방법 논문

테스트 시각 기능에 대한 간단한 행동 분석

DOI:

10.3791/51726

⸱

2014년 6월 12일

 , 
1Ophthalmology Department, Center for Vision Research, SUNY Eye Institute, Upstate Medical University

이 논문에서

요약

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제노는 올챙이가 검은 색 / 흰색 탱크의 흰색 측면에서 수영을 선호 ​​laevis의. 이 동작은 자신의 비전에 의해 유도된다. 이 동작을 바탕으로, 우리는 올챙이의 시각 기능을 테스트 할 수있는 간단한 분석을 제시한다.

초록

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개구리의 올챙이의 시각 기능의 측정은,는 Xenopus laevis의, 살아있는 동물의 실명에 대한 검사를 할 수 있습니다. optokinetic 응답은 테스트 한 모든 척추 동물에서 관찰 된 비전 기반의 재귀 동작입니다. 그래서 꼬리 플립 응답이 미묘한 반응을 기록 할 수있는 숙련 된 기술자를 필요로 다른 측정으로 사용 된 올챙이의 눈은 작은 수 있습니다. 우리는 올챙이가 검은 색과 흰색 양면 모두 탱크에 주입 할 때 탱크의 백색 옆에 수영하는 것을 선호한다는 사실에 따라 다른 행동 분석을 개발했다. 여기에 제시된 분석은 쉽게 측정 된 응답을 만들어 저렴하고 간단한 대안입니다. 설치는 대부분의 Xenopus의 실험실에서 쉽게 사용할 수 삼각대, 웹캠과 중첩 된 시험 탱크로 구성되어 있습니다. 이 문서는 이전과 시신경을 단절 한 후, 올챙이의 동작을 보여주는 동영상이 포함되어 있습니다. 한쪽 눈의 기능을 테스트하기 위해, 우리는 또한 스와 템포 포함각각의 눈은 연속적인 일에 망막 axotomy을 시행하는 올챙이의 sentative 결과. 미래 연구는 한 번에 여러 올챙이의 비전을 테스트하기 위해이 분석의 자동화 된 버전을 개발할 수 있습니다.

서론

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는 Xenopus laevis의 눈 형성을 연구하는 모델 생물로 사용되었습니다. 눈은 시각 발달과 기능에 영향을 테스트하는 유전자 또는 경로에 대한보다 주에 만기 성장하고, 신속하게 개발할 수 있습니다. 시각 기능을 테스트하기 위해 optokinetic 및 optomotor 응답은 각각 1, 2, 제브라 피쉬와는 Xenopus 올챙이에서 사용되었다. Xenopus의 올챙이의 눈이 제브라 피쉬에 비해 상대적으로 작은이기 때문에,이 분석은 Xenopus의 미묘한 꼬리 플립과 눈 운동 동작을 감지하는 특수 장비의 사용과 훈련 된 인력이 필요합니다. Xenopus의의보다 강력한 행동은 여기에 3 설명 흰색 배경에 탱크에서 수영에 대한 기본 설정입니다. 반 블랙 / 반 흰색 탱크에서 올챙이를 배치 할 때 미리 변성 올챙이 신속하게 탱크의 백색 옆에 수영. 우리는 이전에 다 능성 세포 유래 여부를 확인하기 위해이 분석을 사용눈은 4 기능이었다. 여기, 우리는 premetamorphic Xenopus의 올챙이의 시각 기능을 테스트하는 데 사용할 수있는이 분석의 세부 버전을보고합니다.

그것은 단지 대부분의 Xenopus의 실험실에서 발견 탑재 디지털 캠코더, 디지털 카메라 소프트웨어 및 표준 장비를 필요로하기 때문에이 분석은 optomotor 응답 분석보다 간단합니다. 또한, 기록 된 반응은 집계 결과에 특별한 훈련이 필요하지 않습니다. 우리의 대표적인 결과는 두 번 망막 axotomy을 시행 한 올챙이 같은 그룹, 탱크 주위에 무작위로 수영을 보여줍니다. 우리는 또한 하나의 눈은 시각적 인 반응을 테스트 할 수있는 방법을 보여주는 대표적인 올챙이의 행동 분석 결과를 포함했다. 분석 기간 동안 획득 한 숫자를 삽입하고 분석 할 수 있도록 워크 시트가 포함되어 있습니다. 이 워크 시트 테스트 올챙이가 시각적 응답을 가지고 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수있다.

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프로토콜

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동물 관리

Xenopus의이 연구에 사용 된 올챙이는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 북부 의과 대학 IACUC 및 가이드에 의해 승인 된 절차에 따라, 성장 제기 및 처리 하였다 laevis의.

. 1 전 동작 설정 : 올챙이

  1. 시판 소스에서 수정 된 Xenopus의 배아를 얻거나 이전에 6 바와 같이 체외에서 난자를 비옥.
  2. 20 mM의 KCl을,, 20 mM의 염화칼슘, 50 mM의 HEPES 0.1X MMR [10 X 마크의 수정 링거 (MMR) 솔루션 주식 (10 mM의 MgCl2를 2를 포함 60mm 배양 접시에 18 ˚ C에서 신경 판 단계의 배아에 blastula를 놓고; 1 M의 NaCl, 50 ㎍ / ml의 젠타 마이신 항생제), pH를 7.5로 조정하고 오토 클레이브 RT에서 보관. 매일 0.1X MMR을 변경하고 죽은 태아를 제거합니다.
  3. 배아 ~ 27 Nieuwkoop와 페이버 단계에 도달하면 - 30 7 번째 전환항생제없이 0.1X MMR에 전자 배아 장내 박테리아의 성장을 허용합니다.
  4. 그들은 먹이 단계​​ (단계 45)에 도달 할 때까지 올챙이 성장과 0.1X MMR 가득 100mm 배양 접시로 이동합니다. 그 사이 날에 0.1X MMR을 변경, 일주일 동안 매일 그들에게 쐐기 분말 상층 액을 넣습니다.
  5. 100mm 페트리 접시에 한 주 후에, 개구리 물이 가득 반 갤런 탱크에 동물 이동 [0.5 g / L 즉시 바다와 2 ㎜ 2 인산 나트륨 (나 2 HPO 4 : 141.96 MW)의 pH 6.8]. 단계 2.4로 피드,하지만 물이 흐린 경우 물에게 일주일에 2-3 시간을 변경합니다. 빛이 오전 6시에 점등과 12 시간의 light/12 어두운 빛의주기에서 동물을 유지합니다.
  6. 실험실 벤치있는 underpad, 적어도 12 시간의 O / N, 시험 전에 같은 흰색 표면에 시험 과목으로 하프 갤런 탱크를 배치합니다.
  7. 단계 45-50에서 테스트 올챙이은 아래 3 단계에서 설명.

. 2 전 동작 설정 : 기술 장비티

  1. 동작 분석을위한 실험실의 영역을 따로 설정합니다. 그것은 표준 형광 조명 조용하고, 트래픽이 낮은 지역에 있어야합니다.
  2. 동물 시험 탱크를 준비합니다.
    중첩, 하프 갤런 테스트 탱크는 두 부분으로 구성되어있다 : 물과 올챙이를 개최한다 내부 탱크; 그리고 시각적 인 자극과 외부 탱크.
    1. 내부 탱크, 빈틈없는, 바닥에서 5cm와 외부 코너에 작은 표시를합니다; 이 물 라인 (그림 1A, 녹색 점선)입니다.
    2. 또한, 내조에 대해, 실 가드 엘라스토머와 같은 불활성 화합물로 (모서리와 중앙) 탱크 디벳 채우기. 참고 : 그들은 채워하지 않는 경우 올챙이는이 지역에 머무르게됩니다
    3. 외부 탱크, 흰색 조직 종이 그림 1B 검은 전기 테이프, 다른 절반 하나의 탱크의 외부의 정확히 절반을 커버합니다.
  3. 에 탱크를 배치턴테이블을 접종.
  4. 설치 웹캠 / 삼각대는 테스트 탱크 위에 있도록. 도 1C에 도시 된 바와 같이, 테스트 영역의 시각화를 허용하도록 카메라를 조정.
  5. 5를 설치 퀵타임 플레이어 소프트웨어를 컴퓨터에 웹캠을 연결합니다. 카메라의 전원을 켭니다. QuickTime 플레이어에서 파일에서, '새 동영상 저장'을 선택합니다. 행동 분석 설정은 바로 컴퓨터에 표시됩니다.
  6. 올챙이 동작에 영향을 미칠 수있는 외부 신호를 줄일뿐만 아니라, 물의 표면에서의 반사광을 감소시키는 전체 셋업 위에 경량 면천 드레이프.
  7. 확인이 35-50 CD / m 2 사이 피복 대책 하에서 휘도.

3. 행동 분석

  1. 개구리 물 단계 1.2.1 제 5 cm 물 표시로 내부 테스트 탱크를 채우십시오.
  2. 작은 그물을 사용하여 조심스럽게 내부 테스트 탱크로 동물을 이동합니다.
  3. 오픈 Q컴퓨터와 가이드로 외부 탱크를 사용하는 방법에 대한 uickTime 소프트웨어는 카메라 테스트 영역을 시각화하고 기록 할 수 있는지 확인합니다.
  4. 카메라로 종이와 기록의 조각에 동물 이름, 날짜와 시간을 기록합니다.
  5. 오른쪽 그림 2 탱크의 검은면이 외부 탱크에 시험 탱크를 배치합니다.
  6. 탱크를 배치 한 후 바로 동영상 촬영을 시작하고 2 분 동안 타이머를 설정합니다.
  7. 타이머 비프, 내부 시험 탱크를 제거하면, 외부 탱크를 180도 회전과 외부 탱크 내부의 내부 시험 탱크를 배치합니다. 타이머를 시작합니다. 참고 : 검은 색면 지금 다른 측면에 있어야합니다.
  8. 열 시험의 총 단계 3.7, 여덟 번 이상 반복합니다. 각 시험을 확인, 가이드로 그림 2를 사용합니다.
  9. 두 개의 분리 된 일에 행동 분석을 반복합니다.

4. 망막 Axotomy

  1. 그들은이 응답 할 때까지 0.02 %의 tricaine에 동물을 배치# 3 집게로 꼬리 핀치에.
  2. 0.1X MMR 1 % 아가로 오스를 용융 한 후 60mm 페트리 접시에 추가합니다. 동물의 일부가 액체에 빠져들도록 냉각되면, 아가로 오스의 작은 직사각형의 잔디를 만들어 작은 0.02 %의 tricaine와 잔디에 올챙이를 추가합니다.
  3. 피어스 25 G 바늘을 눈의 등쪽 영역 뒤에 45도 각도로 피부, 반대편 집게 대하여 동물을 보강하면서.
  4. 시신경 옆에 자리 잡고 정맥을 자르지 않도록주의하면서 조심스럽게 # 5 집게로 구멍에 도달 시신경을 싹둑 꺼 그것을 뒤집어. 심한 출혈로 인해 실수로 동맥을 자르는에있는 경우, 다음 신속하게 안락사에 2 % tricaine에 동물을 배치합니다. 주의 : 2 % tricaine 솔루션은 인간의 마비를 일으킬 수 있습니다. 이 솔루션은 장갑으로 취급되어야한다.
  5. 동물을 복구하기 위해 수술 후, 0.7X MMR과 100mm 배양 접시에 20 분 동안 50 ㎍ / ㎖의 젠타 마이신에 동물을 배치합니다. 네브라스카XT, 개구리 물 회수 탱크로 전송 올챙이. 동물 나머지 O / N.에게하자
  6. 다음날 아침, (3.1-3.9 단계) 전술 한 바와 같이 시각 기능을 테스트합니다.

5. 결과 분석

  1. 시험이 종료 된 후, 올챙이는 탱크의 검은면에 남아있는 시간의 양을 측정합니다.
    1. 수동으로 시간을 표시하고 자주 일시 중지 할 수 있습니다 소프트웨어를 사용하여 비디오를 볼 수 있습니다. 비디오 디스플레이 시간을 본다. 내부 탱크가 성공적으로 외부 탱크 내부에 둥지와 카메라의 관점에서 제곱 때입니다 두 분 재판의 시작을 기록합니다.
    2. 동물에 수영 탱크의 어느 쪽이 정의하는 올챙이의 눈의 위치를​​ 사용합니다. 두 눈은 검은 색 / 흰색 선을 넘은 경우에만 다른 탱크의 한쪽면에 교차 정의합니다.
  2. 동물 블랙 측에 소비 한 시간 (초 단위) 각 간격의 시작과 끝을 적는다. 일시 정지 및 재정확도를 보장하기 위해 비디오 감는다. 각 시험에서 초 총.
  3. 연결된 동작 워크 시트에 입력이 숫자를. 워크 시트는 동물이 초 총 시간으로 총 120 초 시행 분열에서 탱크의 검은면에 소요되는 시간을 빼서 흰색면에 소요되는 시간의 비율을 계산합니다 [(120 - 전체 초에 지출 검은면) / 120 초]. 10 시험에 워크 시트의 평균은이 비율.
  4. 일 사이의 실험 (0.05 ≤ P) 중요한 있는지 확인하기 위해 학생의 T-테스트, 쌍, 양측 분포를 사용합니다.

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결과

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이전 보고서는이 분석, 우리는 올챙이의 눈을 하나의 시각적 기능을 테스트하기 위해이 분석을 변경 한 배경 색상 기본 설정 분석 3 premetamorphic Xenopus의 올챙이가 검은 색 / 흰색 탱크의 백색 옆에 수영하는 것을 선호하는 것으로 나타와 호출 한 주 미만. 이러한 방식으로, 자신의 눈 조직 학적 검사를 위해 수집 될 수있다.

우리는 응답이 시각 신호에 의한 방법을 여기에 보여줍니다. 영화 1에서, 좌측 및 우측 패널에 올챙이 같은 동물이다. 왼쪽은 수술 전 오른쪽에 동물, 모두 시신경을 절단하는 후 동물입니다. 우리는 아무것도 검은 측면에서 동물을 격퇴 또는 흰색면에 유치하기 위해 추가되지 않습니다 것을 보여주기 위해 물을 소용돌이. 영화에서, 우리는 동물의 각 세트에 대한 시신경의 상태를 보여줍니다 하단 모서리에있는 올챙이의 개략을 제공합니다. 영화 1, 일반,...

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토론

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우리는 여기에 쉽게 최소한의 교육을받은 실험실 요원에 의해 주에서 수행 할 수있는 간단한 비전 가이드 행동 분석을보고합니다. 다른 분석은 동물의 행동에 전문 장비와 전문 지식을 필요로하지만,이 분석은 빠른 테스트가 시각 기능을 확인할 수 있습니다. 또 다른 행동 분석, 비주얼 회피 분석은, tectum는 Xenopus의 10에 시각적 인식에 기여하는 방법을 결정하기 위해 개발되었습니다. 안정된 배경 대 이동, 따라서 단순한 분석보다 더 전문적인 비전 기반 동작을 측정 할 수 있습니다에 대한 응답이 분석 측정 공간 조정 및 대비 감도는 여기에보고했다. 자동화 된 동작 시스템은 탱크 (8)의 일측에 소요되는 시간의 양을 측정 할 수있는 것으로보고되었다. 어둡거나 밝은 환경 9에서 보내는 시간 지브라 피쉬의 양을 측정하는 데 사용 된 시판용 소프트웨어 (예 ANY-미로 소프트웨어)도있다.ssay 우리는 고가의 장비 나 소프트웨어의 이러한 유형...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작품은 건강의 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다 : EY015748, EY017964 (MEZ), 및 EY019517 (ASV). 이 작품은 또한 안과 부서 및 중앙 뉴욕의 사자 실명 무제한 부여를 방지하기 위해 연구에 의해 지원되었다. 우리는 또한 동물의 자신의 우수한 치료를 위해이 비디오에서 주연하는 스테핑에 대한 우리의 동물 기술자, 마 멜리을, 감사의 말씀을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1/2 갤런 플렉스-탱크 커버eNascoSB19271M크기: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"
검정 전기 테이프
흰색 티슈 페이퍼
대형 접종 턴테이블VWR50809-022크기: Dia 114.3 x  H 76.2 mm (4 1/2  x  3")
Durasorb 언더패드VWR82004-836크기: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24")
KimwipeKrackeler Scientific, Inc.1945-34155-CS
표준 삼각대다양한
iSight 카메라 또는 웹캠AppleM8817LL/A큰 올챙이에게는 좋지만 작은 올챙이는 보기 어렵습니다
휴대용 컴퓨터Apple/PC다양한우리는 13인치 MacBook, 2GHz Intel Core 2 Duo를 사용했습니다. MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV 핸디캠 캠코더SONYDCR-HC42를 실행합니다.6-도체 및 4-도체 알파 FireWire 400 
Handycam stationSONYDCRA-C121이것은 파이어와이어를 카메라에 연결하는 데 사용할 수 있습니다
QuickTime Player 소프트웨어Quicktime버전 10.1
26 G 바늘 (5/8" 길이)VWRBD305115
Dumont #5 펜치파인 사이언스 도구11295-10
일회용품
겐타마이신 설페이트 [50 mg/ml]Fisher Scientific17-528ZRT에 보관
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머Fisher ScientificNC9644388
Instant oceanDoctors Foster and SmithCD-116528저장 용액 = RT에 100 g/L 저장
이염기성 Sigma AldrichS0876저장 용액 = 0.4 M RT에 저장
체외 수정 배아eNascoLM00490MX100 배아/단위
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참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
  2. Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
  3. Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
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  6. Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
  7. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  8. Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
  9. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
  10. Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  11. Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
  12. De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).

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