플록스, 조건부 발암성 대립유전자로 조작되고 바이러스 Cre 매개 재조합을 통해 형질전환된 마우스에서 채취한 표현형 야생형 성상세포와 신경 줄기세포는 syngeneic, immune-competent littermate의 뇌에 형질전환된 세포의 orthotopic 주입에 의해 in vitro 및 in vivo에서 성상세포종 발병기전을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여
이 논문에서
요약
초록
현재의 성상세포종 모델은 질병 발병 중 특정 뇌세포 유형에서 발암성 돌연변이의 역할을 정의하는 능력과 전임상 약물 개발에 대한 유용성에 한계가 있습니다. 이러한 응용 프로그램을 위한 더 나은 모델 시스템을 설계하기 위해, 플록스된 발암성 대립유전자의 다양한 조합을 가진 조건부, 유전자 조작 마우스(GEM)의 표현형 야생형 피질 성상세포와 신경 줄기세포(NSC)를 수확하고 배양에서 성장시켰습니다. 유전자 재조합은 아데노바이러스 Cre 매개 재조합을 사용하여 in vitro에서 유도되었으며, 그 결과 돌연변이 발암 유전자의 발현 및 종양 억제 유전자의 결실이 이루어졌습니다. 이러한 돌연변이의 표현형 결과는 in vitro에서 증식, 형질전환 및 약물 반응을 측정하여 정의되었습니다. 형질전환된 세포를 면역이 가능한 syngeneic littermates의 뇌에 정위 주입하는 orthotopic allograft model은 in vivo 종양 형성에 대한 발암 돌연변이 및 세포 유형의 역할을 정의하기 위해 개발되었습니다. 대부분의 확립된 인간 교모세포종 세포주 이종이식편과 달리, 형질전환된 GEM 유래 피질 성상세포를 면역 능력이 있는 리터메이트의 뇌에 주입하면 가장 공격적인 아형인 교모세포종을 포함한 성상세포종을 생성했으며, 이는 정상 뇌 실질의 확산 침습을 포함하여 인간 성상세포종의 조직병리학적 특징을 요약했습니다. 루시페라아제를 발현하도록 조작된 형질전환된 성상세포의 정형외과 동종이식편의 생물발광 이미징을 활용하여 시간 경과에 따른 생체 내 종양 성장을 모니터링했습니다. 따라서 조건부 발암성 대립유전자와 함께 GEM에서 수확한 성상세포와 NSC를 사용하는 성상세포종 모델은 시험관 내 및 생체 내에서 성상세포종 발병의 유전학 및 세포 생물학을 연구하기 위한 통합 시스템을 제공하며 이러한 파괴적인 질병에 대한 전임상 약물 개발에 유용할 수 있습니다.
서론
성상 세포종은 가장 흔한 일차 뇌종양 및 아교 모세포종 (GBM), 등급 IV의 성상 세포종 아르, 12-15개월 1,2의 평균 생존과 가장 일반적이고 공격적인 서브 타입이다. 미만성 성상 세포종, 특히 GBM의 침공, 완전한 수술 적 절제를 배제 보조 요법의 효과를 제한하고, 필연적으로 치료 후 재발 세 리드. 드 노보 (주) GBM 또는 필연적으로 (보조) GBM 사에 진행 낮은 뇌 성상 세포종 중 처음 본 환자. GBM은 유 전적으로 이기종 세 가지 핵심 신호 전달 경로 제어하는 유전자에 상호 배타적와 공동으로 발생하는 돌연변이에 의해 특징입니다 : G 1 / S (굽은) 세포주기 체크 포인트, 수용체 티로신 키나제 (RTK)를, 그리고 TP53 5-7 경로. GBM은 GBM의 하위 유형 influ 것을 제안, 서로 다른 뇌 세포 유형과 유사한 별개의 발현 양상과 네 게놈 하위 유형으로 구성원점 6,8,9의 그것의 세포에 의해 추측되는. 성상 세포종 나은 모델은 성상 세포종 병인 중에 특정 세포 유형의 돌연변이의 특정 조합의 역할을 정의해야한다. 보다 효율적인 임상 약물 개발을위한 이러한 모델을 활용하여 궁극적으로 환자 결과를 개선하는 데 도움이됩니다.....
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프로토콜
모든 동물 연구는 노스 캐롤라이나 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.
신생아 쥐에서 1 배양 대뇌 피질의 성상
- 준비
- 2-3 섬세한 작업 조직을 구겨 및 70 % 에탄올을 함유하는 플라스크의 바닥에 놓는다. 해부 가위, 곡선 포셉이 플라스크에 넣고 바로 마이크로 포셉의 이쌍를 놓습니다. 조직은 마이크로 집게를 구부러지지 않도록하는 데 사용됩니다.
- 60mm 조직 배양 접시에 HBSS 1 ML을 추가합니다. 각 동물에 대해 별도의 접시를 준비하고 얼음에 요리를 유지한다.
- 기관의 규정에 따라 동물을 마취.
- 따뜻한 10 % 소 태아 혈청 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (완료 DMEM) 37 ° C의 물을 욕조에 각 동물에 대한과 DMEM 7 ML. 참고 : 5 쥐를 들어, 1.1.1-1.1.4은 ~ 15 분 소요됩니다 단계를 반복합니다.
- 조직 수확
- instituti 당 신생아 마우스 (일 1-3) 희생ONAL 규정.
- , 에탄올 해부 가위를 제거 그들을 건조 똑 수 있도록하고, 코 척수의 두개골을 통해 피부에서 시상을 잘라주십시오.
- 척수에서 ....
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결과
우리는 표현형 생체 외 및 생체 특징으로 할 수있다 조건부 종양 대립 유전자 (그림 1) floxed 신생아 GEM의 숨겨에서 수확 대뇌 피질의 성상 및 NSC와 nGEM 모델 시스템을 개발했다. 구체적으로는 시험 관내에서 피질 별아교 세포의 발암 돌연변이의 영향을 조사하기 위하여, 성상 세포에 대한 제 풍부하는 것이 중요하다. 두피 성상 세포는 미세 아교 세포 수확, 아스트로 사이트, 올리고 덴드로 사이트, OPC 및 뉴런의 혼합물을 포함하지만, 기계적 및 유전 적 방법은 성상 세포 농축에 도움을 줄 수있다. 뉴런 정상 배양 조건 하에서 다이 반면, 미세 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포는 41,43 밤새 진탕 제거 될 수있다. 또한, Ad5GFAPCre을 사용 GFAP + 성상 세포를 대상으로 floxed, 종양 대립 유전자의 유전자 재조합은 성상 세포에 풍부하게 할 수 있습니다. 우리는 플로와
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토론
가장 중요한 단계, 2), 3) 철저히 세포를 떼어 놓다, 수막을 제거하는 뇌량 아래 조직을 고려하지 않고 피질을 절제하는 적절한 수확 및 대뇌 피질의 성상 세포의 배양 아르 일)을 보장하기 위해, 4) GFAP에 대한 풍부 + 성상 교세포. 우리는 GFAP + 성상 세포에 대한 풍부 방법 (GFAP 프로모터의 제어하에 (지배적 인 변형 유전자의 Ad5GFAPCre 벡터 또는 활용과 TgGZT 121)를 유전자 재조합의 제한) 기계 (흔들림) 유전자를 사용하지만, 다른 기술은 대뇌 피질을 정화하기 위해 이용되어왔다 성상 교세포. 예를 들어, 오염 된 미세 아교 세포는 L-류신 메틸 에스터 (47)이어서 유사 분열 억제제 합류 배양을 처리함으로써 제거 될 수있다. 혈청 함유 미디어에서 기계적으로 정제 배양 성상 세포의 형태와 발현 프로파일은 이전 hypothesi으로, 급성 격리 성상과 다를데이빗은 더 미성숙 성상 세포.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
CRM은 Damon Runyon-Genentech 임상 조사관입니다. 이 작업은 Damon Runyon Cancer Research Foundation(CI-45-09), Department of Defense(W81XWH-09-2-0042) 및 University of North Carolina University Cancer Research Fund(UCRF)의 CRM 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 저자는 쥐 사육 지원에 대해 Daniel Roth에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 조직 배양 및 면역형광 지원에 대해 Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette 및 Susannah Krom에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Dulbecco의 Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM은 GIBCOSigma 및 Cellgro |
| Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | 를 포함한 다른 공급업체에서도 구입할 수 있습니다. |
| 연골 엄지 집게, 곡선형 | 피셔 사이언티픽 | 1631 | |
| Miltex 17-301 스타일 1 보석상 스타일 집게, 세밀, 4 | Miltex | 17-301 | |
| 에탄올 (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
| 면도날 | VWR | 55411-050 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), 액체 | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express (1x), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | 다른 트립신 용액은 피질 성상 세포에도 적합합니다 및 배 |
| 양 Culture Dish, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml 튜브 | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml 튜브 | BD Biosciences | 352070 | |
| 아데노바이러스 재고 | 유전자 전달 Vector Core, U. 아이오와 | Ad5CMV5 | µ의 저장소 l -80 °C에서 부분 표본. 위험한. Bsl2 안전 주의사항 사용 |
| 황산나트륨 (Na2SO4) | 시그마-알드리치 | 238597 | |
| 황산칼륨(K2SO4) | 시그마-알드리치 | 221325 | |
| 염화마그네슘(MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 염화칼슘(CaCl2) | 시그마-알드리치 | 746495 | |
| HEPES 칼륨염 | 시그마-알드리치 | H0527 | |
| D-(+)- 포도 | 시그마-알드리치 | G8270 | |
| 페놀 레드 | 시그마-알드리치 | P3532 | |
| 수산화나트륨 (NaOH) | 시그마-알드리치 | S5881 | |
| 파파인 | 워딩턴 | LS003127 | |
| L-시스테인-HCl | 시그마-알드리치 | C1276 | |
| 주사기 필터 (0.22 &마이크로; m pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
| Neurocult 증식 키트, 마우스 | Stemcell Technologies | 5702 | 이 키트에는 NSC 배양에 필요한 NeuroCult NSC 기초 매체 및 NeuroCult NSC 보충제가 포함되어 |
| 0.2% Heparin 용액 | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | 10 mM 재고 만들기 DMSO, -20 °에서 보관; C |
| 6웰 플레이트 | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| 세포 여과기(40 &마이크로; m pore size) | Corning | 352340 | |
| 줄기세포 해리 용액 | Stemcell Technologies | 5707 | 또는 Accutase |
| Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x | Millipore | SLM-202-B | % 메틸 셀룰로오스 용액 |
| 1.7ml Snap Cap 제조용 마이크로 원심분리기 튜브 | Corning | 3620 | |
| Hamilton 주사기, 250 µ l LT 바늘 없음 | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 항원 디스펜서 | 해밀턴 | 83700 | |
| 일회용 18G 바늘 | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27 ga 1/2" 루어 팁 바늘 | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | ||
| NC9689910 모델 900 스테레오택시 프레임 | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | 조직 접착제 |
| 리도카인 | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
| Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | in vivo 이미징용 | |
| D-Luciferin - K+ Salt 생물 발광 기판 | PerkinElmer | 122796 < | em>in vivo 생물 발광 이미징 |
| EdU 이미징 키트 | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |
참고문헌
- Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
- Stupp, R., et al.
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재인쇄 및 허가
