방법 논문

갭 접합부 시험에 대한 기능 분석; 인듐 - 주석 산화물에 자기편 세포의 전기 천공 법 (electroporation)

DOI:

10.3791/51710

⸱

2014년 10월 18일

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

이 논문에서

요약

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이 프레젠테이션은 세포간 접합 통신 연구에 부착 배양된 세포의 전기천공법이 사용되는 방법을 보여주며, 세포는 전도성 및 투명 인듐-주석 산화물로 코팅된 슬라이드에서 성장합니다.

초록

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이 기술에서는 투명한 전기 전도성 물질인 ITO(Indium-Tin Oxide)로 부분적으로 코팅된 유리 슬라이드에서 세포를 배양합니다. 펩타이드 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 다양한 분자는 기본적으로 비외상 방식으로 세포의 100%에 도입될 수 있습니다. 여기에서는 세포 간 간연접 통신을 연구하는 데 어떻게 사용할 수 있는지 설명합니다. 루시퍼 옐로우는 세포가 자라고 있는 전도성 표면에 가해진 전기 펄스로 인해 세포막을 통해 기공이 형성될 때 세포로 침투합니다. 이것은 electroporation입니다. 전기천공된 영역에 바로 인접한 비전도성 유리 표면에서 자라는 세포는 전기천공에 의해 루시퍼 옐로우를 흡수하지 않지만, 전기천공된 세포에 연결하는 간극연접을 통해 전달될 때 형광 염료를 획득합니다. 세포에서 세포로 염료가 이동하는 결과는 형광 조명에서 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 간극연접 통신(gap junctional communication)을 정밀하게 정량화할 수 있습니다. 또한, 펩타이드 또는 기타 비투과성 분자의 도입에 사용할 수 있으며, 인접하고 전기가 공급되지 않은 세포에서 신호를 억제하기 위해 간극연접을 통해 작은 전기천공된 펩타이드를 전달하는 것은 신호 억제의 강력한 입증입니다.

서론

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셀 전류의 애플리케이션 프로세스라고 일렉트로, 세포막에 구멍을 형성시킨다. 기공이 막을 통한 분자의 nonpermeant 다양한 통로를 허용한다. 전기장이 형성된 기공은 매우 작고 휴대 생리학 방해를 최소화하여, 급속 리 클로즈되도록 정확하게 제어 할 수있다. 흥미롭게도, 부착 세포는 현탁액에 전기 천공 할 분리되지 않고, 그들이 성장 표면에 도전성 투명 인듐 - 주석 산화물 (ITO)로 코팅하고, 반응계에서 electroporation하여 유리 슬라이드 상에 성장 될 수있다. 세포는이 표면 상에 잘 성장할 수 있으며, 이들이 결합하고 확장 한, 상세한 현미경 관찰이 가능하다. 이 기술을 사용하여, 소형 분자 nonpermeant 즉시 도입하고 미리보기의 활성화에 대한 연구를 위해 적합하게이 기술을 세포의 본질적으로 100 %로 할 수있다(1 검토) 수용체의 리간드 자극 다음과 같은 경로의의 onents.

일렉트로는 DNA의 도입 (또한 electrotransfection)에 주로 사용되어왔다. 그러나 현장에서 일렉트로는 전사 인자 바인딩, 또는 siRNA를 3,5 억제하는 등의 안티센스 RNA, 이중 가닥 DNA 미끼 올리고 뉴클레오티드 등의 펩티드 2-4, 올리고 뉴클레오티드 분자의 큰 다양성의 도입을 위해 도움이 될 수 있습니다, 6, 방사성 뉴클레오티드 7-10, 단백질 11 (12) 또는 전구 약물 13. 일렉트로 후, 세포는 생화학 적 분석을 위해 용해 또는 고정 및 항체로 염색 할 수 있습니다.

셀이 전도성 코팅의 가장자리에 걸쳐 증가함에 따라 세포의 성장이,이 표면의 높이 차이에 의해 방해되지 않도록 도전성 ITO 코팅은 800-1,000Å 매우 얇다. 이 장점이 아닌 electrop을 제공합니다orated 세포는 제어 역할을하는, electroporation하여 사람과 나란히 성장시킬 수있다. 비디오에서 설명한 것과 동일한 접근은 갭 접합부, 세포 간 통신 (GJIC)의 검사를 위해 사용될 수있다.

갭 접합 인접 셀 (14)의 내부를 연결하는 채널이다. 이러한에서 Src와 같은 종양 유전자가 GJIC (15, 16)를 억제하면서 갭 접합부는, 세포 간 통신은, 종양 형성 및 전이에 중요한 역할을한다. 루시퍼 옐로우 (LY) 같은 미세 주입을 통해 배양 된 세포에 도입하거나 긁어로드 (17)와 인접 셀에 염료의 확산이 현미경 형광 조명 아래에서 관찰 등의 GJIC에게 형광 염료를 검사합니다. 그러나 이러한 기술은 변함없이 세포 손상을 야기한다. 이제 셀 (18)에 부분적으로 ITO로 코팅 된 유리 슬라이드 상에 성장되는 기법을 설명한다. 전기 펄스 LY (또는 다른 염료)의 존재 캘리포니아 도포인접 비 electroporation하여 세포에 염료 이행는 형광 현미경을 통해 관찰 조명하면서, 상기 슬라이드의 도전 부에 성장 세포로의 침투를 사용. 단일 층으로부터 분리하는 경향이있다 감수성 세포 교란을 방지하기 위해, 전극을 필요로하지 않은 설계되었다 조립체는 전류 (19)를 적용하는 셀의 상단에 배치된다. 혈청 자극 (12) 다음의 G1 단계의 길이에 대한 효과의 부재에 의해 표시된 바와 같이이 방법은 FOS의 수준 증가, 세포 대사에 어떤 검출 가능한 방해하지 않고, 다수의 셀에서 GJIC을 정량 할 수있는 능력을 구비 protooncogene 단백질 (Raptis, 미 출판) 또는 셀룰러 스트레스, P38 돼지 또는 JNK / SAPK 키나제 1과 관련이 키나아제. 종양 유전자 발현 변화와 GJ의 레벨 사이의 링크의 시험이 가능하게 접근IC (18)뿐만 아니라, 폐 종양 표본 20-23 갓 배양 된 세포를 포함하여 다양한 종류의 세포에서 GJIC시에서 Src와 STAT3의 효과. 또한, 기판에 대한 세포 부착은 그 단계에서 환원 19,24되지만, 성공적 adipocytic 분화시 갭 정션 폐쇄 시연에 이용 된 상부 전극을 결여 한 바와 셋업과 동일계에서 일렉트로.

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프로토콜

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1 일렉트로 챔버에서 셀 도금

  1. 층류 흐름 후드에서 평소와 같이 멸균 기술을 이용하여 세포를 Trypsinize.
    참고 : 그들은 유리에 세포의 확산 방해 할 수 있으므로, 원심 분리하여있는 adherens와 갭 접합 따라서 형성을 트립신의 모든 흔적을 제거하는 것이 매우 중요합니다.
  2. 피펫 1 (37)의 출력 C 시츄 electroporator에서 (도 1), 및 장소, CO 2 인큐베이터 구비 일렉트로 멸균 챔버에 세포 현탁액의 ML.
    NOTE : 세포 부착은 피브로넥틴, 콜라겐, 폴리 라이신 또는 세포 및 조직 접착제 (원료 표 참조)에 도금에 의해 개선 될 수있다.
  3. 세포가 합류 층을 형성 할 때 그들은 GJIC 시험에 대한 준비가되어 있습니다.

2 일렉트로 절차

GJIC 검사 용 전기 천공은 층류 흐름 후드 외부에서 수행 될 수있다이 걸리기 때문에 단 몇 분. 긴 배양 시간은 특정 실험에 요구된다면, 그것은 층류 흐름 후드에서 전적으로 수행 될 수있다. 모든 경우에서, 세포는 성장 챔버는 멸균해야한다.

  1. 5 ㎎ / ㎖ 루시퍼 노란색 솔루션을 준비 : 2 ㎖의 칼슘이없는 성장 매체 (electroporator 제공) 10 mg을 LY 분말을 녹여. 4 O C.에서 용액 저장을 필터 멸균 긴 배양 시간을 필요로 실험
  2. 성장 매체를 기음과 단층을 긁거나 세포를 건조하지 않도록주의, 칼슘이없는 배지로 세포를 씻어. 세포가 건조하면 그들은 일반적으로 어두운 핵을 가지고 일렉트로없이 LY를 선택합니다. 효과는 더욱 공기 드래프트 (도 4F)에 노출되는 슬라이드의 중간에 더 현저하다.
  3. 에펜 도르프 피펫으로, 챔버 (B)의 에지에서, 셀 (챔버 전체를 400 μL)에 염료 용액을 피펫주의 eing입니다 것은 셀 층을 만지지 않도록.
  4. electroporator와 함께 제공되는 홀더에 실을 배치하고 적절한 강도 (토론 참조)의 펄스를 적용합니다.
  5. 조심스럽게 LY 솔루션의 일부를 대기음. 덜 중요한 실험 번 재사용 될 수있다.
  6. 10 % 투석 혈청을 포함하는 칼슘이없는 DMEM를 추가합니다.
  7. 갭 정션을 통한 염료 전달​​을 허용하도록 배양기에서 3-5 분 동안 세포를 배양한다.
    참고 :이 시점에서 투석 혈청의 포함은 기공 폐쇄를하는 데 도움이됩니다.
  8. 라이브 세포 관찰을위한 칼슘이없는 DMEM으로 통합되지 않은 염료를 세척 할 것. 대안 적으로, 세포를 웰에 4 % 포름 알데히드의 첨가를 통해,이 단계에서 고정 될 수 있고, 그 다음 PBS (인산염 완충 식염수)로 세척 하였다. 모든 경우에 세척 모든 배경을 제거해야합니다.
    주 : 예비 실험이 전압이 너무 낮은 경우, 최적의 조건을 결정하는 데있어서, 그것은 세포 incubato 회복하도록 할 수있다몇 분을위한 연구 및 슬라이드의 비용을 절약하기 위해 같은 슬라이드를 두 번 electroporate.

3 현미경 검사

  1. 사용되는 염료에 대한 적절한 필터를 구비 한 반전 된 현미경을 사용하여, 형광 조명 하에서 세포를 관찰한다. 노란색 루시퍼를 들어, 여자는 423nm, 방출 555nm, 니콘 IX70 현미경에 대한 WBV 필터입니다.
  2. 위상차 하에서 세포 형태를 조사하기 위해, 액체와 함께 상부에 충전 한 후, 잘 플라스틱 위에 유리 커버 슬립을 배치하여 메 니스 커스의 효과를 제거한다. 좋은 사진 촬영을 위해, 웰 슬라이드에서 분리 될 수 있으며, 커버 슬립은 프레임에 배치. 생균 대를 성장 배지로 채워 져야하는 동안 고정 된 세포의 경우, 웰, 현미경 관찰 용 글리세롤로 채워질 수있다.
    참고 : 세포가 염료 (위의 단계 2.7)의 전송 다음 포름 알데히드로 고정하는 경우 세탁 촬영이 용이하다. 세포가있는 경우 더t는 형광 고정 세포 형광 몇 시간 동안 유지가 도입하면서 LY의 세포 유형, 전압 및 양에 따라 약 60 분 이내에 세포로부터 제거하고, 고정. 그러나, 형광 페이드 또는 고정 된 세포에서, O / N 배양 후 소산. 이러한 이유로, 사진은 일렉트로 (그림 2) 직후에주의해야합니다.

세포 간 통신의 4 정량

  1. 형광 및 위상 대비 (그림 3)에서 20 배 목적으로 세포를 사진.
  2. 비 electroporation하여 영역 (그림 2, 화살표, 일렉트로 에지)과 경계에 electroporation하여 세포를 확인하고 별표 표시합니다.
  3. 염료가 갭 접합을 통해 전송 한 비 electroporation하여 측면에 형광 세포를 확인하고 점으로 표시 (그림 3a 및 3b).
  4. 의 총 수를 나눈다에지 (도 3a 및 3b)을 따라 electroporation하여 세포의 수에 의해 비 전기 천공 영역에 세포를 형광.
    NOTE 적어도 200 연속 electroporation하여 경계 셀로부터의 전송을 각각의 실험에 대해 계산된다. 얻어진 숫자는 GJIC 값이다.

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결과

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그림 2는 고정 및 세탁 다음과 같은 형광 (패널 A와 B)에서 LY와 전기 천공 및 촬영 쥐 간 상피 T51B 셀 (22), 또는 위상차 (C) 조명을 보여줍니다. 패널에 electroporation하여 영역의 가장자리가 빨간색으로 표시됩니다. 적색 라인의 오른쪽에 형광 구배 갭 정션을 통한 전송을 나타낸다. 염료가 전송 한 셀이 도트로 표시된 상태에서, 전기 천공 영역의 에지에서 셀 스타 식별되고 표시되었다 :도 3a 및도 3b에서, 갭 접합부 통신의 정량이 도시되어있다. 비 염료 electroporation하여 경계 셀 당에 전사 셀의 평균 개수를 나타낸다. 이 예에서, 즉 57 점과 10 개, GJIC = 5.7이 있습니다.

C 및 D, 전사 - (3)의 신호 변환기와 액티베이터 (STAT3)에서 T51B 셀 t에서 하향 조절되었다트랜스퍼 (22)의 ab...

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토론

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프로토콜의 중요한 단계

electroporation하여 재료
전기 천공 할 물질의 순도는 매우 중요하다. 세포가 매우 평탄한 경우 추적 염료의 다음 높은 농도 (20 mg을 LY 대 / ㎖까지)와 같은 경우에 사용되어야하며, 순도가 더욱 중요 더 구형 1 세포에서보다. LY 외에 다른 염료 또는 nonpermeant 분자의 많은 종류가 상이한 connexins 이루어진 25 채널 프로브로 사용할 알렉사 염료의 시리즈로서 사용되어왔다. 핵 염료 전송 더 어렵다 (그림 4D)의 정량을 만드는 매우 강한 형광 있도록 그러나, 에티 디움 브로마이드 또는 프로피 디움 요오드 등의 염료는 DNA에 인터된다. 추적 염료 칼슘 유입 접합부 통신을 중단뿐만 아니라, CEL을 줄일 수 있으므로, 제조 및 세척 칼슘없는 성장 배지에서 수행되어야리터 생존. 모든 솔루션은 이전의 기공 폐쇄과...

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공개 사항

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교신저자는 Cell Projects Inc.에 라이선스가 부여된 Queen's University가 보유한 특허의 발명가입니다. 회사나 대학은 논문의 내용에 영향을 미치지 않았습니다.

감사의 글

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전문적인 비디오 촬영 지원을 해준 Lowell Cochran에게 감사드립니다. 캐나다 보건 연구소(CIHR), 캐나다 유방암 재단(CBCF, 온타리오 지부), 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC), 캐나다 유방암 연구 연합, 온타리오 우수 센터, 유방암 액션 킹스턴 및 클레어 넬슨 유증 기금의 LR에 대한 보조금을 통한 재정 지원에 감사드립니다. SG는 NSERC 장학금을 받았습니다. MG는 미 육군 유방암 프로그램(US Army Breast Cancer Program), 온타리오주 연구혁신부(Ministry of Research and Innovation) 및 퀸즈 대학교 자문 연구 위원회(Advisory Research Committee of Queen's University)의 박사 후 연구원의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMCellgro http://www.cellgro.com/50-013-PB
DMEM 칼슘하이클론 없음 (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)SH30319-01
기증자 송아지 혈청 PAA: http://www.paa.com/Cat.# B15-008
소 태아 혈청PAA: http://www.paa.com/Cat.# A15-751
Electroporation apparatusCell Projects Ltd 영국: http://www.cellprojects.com/ACE-100
ChambersCell Projects Ltd UKACE-04-CC4-wells
Chambers Cell Projects Ltd UKACE-08-CC8-wells
Lucifer YellowCell Projects Ltd UKACE-25-LY고순도
CelTakBD Biosciences354240세포 및 조직 접착제
FibronectinSigma AldrichF1141
CollagenBD Biosciences354236
Poly-LysineSigma AldrichP8920

참고문헌

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