바렛 식도 세포의 특성에 대한 면역 방법

요약

바렛 식도의 분자 드라이버에 대한 개선 된 정보를 식별 할 필요가있다. 면역 형광 염색은 세포 형태에 세포 신호 전달의 효과를 이해하기위한 유용한 기술이다. 우리는 바렛 식도 세포의 치료 적 처치를 평가하기 위하여 면역 형광 염색법을 사용하기위한 간단한 효과적인 프로토콜을 제시한다.

초록

식도 선암 (EAC)는 전체 생존보다 17 %의 속도와 EAC의 발병률은 지난 20 년 동안 극적으로 증가했다가 있습니다. EAC의 주요 위험 요인 중 하나는 바렛 식도 (BE), 만성 가슴 앓이에 대한 응답으로 정상 편평 식도의 화생이 있으면서 변화입니다. EAC 사이의 잘 설정된 연결에도 불구하고, 분자 이벤트의 진행을 포함 특히 변경된 신호 전달 경로의 심문은 EAC에, 제대로 이해 못할 것이다. 이 중 대부분은 이러한 질병을 연구하는 데 사용할 수 체외 모델에 적합한의 부족 때문이다. 최근 불후의 BE 세포주 BE의 생체 연구를 허용 시판되고있다. 여기서, 우리는 치료 화합물에 노출 된 후 세포 신호 및 구조의 시험 관내 특성화 있도록 BE 불멸화 세포주의 면역 염색을위한 방법을 제시한다. 이러한 기술의 적용은 그러는 것p는 EAC 진행하는에 관련된 메커니즘에 대한 통찰력을 개발하고 치료 및 EAC의 예방을위한 잠재적 인 수단을 제공합니다.

서론

바렛 식도 (BE)은 식도의 편평 상피 세포 및 정상적인 위 식도 역류 질환 (GERD) ^(1)로부터 얻어진 위 내용물에 대한 만성 노출의 결과에 화생이 있으면서 변화이다. BE는 GERD에 대한 응답으로 보호 메커니즘 것으로 생각됩니다, 그러나 BE의 존재는 식도 선암 (EAC), 현저하게 생존율 ^1을 전달하는 질병의 증가 위험을 부여. 현재 견적은 미국 인구의 최대 5.6 %가달라고하는 것이 좋습니다 BE는 종종 무증상으로, 그러나, BE의 ^{대부분이이} 진단되지 않은 남아 있다고 생각합니다. GERD와 EAC 모두의 발생률이 계속 성장 ³ 본 바와 같이,이 정보는 잠재적으로 EAC하는의 진행을 방지하는 방향으로 치료 방법을 제공 할 수있다, 특히로, EAC하는의 진행에 관여하는 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요 해지고있다.

환자 관한 연구는 BE-EAC 병인 ^1의 현재 패러다임에 성공. 만성 염증, 상처, 그리고 위의 내용에 장기간 노출로 인한 유전 독성 피해는 EAC에 종양의 진행을 촉진 BE 병변에 선택적 압력을 발휘. 유전 변경의 숫자는 동안 EAC 진행하는 확인되었습니다. 그러나 이것에도 불구하고 세포 신호의 정확한 변화와 세포의 ....

프로토콜

1. 셀 라인의 유지 보수

1. 불후의 성격 효소 (TERT) 단백질 ¹¹ 반대로 인간 텔로 머라 아제의 안정적인 형질 전환에 의해 고급 이형성 (CP-B, CP-C, CP-D) 및 화생이 있으면서 (CP-A) 세포주합니다.
2. 유지 세포 소 뇌하수체 추출물 (BPE), 표피 성장 인자 (EGF), 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 비 필수 아미노산 (NEAA), 페니실린 - 스트렙토 마이신-네오 마이신 (PSN)로 보충 각질 미디어 라인 및 표준 BE 조직 배양 조건 (37 ° C에서 5 % CO _2, 98 % 습도).

2. 셀 도금하고있다

1. 12 - 웰 플레이트 / 커버 슬립의 제조. 유리 페트리 접시와 오토 클레이브에 18mm 커버 슬립을 놓습니다. 전송 진공관에 부착 멸균 유리 피펫을 사용하여 12 - 웰 조직 배양 접시에 18mm 유리 커버 슬립을 멸균. 멸균 PBS 및 미디어 커버 슬립을 씻으십시오.
2. 를 Trypsinize 및 불후의 BE 세포를 계산합니다. 세포 USI를 계산자동 셀 카운터 또는 혈구를 겨. 20,000-40,000 세포 / ml의 농도로 배양 배지에서 세포를 희석.
3. 각이 잘 20....

결과

개시된 방법의 애플리케이션으로부터 얻어진 결과의 일례는도 1a-D에 도시되어있다. CP-D와 CP-C BE 세포와 커버 슬립은 Src에 가족 억제제 SKI-606, 또는 차량 (DMSO)의 1 μM로 24 시간 동안 처리하여 단백질, β 신호있는 adherens 접합 Wnt에 대해 위의 절차를 사용하여 염색 - 카테닌. 세포 핵의 라벨이 DAPI (파란색)로 표시하여 수행하는 동안 β-catenin의 시각화는, 녹색 형광체에 결합 된 항 토끼 IgG에있는 라벨에 의해 달성되었다. 커버 슬립은 하드 장착 설정하고 세포가 63X/1.4N 계획 - 고차 색지움 목표를 사용하여 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 몇 군데 사용하여 슬라이드를 현미경에 장착되었다. 선택 녹색 형광체는 488 nm에서 흥분과 505-525 nm에서 방출 필터를 사용하여 시각화 하였다. 마찬가지로, DAPI는 405 nm의 410-460 nm의 필터를 사용하여 수집 방출에 흥분했다. 티로신 키나제에서 Src의 활동 전의 .......

토론

우리는이 세포에 따라 타겟 요법의 생리적 효과를 해명으로 BE 세포의 IF를 적용하는 방법을 설명했다. 우리는 BE 세포 향한 이러한 절차의 사용을 설명하는 동안, 우리는이 방법 또한 다른 세포 유형 ^13,17,18의 다양한 적용 할 수있는 것으로 나타났습니다. 또한, 이러한 절차는 특정 대상에 대한 염색을 최적화하는 여러 가지 방법으로 변경할 수 있습니다.

우리는 적절한 IF에 따라 직접적인 영향을 하나의 매개 변수가 고정의 선택을 찾을 수 있습니다. 우리는 위의 절차에 고정 용 4 % PFA / PBS를 사용하는 방법을 설명했지만 대안 고정 제는 또한 적용 가능하다. 냉 메탄올 고정은 (-20 ° C) 20 분 동안 PBS로 세척 한 후 특정 단백질 / 항체 ^13에 적합합니다. 고정 용 냉 메탄올의 사용은 세포를 투과 할 필요성을 부정. 그러나, 정착의 선택 (4 % PFA / PBS 또는 냉 메탄올)는 경험적으로 결정해야합니다. <.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CP-A (메타플라스틱 세포주)	ATCC	CRL-4027
CP-B (고급 이형성 세포주)	ATCC	CRL-4028
CP-C (고급 이형성 세포주)	ATCC	CRL-4029
CP-D (고급 이형성 세포주)	ATCC	CRL-4030
각질세포-SFM (1x), Liquid	Life Technologies	17005-042
0.25% 트립신-EDTA (1x), 페놀 레드	Life Technologies	25200056
Fetal Bovine Serum, Qualified, HI	Life Technologies	10438026
PSN 항생제 혼합물	Life Technologies	15640
PBS - 인산염 완충 식염수	Life Technologies	10010049
Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
원형 유리 커버슬립 18mm	Fisher Scientific	15-183-86
β-catenin 1차 항체(토끼)	세포 신호	9562S
Alexa Fluor 488(염소 토끼 방지)	Life Technologies	A11008
10cm TC 처리 PS 접시, 멸균	USA Scientific	CC7682-3394
12웰 TC 처리 PS 플레이트, 멸균	USA Scientific	5666-5180
DMSO	시그마-알드리치	276855
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148
염화암모늄	시그마-알드리치	A9434
사포닌	시그마-알드리치	47036
소 혈청 알부민 - 분획 V	Sigma-Aldrich	85040C
SKI-606 (Bosutinib)	Selleck Chemicals	S1014
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