타액에서 DNA를 추출하면 분해/단편화가 거의 또는 전혀 없이 쉽게 구할 수 있는 고분자량 DNA를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜은 타액 채취/저장 및 DNA 추출을 위한 최적화된 매개변수를 제공하여 고품질 요구 사항을 가진 다운스트림 DNA 분석을 위한 충분한 품질과 양을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간 유전학 연구에서 선호되는 DNA 공급원은 혈액 또는 혈액에서 유래한 세포주이며, 이러한 공급원은 고품질의 DNA를 대량으로 생산하기 때문입니다. 그러나 타액에서 DNA를 추출하면 정맥 의사의 비용 없이 다양한 DNA 분석에 적합하고 우편을 통해서도 얻을 수 있는 분해/단편화가 거의 또는 전혀 없는 고품질 DNA를 얻을 수 있습니다. 그러나 현재 차세대 염기서열분석을 위한 타액 DNA 수집/추출 프로토콜은 문헌에 제시되어 있지 않습니다. 이 프로토콜은 타액 채취/저장 및 DNA 추출의 매개변수를 마이크로어레이 유전형 분석 및 차세대 염기서열분석을 포함한 최고 수준의 DNA 분석을 위한 충분한 품질과 양으로 최적화합니다.
서론
인간 유전 연구 고품질 DNA를 얻는 것은 질병 유전자 발견 프로세스에 필수적이다. 혈액, 타액 수집보다 더 비싼 또한 침략적인 절차를 요구하고 있지만, 기능 연구에 대한 무한 DNA의 소스 또는 iPSCs로 불후의 세포 라인을 만드는 선호하고, 세포주를 사용할 수없는 경우 때때로 혈액 DNA가 사용됩니다. 그러나, 혈액을 획득하는 훈련 된 phlebotomist을 필요로 피가 침 하나보다 짧은 반감기를 가지고있다. 그것을 수집함으로써 잘 병원 실험실 (2)의 집수 영역을 넘어 전위 피사체 풀을 증가 phlebotomist 필요없이 이메일을 통해 전송 될 수 있기 때문에 타액으로부터 DNA는 얻을 저렴하고 용이하다. 과목 대신 혈액 3, 4의 타액 샘플을 채취 할 수있는 옵션이있을 때 연구 등록이 개선 될 수있다. 수량과 타액에서 DNA의 질에 대한 우려는 우리가 널리 제한되어 있습니다타액 2, 3, 4, 5의 상당한 양을 구하는 않았다 이전 협측 면봉 방법을 통해 DNA 테스트에 대한 밀리리터 당 4.3 × 105 세포의 평균으로, 전체 타액의 적합성을 나타내는 수많은 연구 최근의 연구에도 불구하고, 즉, 6. 겸손한 문학 마이크로 어레이 기반 방식 팔을 포함하여....
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프로토콜
참고 : 이전 타액 샘플을 제공하기 위해 모든 주제는 전국 어린이 병원에서 사람을 대상으로 치료를위한 가이드 라인을 준수 동의를 통보했다.
1 타액 수집 및 저장
- 타액을 수집하기 전에 피사체의 입 피사체가 물로 입을 헹구어 갖는 식사를 피하거나 샘플을 수집하기 전에 30 분 동안 마시는 음식이나 이물질이 없는지 확인합니다.
- 캡 또는 튜브의 내부에 손이 닿지 않도록 확인하는 DNA 안정화 버퍼 (2) 2.5 ㎖로 15 ㎖의 원심 분리기 튜브를 열고 피사체가 완충 용액에 침 2.5 ㎖의 침이있다. 참고 : 타액의 이상 2.5 ml의 수집은 DNA 안정화 버퍼에 샘플의 부족 비율에서 샘플이 저하 될 수 있습니다. 너무 작은 타액을 수집하는 프로토콜에서 예상 수확량을 감소시킬 것이다. 컬렉션 볼륨을 평가하려면, t 측에 번호 그라디언트를 사용그는 튜브.
- 캡을 교체하고, 혼합물을 균질화 될 때까지 반전으로 섞는다. 격렬한 흔들림이 필요하지 않습니다. 단기 기억 또는 장기 저장을위한 4 ° C (> 3 개월)에 대한 RT에서 샘플을 보관합니다.
2 초기 준비 및 세포 용해
- 이전 추출을 시작으로, 37 ° C에 수조를 가열하고, 얼음....
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결과
DNA는 한 쌍의 DNA를 추출하는 일련의이 수행 된 추출을위한 최적의 매개 변수를 결정합니다. 하나의 타액 샘플을 분할하고 각 부분은 주어진 변수에 대한 두 가지 값 중 하나를 사용하여 테스트되었습니다. 각 쌍 테스트 적어도 8 회 반복 (예를 들어, 하나의 타액 샘플과 초기 50 ° C에서 배양없이 모두 추출을 테스트하기 위해 분주했다)을 시행 하였다. 총 DNA 수율, 280 분의 260 값 230분의 260 값과 분열을 평가하기 위해 전기 영동 DNA의 육안 검사 : 최적화는 네 표준 통계에 근거했다. 변수의 모든 가능한 조합을 개별적으로 각 변수의 한계 효과를 평가하기 위해 대신 사용 중단, (N = 169의 조합) 통계적인 상호 작용을 평가 하였다. 효과는 다중 방식보기 회 반복 측정 ANOVA를 사용하여 시험하였고, 예상 효과는 동등한 회귀 방정식으로부터 유도 하였다. 모든 중요한 효과는 단언로서 도시, 다음 표 1에 나타내었다수율 시대 변화 또는 DNA의 품질 (28.......
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토론
본 절차는 상당히 DNA의 품질을 손상시키지 않고, 표준 방법에 비해 고 분자량 DNA의 수율이 향상되었다 최적화 DNA 추출 프로토콜이다. 수율을 최대한에 가장 큰 효과 중요한 단계 널리 11을 배포하지 않은 일을 제외하고, 여기에서 검토 게시 된 프로토콜에 비해 에탄올 침전 동안 이상 원심 분리 단계를 포함하는 단계 5.2였다. 이 이상 원심 분리와 관련된 DNA 품질의 변경은 전체 타액 컬렉션에서 사용할 수있는 DNA의 대부분은 분자량 저하와 높은이 불가능하다는 것을 나타냄 검출되지 않았다.
항목 타액 컬렉션은 수집 단계에서 최소화되어야 외래 오염물에 대한 잠재, 및 하부 감염의 징후 일 수있다 시료 과도한 단백질의 존재로 샘플 품질에 한계가있다. 단백질이나 이물질 오염 물질의 다량의 수하여 정량화가 부정확하고 최종 추출 된 DNA에 남아있다. 재수 화 (단계 6)이 의심 된 후 잔여 단백질이나 오염이있는 경우, 샘플은 샘플 입력 볼륨을 반영하기 위해.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) R01(CWB에 대한 DC009453 지원)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15ml 원심분리기 튜브 | Fisher | 12-565-268 | |
| 세포 용해 용액 | Qiagen | 158908 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | |
| 단백질 침전 용액 | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| 글리코겐 | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% 에탄올 | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0.5 M) 용액 | Fisher | 03-500-506 | |
| 나트륨 도데실 황산염 | Fisher | BP166-100 | |
| 아날로그 볼텍스 믹서 | Fisher | 02-215-365 | |
| 원심분리기 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
참고문헌
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al.
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재인쇄 및 허가
