방법 논문

주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

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DOI:

10.3791/51679

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2014년 8월 1일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, 2Center for Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Center for Virology and School of Biological Sciences, University of Nebraska, Lincoln

이 논문에서

요약

주요 조직 적합성 복합체 클래스 II dextramers 직접 염색으로 뇌와 심장 자기 반응성 CD4 T 세포를 감지하는 프로토콜은이 보고서에 설명되어 있습니다. 종합적인 분석을 위해, 시츄 항원 특이 CD4 + T 세포의 빈도를 열거하는 신뢰할 수있는 방법도 고안되어있다.

초록

이 보고서는 SJL 마우스에서 미엘린 단백질지질 단백질(PLP) 139-151 유도 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 및 A/J 마우스에서 심장 미오신 중쇄α(Myhc) 334-352 유도 실험적 자가면역 심근염(EAM)에서 자가반응성 CD4 T 세포를 제자리에서 검출하기 위한 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II 덱스트러머의 사용을 보여줍니다. 두 세트의 덱스트러머 시약 칵테일을 사용하여 덱스트러머+ 세포를 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경(LSCM)으로 분석했습니다: EAE, IAs/PLP 139-151 덱스트머(특이)/항-CD4 및 IAs/Theiler의 쥐 뇌척수염 바이러스(TMEV) 70-86 덱스트머(대조군)/항-CD4; 및 EAM, IAk/Myhc 334-352 덱스트롤러/항-CD4 및 IAk/소 리보뉴클레아제(RNase) 43-56 덱스트라체(대조군)/항-CD4. EAE 마우스에서 얻은 뇌 절편에 대한 LSCM 분석은 CD4 및 PLP 139-151 덱스트러머에 대해 양성 세포의 존재를 보여주었지만 TMEV 70-86 덱스트러머에는 양성 세포가 존재하지 않았으며, 이는 PLP 139-151 덱스트러머로 얻은 염색이 특이적임을 시사합니다. 마찬가지로, EAM 마우스에서 준비한 심장 절편에서도 Myhc 334-352의 존재가 밝혀졌지만 RNase 43-56-dextramer+ 세포는 예상대로 나타나지 않았습니다. 또한, 'Z' 연속 이미지에서 항원 특이적 CD4 T 세포의 빈도를 정량적으로 분석하기 위한 포괄적인 방법도 고안되었습니다.

서론

주요 조직 적합성 복합체의 사용은 항원 특이 CD4 T 세포의 검출 (MHC) 클래스 II 테트라 도전 1-7이었다. MHC 클래스 II 테트라의 검출 감도를 향상시키기 위해, 연구팀은 지정된 차세대 테트라, "dextramers"8을 만들었습니다. Dextramers는 여러 가지 펩타이드 닿는, 바이오틴 MHC 단량체 한 덱스 트란 분자 9에 부착 할 수있는 여러 스트렙 타비 딘 - 형광 부분이 접합되는 덱스 트란 등뼈가 포함되어 있습니다. 따라서, 몇개의 MHC-펩티드 복합체를 포함하는 MHC dextramers의 큰 응집체가 다수의 T 세포 수용체 (TCR도)와 상호 작용할 수있다.

이 그룹은 최근 다양한 자기 항원에 대한 dextramers을 생성 dextramers의 검출 감도가 약 테트라 8보다 5 배 정도였다. 실험 시스템은 실험자가 면역 뇌척수염을 포함 (EAE) 테오 단백질 (PLP) SJL 마우스에서 139-151로 유도; EAE는 수초 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG) C57BL / 6 마​​우스에서 35-55로 유도; 실험자가 면역 심근염 (EAM)는 심장 미오신 중쇄-α (Myhc) A / J 생쥐에서 334-352로 유도. 이 연구는 PLP 139-151의 사용을 보여 - 및 Myhc 334-352함으로써 형광 항체를 사용하여 신호를 증폭 할 필요가 없어, 직접 염색 프로토콜을 개발함으로써 특이 반응계에서 항원 특이 CD4 T 세포를 검출 dextramers 접근 일반적으로 테트라의 사용과 채택했다. 또, 조직을 평가하는 포괄적 인 방법은 또한 안정적 시츄 (10) 항원 특이 CD4 T 세포의 빈도를 열거 고안되었다. 시츄 항원 특이 T 세포의 검출 와키 활성화로 인한 것과 특정 항원 자극에 의해 유발 사건 묘사를 허용한다. 마찬가지로,있는 현장 기술도 제공하기대상 기관에 항원 특이 T 세포 침윤의 동역학을 추적하는 에스 기회.

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프로토콜

윤리 문 :

모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 실시 및 네브래스카 링컨, 링컨, 네브래스카의 대학에 의해 승인되었습니다.

EAE 1. 유도

  1. 단계 1.1 : EAE를 유도하기 위해, 다음의 수정 (11)에서 설명한 바와 같이 펩티드 / 완전 프로 인트 아쥬 반트 (CFA) 에멀션 제조. 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)의 1 ㎎ / ㎖의 농도에서 PLP 139-151 준비 단계 1.4 :. 동물 당 PLP 139-151의 100 μg을 포함 CFA 에멀젼 200 μl를 사용 1.4.1 단계 : 동물 10 마리를 예방 접종 1 PLP 139-151 ㎖의 (1 ㎎ / ㎖의 1X를 혼합하여 에멀젼 2 ㎖를 준비하는 . PBS)와 CFA의 같은 부피의 1.5 단계 : 두 서혜부 (~ 75 μL 각)과 5 ~-6 주짜리의 흉골 지역 (~ 50 μL)의 피하에 분할 복용 에멀젼 200 μl를 주입 FEMA르 SJL / J 마우스. 1.7 및 1.8 EAE의 유도를 위해 적용 할 수 없습니다 단계.

EAE 마우스와 대뇌의 수확 2. 임상 점수

  1. 임상 증상의 모양에 대한 동물을 모니터링하고, 다음 날 9 postimmunization 매일 질병 심각도 점수 : 0 - 건강; 1 - 꼬리 나 뒷다리의 약점 미약하지만 모두; 2 - 꼬리와 뒷다리의 약점 맥 빠진; 3 - 뒷다리의 부분 마비; 4 - 뒷다리의 완전한 마비; 5 - 죽어가는 혹은 죽은 12.
  2. 그들은 CO 2를 사용하여 3 또는 4의 신경 학적 점수에 도달했을 때 쥐를 안락사. 쥐를 안락사하기 위해,하지 6 PSI를 초과하는 CO 2 탱크의 조절기를 설정하여 CO 2를 먼저 안락사 챔버를 미리 기입 동물이 완료 질식을 달성하기 위해 약 5 분 동안 챔버 내에서 체류 할 수 있습니다. 70 % 알코올에 안락사 동물을 적신다. 즉, 흡수 패드에 동물을 배치하고 멸균의 쌍을 사용CEPS와 가위 흉강을 통해 절단에 의해 마음을 노출합니다. 오른쪽 귓바퀴에 구멍과 마음의 왼쪽 심실에 차가운 1X PBS 10 ㎖를 주입하여 perfuse.
  3. 곡선 가위를 사용하여 순환 적 두개골을 자르는하여 두개골을 발굴, 조심스럽게, 집게와 두개골 뼈를 플립. 해부를 둔 깨끗한 메스, 소뇌에서 별도의 대뇌를 사용하여 두뇌를 수확. 차가운 1X PBS가 들어있는 튜브에 뇌를 놓고 처리 될 때까지 얼음에 튜브를 둡니다.

3. MHC 클래스 II (IA들) / PLP 139-151 Dextramers와 대뇌 섹션의 제자리 염색법에

  1. 4 %는 PBS 버퍼 저 융점 아가 로스, 50 ° C에서 가열하여 용융 사용할 때까지 40 ° C의 물을 욕조에두고 준비합니다.
  2. 처분 할 수있는 깊은베이스 금형 조직학 카세트의 뇌를 놓고 얼음 위에 보관 및 용융 (40 ° C) 아가로 오스를 붓는다. 즉시 부드럽게 뇌를 눌러집게는 조직을 잠수함으로. 응고가 완료 될 때까지 15 ~ 20 분 동안 얼음에 카세트를 남겨주세요.
  3. 냉장 1X PBS로 vibratome 목욕을 입력합니다. 0과 2 사이의 PBS의 온도를 유지하기 위해 얼음 조각으로 vibratome 화장실 주위의 공간을 채우기 ° C. vibratome에 깨끗한 면도날을 수정하고 15 °로 블레이드 각도를 설정합니다.
  4. vibratome에있는 조직의 위치. 포함 된 조직의 모든 측면에서 초과 아가로 오스를 정돈하고 약간 대뇌의 복부 표면을 노출.
    1. 최고 접착제와 vibratome 조직 블록을 바르고 가로 단면의 접착제를 통해 대뇌의 노출 된 복부 표면을 배치하여 접착면에 아가로 오스 - 임베디드 조직을 전송합니다. 조직이 블록에 설정되면, 조직을 이동하지 마십시오.
    2. 얼음에 아가로 오스 - 임베디드 조직을 포함하는 vibratome 블록을 배치하고, 접착제가 15 분 동안 건조 할 수 있습니다.
  5. 한편, 티슈 참 배치24 - 웰 플레이트의 웰 당 하나를 BERS. 차가운 1X PBS 1 ㎖와 조직 챔버를 포함하는 우물을 입력하고 얼음에 플레이트를 둡니다.
    1. 얇은 나일론 최고 접착제를 사용하여 25 ㎖ 폴리 프로필렌 피펫의 절단 단부에 부착하여 메쉬 조직 실 준비; 피펫의 주위에 여분의 메쉬를 트리밍 한 후, 메쉬 1 cm의 길이로 피펫을 잘라.
  6. 조직의 상부면의 레벨까지 vibratome 블레이드를 내리고; 0.22 mm / 초에 vibratome 속도를 설정하고 200 μm의 두께 부분을 만들기 위해 전진과 절편 시작합니다. 잘 24 - 웰 플레이트의 우물 내에 배치 조직 챔버에 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 당 하나의 뇌 부분을 전송합니다. 절편은 조직의 저하를 방지하기 위해 완료 될 때까지 얼음에 플레이트를 유지합니다. 참고 : 복부 표면에 뇌 등의 세 가지 영역 (그림 2)에서 총 세 쌍 절에서 획득하려면 다음 단계를 수행합니다. 에서 하나의 섹션세 개의 개별 조직의 챔버에 배치 (총 세 부분에서) 각 쌍은 특정 dextramers로 염색을 위해 지정된 (IA S / PLP 139-151) 및 안티 CD4됩니다. 마찬가지로, 세 개의 개별 조직의 챔버에 배치됩니다 세 부분의 또 다른 세트는 제어 dextramers로 염색을 위해 지정된다 (IA S / TMEV 70 ~ 86) 및 안티 CD4.
  7. 하나의 챔버와 24 - 웰 플레이트에 세 우물에 특정 dextramers로 염색마다 잘 대해 지정된 섹션을 포함하는 세 가지 조직 챔버를 전송하는, 알로 피코를 포함하는 칵테일의 300 μL (APC) - 복합 PLP 139-151 dextramers (2.5 ㎍ / ㎖) 및 안티 CD4-피코 에리 트린 (PE,) 2 % 정상 염소 혈청과 솔루션 (1X PBS를 차단하는 / ㎖ 5 μg)은 이전에 추가했다. 뚜껑 우물을 커버.
  8. 마찬가지로, 우리 당 하나의 챔버와 24 웰 플레이트에 세 우물에 제어 dextramers로 염색을 위해 지정된 섹션을 포함하는 세 가지 조직 챔버를 전송LL하는, APC-공액 TMEV 70 ~ 86 dextramers (2.5 ㎍ / ㎖) 솔루션을 차단하는 안티 - CD4-PE (5 ㎍ / ㎖)이 포함 된 칵테일의 300 μL는 이전에 추가되었습니다. 뚜껑 우물을 커버. 참고 : Massilamany 참조 등 8 dextramers의 준비 및 dextramers이 친절하게 Immudex, 코펜하겐, 덴마크에 의해 제공되었다 준비하는 덱스 트란 분자..
  9. 우물을 레이블 및 알루미늄 호일로 접시를 포장하고 실온에서 어둠 속에서 1.5 시간 동안 부드러운 회전으로 ​​설정 흔들 플랫폼에서 접시를 놓습니다.
  10. 잠복기 후, 잘 차가운 1X PBS 1 ㎖를 포함하는 신선한에 조직 챔버를 전송하여, 락을 플랫폼에서 조직 섹션을 씻어 아니라 다른에 하나의 내용을 드리블하지 마십시오. 세척 당 적어도 10 분을 허용, 세 번 세탁을 반복합니다. 그들은 챔버의 측면에 충실 수있는 조직 섹션이 건조되지 않도록해야합니다.
  11. 조직 참를 전송하여 섹션을 수정부드러운 회전과 2 시간 동안 락을 플랫폼에서 필터링 4 % PBS 버퍼 파라 포름 알데히드 (산도 7.4) 1 ㎖를 포함하는 24 - 웰 플레이트에 신선한 잘으로 BER들.
  12. 단계 3.10에 설명 된대로 세 번 세탁을 반복합니다.
  13. 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 깨끗한 현미경 슬라이드의 염색 및 고정 섹션을 배치합니다. 부분을​​ 건드리지 않고 여분의 수분을 닦아 설치 매체를 사용하여 섹션을 탑재합니다. 미세한 커버 슬립 커버 및 슬라이드 어두운 방에서 RT O / N에서 건조 할 수 있습니다.
  14. 4 ℃에서 빛을 방지 슬라이드 저장 상자에서 슬라이드를 저장

마음의 EAM 및 컬렉션 4. 유도

  1. 참고 11에 설명 된대로 EAM을 유도한다.
  2. CO 2 가스 실린더가 장착되어 깨끗한 실을 사용하여 21 일 postimmunization에 쥐를 안락사, 70 % 알코올에 동물을 적신다. 즉시 흡수 패드에 동물을 배치하고 집게와 가위를 사용하여 심장을 노출흉강을 통해 절단하여의. 오른쪽 귓바퀴에 구멍과 마음의 왼쪽 심실에 차가운 1X PBS 10 ㎖를 주입하여 perfuse. 차가운 1X PBS가 들어있는 튜브에 하트와 장소를 수집합니다.

5. MHC 클래스 II (IA 케이) / Myhc 334-352 Dextramers 심장 섹션의 제자리 염색법에

  1. 준비 4 % 저 융점 아가 로스, 50 ° C에서 가열 용융 (40)에 남겨 PBS 버퍼   사용할 때까지 C 물 목욕 °.
  2. 얼음에 보관 일회용 깊은베이스 금형 조직학 카세트에 마음을 놓고 단계 3.2에 설명 된대로 조직이 완전히 침수 될 때까지 용융 아가로 오스 40 ° C를 붓는다.
  3. 3.3 단계를 따릅니다.
  4. 포함 된 조직의 모든 측면에서 초과 아가로 오스를 정돈하고 약간 마음의 기반을 노출합니다. 최고 접착제와 vibratome 조직 블록을 도말의 노출면을 배치하여 접착 표면 아가 매립 조직을 전송할접착제 위에 심장. 조직이 블록에 설정되면, 조직을 이동하지 마십시오.
    1. 얼음에 아가로 오스 - 임베디드 조직을 포함하는 vibratome 블록을 배치하고, 접착제가 15 분 동안 건조 할 수 있습니다.
  5. 단계 3.5 및 3.6을 따르십시오.
  6. 24 웰 플레이트의 우물 내에 배치 된 조직 챔버에 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 심장 섹션을 전송합니다. 절편은 조직의 저하를 방지하기 위해 완료 될 때까지 얼음에 플레이트를 유지합니다. 참고 : 마음의베이스 정점에서 여덟 쌍 섹션 (그림 2) 총 취득하려면 다음 단계를 수행하십시오. 실 당 3 절까지 할당, 조직 챔버의 모든 섹션을 배치합니다. (총 여덟 섹션) 각 쌍에서 하나의 섹션은 특정 dextramers (IA K / Myhc 334-352) 및 안티 CD4로 염색을 위해 지정되어있다. 마찬가지로, 팔 부분의 또 다른 세트는 제어 dextramers (IA K / RNA 분해 효소 43-56) 및 안티 CD4로 염색을 위해 지정되어있다.
  7. 이동잘 당 하나의 챔버와 24 - 웰 플레이트에있는 세 개의 우물에 특정 dextramers로 염색을 위해 지정된 섹션을 포함하는 세 조직 챔버하는 300 APC-공액 Myhc 334-352 dextramers (2.5 ㎍ / ㎖)이 포함 된 칵테일 μL와 솔루션을 차단하는 안티 - CD4-PE (5 ㎍ / ㎖)을 이전에 추가했다. 뚜껑 우물을 커버.
    1. 이와 유사하게, 잘 당 하나의 챔버와 24 - 웰 플레이트에 세 우물에 제어 dextramers로 염색을 위해 지정된 섹션을 포함하는 세 가지 조직 챔버를 전송하는, 43-56 dextramers (2.5 μg을 APC-공액 RNA 분해 효소를 포함하는 칵테일의 300 μL 차단 솔루션에 / ㎖) 및 안티 CD4-PE (5 ㎍ / ㎖)을 이전에 추가했다. 뚜껑 우물을 커버.
  8. 우물을 레이블 및 알루미늄 호일로 접시를 포장하고 실온에서 어둠 속에서 1.5 시간 동안 부드러운 회전으로 ​​설정 흔들 플랫폼에서 접시를 놓습니다.
  9. 단, 3.10 3.11에 따라
  10. 반복 세탁 THR단계 3.10에 설명 된대로 얼음.
  11. 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 깨끗한 현미경 슬라이드의 염색 고정 섹션 (최대 세 개의 섹션 / 슬라이드)를 놓습니다. 섹션을 건드리지 않고 여분의 수분을 닦아 설치 매체를 사용하여 섹션을 탑재합니다. 미세한 커버 슬립 커버 및 슬라이드 어두운 방에서 RT O / N에서 건조 할 수 있습니다.
  12. 4에서 광 증거 슬라이드 수납 박스에 슬라이드를 보관 ° C.

6. Dextramer +의 분석 (두뇌와 심장 섹션 모두에 공통) 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (LSCM)에 의해 (DEXT +) CD4 + T 세포

  1. 일상적인 검사 및 이미지 수집을 위해 니콘 A1-이클립스 90I 공 초점 현미경 시스템을 사용합니다. 시작하려면 열기, NIS 요소 AR 소프트웨어 (버전 4.13).
    1. "TRITC"와 패널에서 "Cy5에"채널을 선택합니다. TRITC 및 Cy5의 채널에 대한 각각의 여기 / 발광 파장 561.5 ㎚ / 553-618 nm의 기본적으로 표시 nm의 640.7 ㎚ / 663-738.
    2. 각각 TRITC (CD4-PE)와 Cy5에 (dextramer-APC) 채널에 대한 pseudocolors "녹색"과 "빨강"을 지정합니다.
    3. 현미경 단계에 검사 할 슬라이드를 놓고 100 배 배율에서 수동으로 초점을 맞 춥니 다. (110)에 "HV"을 설정하고 "0"으로 오프셋 (offset). "포커스"를 클릭하고 레이저를 최적화하기 위해 "전압"을 조정한다.
    4. "포커스"를 클릭; 위에서 아래로 섹션을 스캔 및 이미지 획득을위한 'Z'레벨을 설정합니다. "CH 시리즈"를 클릭하여 이미지를 순차적으로 취득. DEXT를 확인 + CD4 + T 세포는 적색 (dextramers)과 녹색 (CD4) 채널 모두에서 생성 된 신호의 공동 현지화를 기반으로 노란색 반점이있는 세포를 게재.
  2. DEXT + CD4 + T 세포의 쉬운 양적 열거 올림푸스 FV500-BX60 공 초점 현미경을 사용합니다. 시작하려면열기를 클릭, FLUOVIEW 소프트웨어 (버전 4.3).
    1. 드롭 다운 메뉴에서 염료 "를 Cy3"와 "Cy5에"를 선택하고, 각각의 레이저를로드하려면 "적용"을 클릭합니다. 참고 : Cy3에 대한 여기 / 방출 파장 (543 ㎚ / "녹색"모조 착색, CD4-PE)와 Cy5에 (633 ㎚ / "빨간색"모조 착색, dextramer-APC) 채널을.
    2. 현미경 슬라이드를 검사 할 슬라이드를 놓고 낮은 배율 (배 또는 10 배)에서 수동으로 초점을 맞 춥니 다. Cy3에 레이저가 켜져있는 동안 "포커스"를 클릭하고, 염증 초점 초점을 맞 춥니 다.
    3. 100 배의 배율로 목적을 변경합니다. 드롭 다운 메뉴에서를 "512분의 512"파일 크기를 설정합니다. "포커스"를 클릭하고 "PMT", "이익"의 값을 조정하고를 Cy3와 Cy5에 대해 개별적으로 레이저를 최적화하기 위해 매개 변수를 "오프셋".
    4. "Z 단계"를 클릭하고 레이저가 모두 켜져있는 동안 다음 "포커스"를 클릭합니다. 세트"위로"와 "아래"화살표를 클릭하여 "Z 스테이지"의 두께. 2 μm의 "Z"간격을 설정합니다.
    5. "중지"를 클릭하고 "Seq123"를 선택합니다. 그런 다음, "XYZ"버튼을 클릭 염증 초점 내에서 선택 영역에 대한 "Z"시리즈의 이미지를 획득 시작합니다. AVI 파일과 "Z 시리얼 이미지"를 저장합니다. 이미지 파일을 저장하려면 "Z 시리얼 이미지"에서 이미지를 선택한 후, "티파니"형식으로 저장합니다.
  3. 세 부분 중 하나 세트가 IA의 / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 및 IA의 / TMEV 70 ~ 86 dextramers/anti-CD4가 수행하는 세 가지 섹션의 다른 세트로 염색 된 뇌로부터 3 쌍 섹션을 검사 정량 분석​​.
    1. 이와 유사하게,하는, 여덟 섹션 중 하나 세트는 IA K / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 다른 자체로 염색 한, 심장 8 개의 쌍으로 섹션을 분석RNA 분해 효소 43-56 dextramers/anti-CD4 여덟 섹션의 t.
  4. 대뇌 섹션 당 10 ~ 15 염증성 병소를 검사하고, 각 초점, 15 25 시리얼 이미지를 순차적으로 세트를 취득.
    1. 마음의 8 개의 모든 부분에서 각각의 초점에서 20 염증성 병소의 총 검사는 순차적으로 10 ~ 15 시리얼 이미지를 수집. 같은 초점 내에서 'Z'시리즈의 반복을 피할 수 있도록 '수평 수직 최대 수평 - 수직 아래 운동에 슬라이드를 스캔하여'Z '일​​련의 이미지를 가져 가라.
    2. 'Z'연속 영상이 포착되면, 슬라이드 번호, 섹션 이름, 촬영 'Z'직렬 화상의 수를 파악하여 파일의 이름.
      1. CD4 + T 세포의 총수와 관련 DEXT + CD4 + T 세포를 계산하는 'ImageJ에'소프트웨어를 이용한다. ImageJ에 '의'카운터의 유형 '을 선택, 확인 및# 8216; 모두 표시 '및 각 셀의 중심을 클릭하여 계산을 시작하고 다른 계산에 계속'쪽 화살표를 사용하여 Z '시리얼 이미지. 모든 CD4 T 세포를 계산 한 후, 카운터의 다른 유형을 선택하고 + T 세포 CD4 + DEXT를 계산합니다. 두 개의 서로 다른 카운터로 계산 세포의 총 수를 얻을 수있는 결과 탭을 클릭합니다.
      2. 총 수를 획득하기 위해 모든 세 대뇌 섹션 또는 모두 팔 심장 섹션을 나타내는 모든 'Z'일련의 이미지 셀의 수를 추가한다.

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결과

이 보고서에서, MHC 클래스 II dextramers 직접 염색하여 항원 특이, 반응성 CD4 T 세포의 현장 검출에 설명되어 있습니다. 갓 잘라 뇌 섹션은 EAE 마우스에서 파생 된 (제어) dextramers 및 안티-CD4 (특정) 또는 TMEV 70 ~ 86 PLP 139-151을 포함하는 칵테일을 염색 하였다. 그림 1의 상단 패널은 이중 양성 세포가 노란색 등장 PLP 139-151 dextramers (빨강) 및 CD4 항체 (녹색)로 costained 대뇌 부분의 LSCM 분석을 보여줍니다. 이러한 기능은 TMEV 70 ~ 86 (제어) dextramers (아래 패널)와 스테인드 섹션에 결석했다. costained (DEXT + CD4 +) 세포 둘레 점상 점을 보여 주었다. 대뇌 섹션 PLP 특정 T 세포의 정량 분석은 다음의 단계 (도 2)를 포함 : 1) 3 켤레 섹션은 제하고, 각각의 쌍...

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토론

MHC 클래스 I 테트라와는 달리, 일상적인 응용 프로그램의 MHC 클래스 II 테트라의 사용은 특히 자신의 활성화 종속성 6,15-17에 부분적으로 인해 낮은 친화력자가 반응 CD4 T 세포의 전구체 주파수를 열거하는 도전되고 있습니다. 최근에,이 문제는 이러한 PLP 139-151, MOG 35-55과 Myhc 334으로자가 항원의 수를 항원 특이 CD4 T 세포를 감지하는 우리를 허용 ", dextramers"라고 사량의 다음 세대를 만들어 피할 수있었습니다 - (352) 8. 이 보고서에서, 처음으로, 현장에서자가 반응 CD4 T 세포를 감지하고 정량화하는 MHC 클래스 II dextramers의 유틸리티는 EAE 마우스에서 뇌 섹션 및 EAM 쥐에서 심장 섹션을 사용하여 증명되었다. 반응 기초 dextramers는 MHC / 펩티드 복합체의 양이 적은 이점을 제공한다. 이 프로토콜에서는, 각 반응은 0.75 μg MHC / 펩타이드 단량체가 필요...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않았습니다.

감사의 글

이 작품은 미국 심장 협회와 어린이의 심장 근육 병증 재단 (SDG2462390204001)과 국립 보건원 (HL114669)에 의해 지원되었다. CM은 심근염 재단, NJ에 의해 수여 박사 학위 취득 후 연구 활동 보조금의 수상자이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CFASigma Aldrich, St Louis, MO5881Store at 4 ° C
MTB  H37Rv 추출물 Difco Laboratories, Detroit, MI231141Store at 4 ° C
PT목록 Biologicals Laboratories, Campbell, CA181Store at 4 ° C
1x PBS Corning, Manassas, VA21-040-CVStore at 4 ° C
암컷 A/J 마우스 Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME646
Female SJL/J 마우스Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME686
Leur-lok sterile 1 ml syrringeBD, Franklin Lakes, NJ309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringeBD, Franklin Lakes, NJ309657
Sterile needle, 18 GBD, Franklin Lakes, NJ305195
멸균 바늘, 27 1/2 GBD, Franklin Lakes, NJ305109
3-방향 스톱콕 Smiths Medical ASD, Inc. 더블린, 오하이오MX5311L
Kerlix 거즈 붕대 롤 Covidien, Mansfield, MA6720
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical GradePromega corporation, Madison, WIV2111
Immunopure normal goat serumThermo Scientific, Waltham, MA31873-20 °에 저장;
C Anti-mouse CD4 conjugated with PE dyeeBioscience, San Diego, CA 120041854 °에 매장; C
파라포름알데히드전자 현미경 과학, Hatfield, PA19202Store at 4 ° C
Faramount 수성 장착 매체Dako, Carpinteria, CA10073021
원뿔형 튜브 (15 ml)BD Biosciences, San Jose, CA352099
원뿔형 튜브 (50 ml)BD Biosciences, San Jose, CA352070
24-well flat bottom tissue culture platesBD Biosciences, San Jose, CA356775
수채화 #2 브러쉬Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY73502
일반 현미경 슬라이드, 크기: 3" x 1" x 1.2mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA1255010
프리미엄 커버 유리, 22 x 22-1Fisher Scientific, Pittsburgh, PA12548B
일회용 딥 베이스 몰드 조직학 카세트실험실 prodcust, Rochester, NYM-475-10
록타이트 슈퍼 접착제Henkel Corporation, Westlake, OH1471879
면도날Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)Neopeptide, Cambridge, MAStore at 4 ° C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)네오펩타이드, Cambridge, MAStore at 4 ° C
MHC 클래스 II/IAs PLP 139-151 또는 APC 염료4 °에 저장; C
MHC 클래스 II/IAk Myhc 334-352 또는  또는 APC 염료Store at 4 ° C
Dextran 활용 SA-APCImmundex, 코펜하겐, DemarkStore at 4 ° C
멸균 수술용 가위와 집게INOX 도구 주식회사
마이크로 오븐GE 헬스케어, 피츠버그, PA
라이카 VT 1200 비브라톰라이카 마이크로시스템즈, Inc. 버팔로 그로브, 일리노이
올림푸스 BX 60  레이저 스캐닝 컨포칼 현미경Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i 컨포칼 현미경Nikon Inc. Melville, NY
와 결합된 TMEV 70-86 덱스트러머 와 결합된 RNase 40-56 dextramers

참고문헌

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