연구에 사용되는 DNA 분자는 변수 순서와 길이와 서로 보완적인 단일 가닥 오버행의 이중 지역으로 구성되어 있습니다. 7 -베이스 긴 오버행은, 루프 형의 상태를 캡처하기 위해 서로에 어닐링 할 수있다. 각 오버행 아미 다이 화학을 통해 DNA 백본에 연결되어를 Cy3 또는 Cy5에 하나가 포함되어 있습니다. Cy5에 오버행은 표면 고정화 (그림 4A 참조) 비오틴 - TEG (15 원자 테트라 에틸렌 글리콜 스페이서)와 연결되어있다. 이러한 모든 수정은 PCR-기반 프로토콜 (프로토콜 1 및도 3b) 다음 dsDNA에 혼입 될 수있다. 오버행의 선택의 길이와 순서는 일반 실험 조건에서 검출 뒤집을 FRET 이벤트를 생산하기 위해 잘 작동합니다. 루핑 및 DNA 루프 unlooping 속도론은 주위 온도에 민감하기 때문에, 온도 제어기는 재현성이 필수적이다. 이러한 관제사뮬러 용이 현미경 (도 2)에 혼입 될 수있다.

토론

FRET 기반으로 간단한 단일 분자 분석은 서로 다른 고유 한 모양의 DNA를 루프의 속도를 연구하는 데 사용되었다. 곡선 DNA를 10.5 BP의 헬리컬주기 위상이 10 - 머 서열을 반복함으로써 제조 할 수 있고, 그 곡률 PAGE를 이용하여 추정 될 수있다. 이 dsDNAs 과도 루프 안정화 할 수 있도록 스티커 끝으로 설계되어 있습니다. 우리는 시간이 지남에 따라 반복 분자의 수의 지수 상승에서 반복 속도를 추출. 끊어진 점착 말단 분절 사이 어닐링 속도 상수는 J 인자로 알려진 루핑 확률 밀도의 농도 당량을 결정하기 위해 사용된다.

리가 아제 기반 DNA 환화 검정법에서 DNA 마감 확률 측정 리가 제의 농도에 민감하고, 리가 아제는 ⁹ 과도한 경우 J 팩터는 과대 평가 될 수있다. DNA를 DNA 리가 아제의 비특이적 결합은 루프 ^{(10)에 영향을} 미칠 수있다. 또한, ligas전자 활동은 소금에 따라 시간이 지남에 붕괴. 그.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Small DNA FRAG 추출물 키트-100PR	VWR	97060-558
아크릴아미드 40% 용액 500ml	VWR	97064-522
비스-아크릴아미드 2%(w/v) 용액 500ml	VWR	97063-948
GeneRuler 100bp DNA 사다리, 100-1,000bp	발효	SM0241
미니 수직 PAGE 시스템	VWR	89032-300
주사기 필터 0.2 μ m CS50	VWR	A2666
Trolox	Sigma-Aldrich	238813-1G	삼중 항 상태 소광제
Protocatechuic acid (PCA)	Sigma-Aldrich	08992-50MG	산소 소거
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	산소 소기 시스템
mPEG-silane, MW 2,000 1 g	Laysan Bio	MPEG-SIL-2000-1g
비오틴-PEG-실란, MW 3,400	Laysan Bio	비오틴-PEG-SIL-3400-1g
Avidin, NeutrAvidin 비오틴 결합 단백질	Invitrogen	A2666
Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	F-540L
Gel/PCR DNA Fragments 추출 키트	IBI Scientific	IB47020
프리미엄 일반 유리 현미경 슬라이드	Fisher	Scientific 12-544-1
VWR 마이크로 커버 유리, 직사각형, no. 1	VWR	48404-456
Fisher Scientific Isotemp 1006S 순환 냉각기/히터	Fisher Scientific		온도 제어
Objective Cooling Collar	Bioptechs	150303	온도 제어
KMI53 Biological 마이크로미터 측정 단계	Semprex	KMI53
고성능 DPSS 레이저 532 nm 50 mW	Edmund optics	NT66-968	Cy3 excitation
CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector	Coherent	1139604	Cy5 excitation
650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter	Semrock	FF650-Di01-25x36	splitting dichroic
LaserMUX 빔 결합기, 514.5, 532 및 반사 543.5 nm 레이저, 25 mm	Semrock	LM01-552-25	결합 이색성
Brightline 형광 필터 593/40	Semrock	FF01-593/40-25	Cy3 방출 필터
635 nm EdgeBasic LWP 장역 통과 필터, 25 mm	Semrock	BLP01-635R-25	Cy5 방출 필터
EMCCD iXon+	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
IX51 도립 현미경 프레임	Olympus
Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF	Olympus
Immersion oil type-F for fluorescence microscopy	Olympus	IMMOIL-F30CC
2 mm 직경 45° 로드 렌즈 알루미늄 코팅	Edmund optics	54-092	미니어처 미러
1/4" 여행용 단축 번역 스테이지	Thorlabs	MS-1	미니어처 미러
Oslash 번역; 1" 무채색 이중, ARC: 400-700 nm, f=200 mm	Thorlabs	AC254-200-A	초점 렌즈
조절 가능한 기계식 슬릿	Thorlabs	VA100
유전체 미러	Thorlabs	BB1-E02
Ø 1" 무채색 더블릿, f = 100 mm	Thorlabs	AC254-100-A	릴레이 렌즈
렌즈 마운트 Ø용; 1" 광학	Thorlabs	LMR1
다이크로익 필터 마운트	Thorlabs	FFM1
고정 케이지 큐브 플랫폼	Thorlabs	B3C
Kinematic Mount for Ø 1" 광학	Thorlabs	KM100
N-BK7 플라노-볼록 렌즈, Ø 1", f = 40 mm	Thorlabs	LA1422-A	콜리메이팅 렌즈
N-BK7 플라노-볼록 렌즈, Ø 6.0 mm, f = 15 mm	Thorlabs	LA1222-A	망원경 렌즈
N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø 6.0mm, f = 150mm	Thorlabs	LA1433-A	망원경 렌즈

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