Method Article

게놈 복사 번호 변종의 탐지를위한 배열 비교 게놈 교잡 (배열 CGH)

DOI:

10.3791/51718

⸱

February 21st, 2015

 ,  ,  , 
1Cytogenetics Department, Guy's & St Thomas' NHS Foundation Trust, 2Cytogenetics Department, Viapath Analytics

In This Article

Summary

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유전자 복제 수 변이의 검출을위한 어레이 CGH는 G-밴드 핵형 분석을 대체하고있다. 이 문서는 기술 및 진단 서비스 실험실에서의 응용 프로그램을 설명합니다.

Abstract

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게놈 복제 수 변이체 검출을 위한

Array CGH가 G 밴드 핵형 분석을 대체했습니다. 이 백서는 임상 진단 서비스 실험실에서의 기술과 그 적용에 대해 설명합니다. 환자의 샘플(혈액, 타액 또는 기타 조직 유형)에서 추출한 DNA는 형광 색소(시아닌 5 또는 시아닌 3)로 표시됩니다. 참조 DNA 샘플은 반대쪽 형광 색소로 표시되어 있습니다. 표지된 DNA가 혼합되어 혼성화 완충액에 재현탁되고 임상적으로 중요한 영역에서 높은 프로브 밀도로 게놈 전체의 유전자좌에서 ~60,000개의 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성된 어레이에 적용되기 전에 통합되지 않은 뉴클레오티드를 제거하기 위한 정화 단계가 따릅니다. 혼성화 후 어레이를 세척한 다음 스캔하고 결과 이미지를 분석하여 각 프로브의 적색 및 녹색 형광을 측정합니다. 소프트웨어는 각 프로브 측정의 품질을 평가하고, 적색 형광과 녹색 형광의 비율을 계산하고, 잠재적인 복제 수 변형을 검출하는 데 사용됩니다.

Introduction

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이것은 염색체 결실 또는 세그먼트들의 추가 복사본들이 지적 장애, 및 dysmorphism congentical 기형을 일으킬 그 수년 동안 알려져 있고, 어떤 경우에는 하나의 유전 적 증후군을 야기하고있다. 그러나 이러한 변화의 게놈 전체의 검출을위한 2000 년대 중반까지 사용할 수있는 유일한 기술은 할 수없는 불균형의 지역 및 특성에 따라 5-10Mb 주위의 해상도를 가지고 염색체 분석을, 줄무늬 G, 그리고 어떤 재료가 동일한 밴딩 패턴 다른 염색체 영역에 의해 대체 된 염색체 이상을 검출한다. 이러한 현장 하이브리드 멀티 플렉스 결찰 특정 프로브 증폭 형광 등의 보조 세포 유전 학적 기술이 의심되는 특정 syndromic 불균형의 경우, 특정 유전자좌의 심문에 사용할 수 있었지만,이 배열 비교 게놈 교잡의 도입까지이지 않았다 (배열 CGH) 일상적인 임상 진단의에카피 수의 게놈 넓은 감지 (CNVs) 변종 서 비 스 2-5 (일반적으로 1백20킬로바이트 정도) 크게 증가 해상도로 가능하게되었다. 일부 지역은 일반 인구의 6-7에 널리 퍼져에 대한 조사 연구와 함께 임상 서비스 작업은 다른 CNVs 반면, 이전에 발견 할 수없는, 자폐증과 간질 8-11로....

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Protocol

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1. 라벨 반응

  1. 사용할 준비가 -20 C에서 접시와 상점 96 웰으로 제조업체가 권장하는 농도에서, 미리 나누어지는 메틴 3, 5 표지 dUTPs, 레이블이없는 뉴클레오티드 랜덤 프라이머를 사용하기 전에. 이 프로토콜, 분취 적절한 표지 된 dUTP의 10.5 μL 10.5 μL 뉴클레오티드와 표지되지 않은 각 웰 랜덤 프라이머의 목적.
  2. 빛으로부터 보호는 약 1 시간 동안 12 ° C에서 뉴클레오티드 프라이머가 즉시 사용 96 웰 플레이트를 해동.
  3. 해동 후, 빛으로부터 보호 적어도 30 분 동안 실온에서 평형이 플레이트.
  4. 적어도 15 분 동안 60 ° C에서 DNA 샘플을 평형.
  5. 액체 핸들링 로봇을 이용하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 클레아없는 물을 분배.
    주 : 물의 부피는 각각의 입력 샘플 DNA의 농도에 의존 할 것이다 NG 50 / UL의 최종 농도 야기하기에 충분해야한다.
  6. 액체 한 사용dling 로봇, 96- 웰 플레이트의 웰에 피펫 1 μg의 DNA가 (1.5 참조) 20 μL에 전량을 가지고.
    주 : 결과 데이터의 품질이 저하 될 수 있지만, DNA의 소량이 사용될 수있다 (귀중한 샘플 400 NG 아래로 입력 DNA 량을 사용할 수있다). <....

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Results

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혼성화 된 각 프로브 어레이에 적색, 녹색의 형광체의 혼합물로서 가시화된다 (도 1 참조). 각 프로브에 대한 녹색 형광 신호에 빨간색의 비율은 스캐너에 의해 정량화하고 관련 소프트웨어는 자신의 게놈 위치에 따라 LOG2 비율 이러한 플롯, 외부 프리셋 경계 떨어지는 영역을 식별합니다. 결과 배열 트레이스는 genomically 불균형으로 식별 영역의 해석을 할 수 있습니다. 예를 들어, 윌리엄스 증후군, 염색체 7의 인접 지역에서 낮은 복사 반복에 의해 매개 되풀이 microdeletion 증후군을 가진 아이의 추적이 그림 2에 도시되어있다.이 불균형은 소프트웨어에 의해 확인되었다 빨간 선으로 표시.

게놈의 정상 영역에 대한 1 : 1의 녹색 / 적색의 비율을 나타내는,도 2에 도시 된 바와 같이 형광 로그 비율은, 0 주위에 클러스터링한다 밀접 프로브. 흩어져 배열 흔적 resul .......

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Discussion

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어레이 CGH는 triploidy로 균형 재 배열 또는 배수성 이상을 감지하지 않습니다. 또한, 낮은 수준의 모자이크 불균형을 감지 할 수없는 문제점이있다. 그러나, 배열 CGH는 많은 세포 유전학 실험실에서 대체하고 G 줄무늬 염색체 분석보다 CNV 검출을위한 높은 해상도를 가지고있다. 따라서 게놈 전체의 CNV 감지를위한 황금의 현재 표준입니다. 이것은 향후 차세대 시퀀싱 기술로 대체 될 수 있지만, 현재, 그 비용 및 기술적 인 복잡성이 아직 임상 사용에 적합하지 않은 것으로 의미 CNV 감지 판독 짧은 사용과 관련된.

여기에 설명 된 프로토콜은 임상 서비스 실험실에서 일상적인 사용 중입니다. 96 샘플을 각각 두 실행은 액체 처리 로봇과 전용 실리카 막 스핀 열 처리 로봇을 사용하여 각 주에 처리됩니다. 자동화는 매우 일관성을 개선하고 품질을 유지하는 것이 좋습니다. DNA 혈액에서 추출타액, 산전 샘플 (예, 융모 또는 양수) 또는 조직 샘플이 될 수.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 인정하지 않습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CGH 마이크로어레이 8 x 60K애질런트G4126
어레이 CGH 세척 버퍼애질런트5188-5226
어레이 CGH 혼성화 버퍼애질런트5188-5380
Minelute 정제 키트Qiagen28006
어레이 CGH 라벨링 키트EnzoENZ-42672-0000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
  2. Ahn, J. W., et al.

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Array CGHCopy Number VariantsDNA LabelingFluorescent DyesHybridization BufferOligonucleotide ProbesFluorescence ScanningLog Two RatiosGenomic Imbalance DetectionClinical Diagnostic Service

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