방법 논문

유방암 수술의 잠재적 인 근적외선 형광 이미징 응용 프로그램을 평가하는 팬텀을 조직 시뮬레이션

DOI:

10.3791/51776

⸱

2014년 9월 19일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University Medical Center Groningen, 2Helmholtz Zentrum Munich, Technical University of Munich

이 논문에서

요약

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근적외선 형광(NIRF) 영상은 수술 중 종양의 국소화 및 수술 마진 상태의 평가를 가능하게 하여 유방암 수술의 치료 결과를 개선할 수 있습니다. 형광 종양 시뮬레이션 내포물을 포함하는 조직 시뮬레이션 유방 팬텀을 사용하여 유방암 환자에서 NIRF 이미징의 잠재적인 임상 응용을 표준화 및 교육 목적으로 평가할 수 있습니다.

초록

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수술 중 종양의 현지화 및 유방 보존 수술 (BCS)의 최적 결과에 절제 상태 결과 평가에서 부정확. 광학 이미징, 특히 근적외선 형광 (NIRF) 영상에 실시간으로 사전 및 수술 중 종양 현지화를위한 도구로 의사를 제공하여 BCS 다음과 같은 긍정적 인 절제의 빈도를 줄일 수 있습니다. 현재 연구에서, NIRF 유도 BCS의 전위 표준화 및 훈련 목적의 이유로 유방 조직 시뮬레이션 팬텀을 이용하여 평가된다.

정상적인 유방 조직의 것과 유사한 광학 특성을 갖는 유방 팬텀 유방 절약 수술 시뮬레이션을 위해 사용되었다. 종양 시뮬레이션 형광 염료 인도 사이 아닌 그린 (ICG)를 포함 흠은 미리 정의 된 위치에서 팬텀에 통합하고 전 및 수술 중 종양 현지화, 실시간 NIRF 유도 종양 절제술, NIRF가 유도를 위해 몇 군데 있었다수술의 범위에 대한 평가, 절제 수술 후 평가. 커스터마이즈 NIRF 카메라는 촬상 목적 임상 프로토로서 사용 하였다.

종양 시뮬레이션 내포물을 포함하는 유방 팬텀은 시뮬레이션 및 수술 중 종양 영상을 평가하는 간단하고 저렴하고 다양한 도구를 제공합니다. 젤라틴 팬텀은 인체 조직과 유사한 탄성 특성을 가지고 있으며 기존의 수술 도구를 사용하여 절단 할 수 있습니다. 또한, 팬텀은 각각 광자의 흡수와 산란을 흉내 낸 인간의 유방 조직과 유사한 균일 한 광학 특성을 만들기위한 헤모글로빈 i​​ntralipid가 포함되어 있습니다. 에피 조명 전략 뿌리 깊은 종양 (비 침습적) 영상을 방해하는 조직을 통해 전파 할 때 NIRF 이미징의 주요 단점은 광자의 제한된 침투 깊이이다.

서론

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방사선이어서 유방 보전 수술 (BCS)는 1 T 2 - T 1,2 유방암 유방암 환자의 표준 치료이다. 추가 수술 적 치료 또는 방사선 치료 3,4,5을 필요로, BCS를받은 환자의 20~40% 긍정적 절제 수술 결과의 범위의 수술 평가에서 부정확. 인접한 건강한 유방 조직의 광범위한 절제가 긍정적 인 절제의 빈도를 줄일 수 있지만,이 또한 화장품 결과를 방해와 동반 질환의 6,7 증가 할 것이다. 새로운 기술은 따라서 일차 종양의 위치 및 수술의 범위에 대한 피드백을 제공하는 수술이 필요하다. 광학 이미징, 특히 근적외선 형광 (NIRF) 이미징, 연구의 전 및 수술 중 종양 현지화를위한 도구로 의사를 제공하여 BCS 다음과 같은 긍정적 인 절제의 빈도를 줄일 수 있습니다EAL 시간. 최근 우리 그룹은 고감도 8 차 종양 및 복강 내 전이를 감지하는이 기술의 가능성을 보여주는, 난소 암 환자의 종양 표적 형광 이미징의 첫번째에서 인간 재판에보고했다. 유방암 환자에서 임상 연구를 진행하기 전에, 그러나, BCS의 다양한 종양 타겟팅 NIRF 이미징 응용의 가능성은 이미 전임상 팬텀을 이용하여 평가할 수있다.

다음 연구 프로토콜은 형광 종양 시뮬레이션 개재물 구 함유 유방 조직 시뮬레이션 팬텀에 NIRF 이미징의 사용을 설명한다. 팬텀은 전 및 수술 중 종양 현지화, 실시간 NIRF 유도 종양 절제술, 절제 상태의 평가 및 잔류 질병의 검출을 시뮬레이션 할 수있는 저렴하고 다양한 도구를 제공합니다. 젤라틴 형 팬텀은 인체 조직과 유사한 탄성 특성을 가지며 기존의 발을 이용하여 절단 할 수있다urgical 악기. 모의 수술 도중 외과 의사는 (만져서 개재물의 경우) 촉각 정보 및 수술 분야의 육안 검사에 의해 안내된다. 또한, 촬상 NIRF 수술의 범위에 실시간 피드백 수술 외과를 제공하기 위해 적용된다.

그것은 NIRF 촬상 형광 염료의 사용을 필요로하는 것이 강조되어야한다. 이상적으로, 형광 염료는 근적외선 스펙트럼 영역에서의 광자 방출하는 표기 (650-900 nm의) 조직 생리 풍부한 분자에 의한 광자의 흡수와 산란을 최소화하는 (예, 헤모글로빈, 지질, 엘라스틴, 콜라겐, 물) 10, 11. 또한, 자기 형광 (즉, 살아있는 세포에서 생화학 적 반응에 의한 조직에서의 극한 형광 활성) 최적 종양 대 백그라운드 비율 11의 결과로, 근적외선 스펙트럼 범위에서 최소화된다. 컨쥬 게이트에 의해 NIRF는 종양 타지에 염료테드 잔기 (예를 들어, 모노클로 날 항체), 형광 염료의 표적 전달이 수술 이미징 애플리케이션에 대해 얻을 수있다.

인간의 눈은 근적외선 스펙트럼 영역의 광 둔감하기 때문에, 고감도 카메라 장치는 촬상 NIRF 요구된다. 수술 용도 NIRF 여러 이미징 시스템 (12)은 지금까지 개발되고있다. 현재의 연구에서, 우리는 사용자 정의 뮌헨 기술 대학과 공동으로 수술 응용 프로그램에 대한 개발 NIRF 이미징 시스템을 구축 사용했다. 시스템은 컬러 이미지 및 형광 화상의 동시 수집을 허용한다. 형광 이미지의 정확도를 향상시키기 위해, 보정 방식은 조직에서의 광 강도의 변화에​​ 대해 구현된다. 상세한 설명은 Themelis 등에 의해 제공된다. 13

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프로토콜

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1 종양 시뮬레이션 흠을 위해 실리콘 금형 만들기

  1. 종양 시뮬레이션 흠, 예를 들면, 구슬 또는 구슬을위한 모델 역할을 할 수 원하는 모양과 크기의 고체 항목을 수집합니다.
  2. 철저하게 종양 모델을 청소합니다. 실리콘 몰드로부터 쉽게 제거를 보장하기 위해, 종양 모델은 안티 - 스틱 스프레이 분무 또는 바셀린 또는 밀랍의 얇은 층으로 피복 될 수있다.
  3. 표면이 매끄러운 별도의 얇은 벽으로 둘러싸인 사각형 (플라스틱) 상자에 각 모델을 놓습니다. 필요한 경우, 위치에 유지 상자의 바닥을 흥분시키는 모델. 실리콘 과도한 양의 낭비를 방지 할 수있는 종양 모델 자체보다 약간 더 큰 상자를 사용합니다.
  4. 믹싱 그릇에 실리콘 성분의 필요한 양을 붓고 10에 실리콘 성분 B를 추가 : 1 중량 비율입니다. 철저하게 두 구성 요소를 섞는다. 선택적으로, 진공 펌프는 실리콘 혼합물로부터 기포를 제거하기 위해 사용될 수있다.
  5. 부드럽게 포기포가 포착되지 않도록 플라스틱 상자에 실리콘 혼합물을 통해 UR. 실리콘 혼합물은 최적의 결과를 얻기 위해 45 분 내에서 처리되어야한다.
  6. 실리콘 혼합물을 금형 절단 및 종양 모델을 제거하기 전에 적어도 6 시간 동안 고화하자. 선택적으로, 실리콘 몰드는 완전히 다시 함께 맞 있도록 지그재그로 절단 할 수있다. 실리콘의 최대 강점은 삼일 후에 얻을 수있다.

2 트리스 완충 생리 식염수 만들기

  1. 6.1 g (50 mM)을 트리스 8.8 g 800 ml의 탈 이온수에 (150 밀리미터)의 NaCl을 추가하여 트리스​​ - 완충 생리 식염수 (TBS) 솔루션을 만듭니다.
  2. 헤모글로빈 (단계 3.3 및 4.4)의 산소를 차단하고 세균의 성장을 억제하는 NaN의 3의 1.0 g (15 밀리몰)를 추가합니다. 주의 : NaN3가 심한 독성이다. 그것은 피부 또는 삼키면 접촉 치명적일 수있다. 이러한 화합물의 독성은 성인 인간에 대한 용해성 알칼리 시안화물 및 치사량의 것과 비교할약 0.7 g이다. 제조사로부터 제공된 항상 안전 지침을 따르십시오.
  3. 7.4으로 pH를 조정하고 탈 이온수로 1,000 ml의 볼륨을 가지고.

3 형광 흠 만들기

  1. 용해 및 용융 젤라틴에 배치 될 때, 형광 색소의 누출을 방지 할 수 개재물 2 단계 젤라틴 (단계 4.2)에 비해 높은 아가의 융점으로부터 50 ML의 TBS에 2g 아가 로스를 추가한다. 선택적으로, 추가 된 아가로 오스의 양은 각각 연질 또는 만져서 종양 개재물을 얻기 위해 하나 또는 3g로 변경 될 수있다.
  2. 끓는점에 도달 할 때까지 마이크로파를 이용하여 아가 로스 슬러리를 가열한다. 아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지 충분히 교반 하였다.
  3. 1.1 g (17 μmol의) 헤모글로빈 및 intralipid 20 %가 주변 유방 팬텀 조직 (4 단계)의 광학 특성을 닮은 일정한 교반 아가로 오스 혼합물에 TBS의 50 ㎖에 녹이고 5 ML을 추가합니다.
  4. (25 20.0 mg의 추가탈 이온수 83.8 ml의 녹색 인도시 아닌 형광 염료의 0.8 μmol의). 염료가 완전히 용해되어 있는지 확인합니다.
  5. 피펫 용액에서 5.0 ml의 혼합물을 아가 로스에 추가 14 μM의 최종 농도를 얻었다. 자신의 최적 농도가 필요한 경우 선택적, ICG 이외 형광 염료가 사용될 수있다.
  6. 부드럽게 주사기 (도 1A)를 사용하여 아가로 뜨거운 혼합물 1 단계에서 생성 된 실리콘 몰드를 채우기. 모든 곰팡이가 작성 될 때까지이 과정을 반복합니다.
  7. 형광 개재물 약 1 시간 동안 RT에서 고화하자. 알루미늄 호일로 전체 금형을 포함하여 빛의 흠을 보호합니다.
  8. 응고 후, 부드럽게 금형을 열고 포함 (그림 1B)를 밖으로 누릅니다. 선택적으로, 포함의 표면에 용융 아가 혼합물의 작은 방울을 적용하는 주사기의 끝을 사용한다. 작은 TU 동일한 위치에이 과정을 여러 번 반복함으로써MOR 박차는 침윤성 종양을 시뮬레이션을 만들 수 있습니다.
  9. 알루미늄 호일에 싸서 빛과 탈수에서 아가로 오스 흠을 보호하고 4 ° C에서 가습 된 저장 용기에 저장합니다.
    NOTE : 공지 된 최적 농도보다 낮거나 높은 형광 염료의 농도를 사용하는 감소 된 형광 신호 강도 모두 결과. 최적의 형광 염료 농도 위에 염료의 농도가 증가함에 따라 신호 강도의 감소는 겉보기 어긋 담금질으로 알려진 현상​​에 기인한다. 최적의 농도를 이용하여, 팬텀에서 형광 염료의 최대 깊이 침투를 평가할 때 필수적이다.

유방 팬텀 만들기 (4)

  1. 원하는 크기와 볼륨, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱 그릇의 유방 팬텀을 만들 수있는 컵 모양의 금형을 얻습니다. 주형은 주형에 부착 젤라틴 형태 않도록 매끄러운 표면을 가져야한다. 몰드 있습니다 volum500 ML의 전자는 충분한 크기의 유방 팬텀을 생성합니다.
  2. 500 ML의 볼륨 가슴 팬텀을 만들려면 500 ML의 TBS (2 단계)에 젤라틴 250 만개의 50g를 추가합니다. 일정하게 교반하면서 50 ° C에 젤라틴 슬러리를 가열.
  3. 젤라틴이 완전히 용해되면, 젤라틴 혼합물을 서서히 냉각하자 온수 조를 이용하여 35 ° C의 일정 온도를 유지한다.
  4. 일정하게 교반하면서, 각각의 조직에서의 광자의 흡수와 산란을 시뮬레이션 5.5 g (85 ​​밀리몰) 소 헤모글로빈, 25 ㎖의 20 % intralipid 추가.
  5. 적어도 1 시간 동안 4 ° C에 컵 모양의 금형을 Prechill. 이어서, 아가 로스 종양 시뮬레이션 포함 (도 1C)의 소정의 깊이에 상당 수준으로 금형 젤라틴 혼합물을 붓는다. 젤라틴 혼합물을 한 시간에 30 분 동안 4 ° C에서 고화 보자.
  6. 응고 후, 표면에 종양 시뮬레이션 형광 아가 포함 위치 팬텀 일시적 작은 바늘 포함을 흥분시키는. 세 종양 시뮬레이션 형광 개재물의 최대까지 단일 유방 점선으로 혼입 될 수있다. 충분한 공간 (최소 5cm)은 개별 종양 시뮬레이션 흠 (그림 1D) 사이에 유지되어야한다.
  7. 굴절 아티팩트들을 생성하지 않고 두 층의 접착을 허용 잔여 몰드 부피 따뜻한 젤라틴 혼합물의 나머지를 붓는다. 몰드에 형광 종양 시뮬레이션 개재물의 위치를​​ 표시한다. 팬텀은 4 ° C에서 O / N을 강화하자.
  8. 일단 응고, 개재물의 임시 고정에 사용되는 바늘을 제거하고 부드럽게 금형 (그림 1E)에서 유방 팬텀을 제거합니다. 알루미늄 호일에 싸서 빛과 탈수에서 유방 팬텀을 보호하고 4 ° C에서 가습 된 저장 용기에 보관합니다.

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도 형광 종양 시뮬레이션 개재물을 함유 유방 팬텀을 생성 순차 단계는 1. 원하는 모양 및 크기의 실리콘 주형을 만든 후, 금형은 주사기 (A)를 사용하여 용융 된 혼합물을 아가로 채워진다. 크기 및 형태를 상이한 종양 시뮬레이션 개재물은 현재 연구 (B)에서 제작 하였다. 이어서, 용융 혼합물을 젤라틴의 얇은 층이 코팅 된 커스터마이즈 나무 유 금형 (C)에 붓는다. 응고 후, 종양 시뮬레이션 흠, 위치 일시적으로 집착하고, 녹인 젤라틴 혼합물 (D)의 다른 층으로 덮여있다. 응고 후, 유방 팬텀은 부드럽게 금형 (E)에서 제거됩니다. 팬텀은 시뮬레이션 다양한 NIRF 이미징 애플리케이션 (F)에 적용 할 수 있습니다.REF = "/ 파일 / ftp_upload / 51,776 / 51776fig1highres.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5 NIRF 카메라 시스템을 설정

  1. 수술 응용 프로그램에 대한 NIRF 카메라 시스템은 유방암 수술 대상 NIRF 영상을 시뮬레이션이 필요합니다. 실시간 수술 NIRF 이미징을위한 몇 가지 NIRF 이미징 시스템은 임상 사용을위한 현재 사용할 수 있습니다. 이들 장치 사이에 어떤 차이가 존재하지만, 그들 모두는 (형광 종양 개재물의 여진 용) 여기 광원 및 방출 광자 검출을위한 고감도 촬상 장치를 포함한다.
  2. 충분한 파장의 여기 광원을 사용하여주십시오. ICG 함유 종양 시뮬레이션 개재물 들어, 750 및 800 nm의 사이에서 광자를 방출하는 여기 광원 (예컨대, 레이저)를 사용한다. 다른 형광 염료가 사용되는 경우, 여기 파장 (MA)를 따르는 조정되어야 nufacturer의 지시.
  3. 경우에 NIRF 카메라 시스템은 원치 않는 신호를 필터링 올바른 필터를 사용하고 있는지 확인하기 위해 방출 필터가 포함되어 있습니다. ICG 함유 종양 시뮬레이션 개재물 들어, 800 및 850 nm의 사이에서 방사 필터를 사용한다. 대체 형광 염료는 제조업체의 지시에 따라 다른 배출 필터를 필요로 할 수있다.
    참고 : 여기 및 과포화 이미지를 방지하기 위해 방출 파장 사이의 제로 중복이 없도록합니다 있는지 확인하십시오. 또한, 영상 획득 시간은 최적의 형광 이미지를 얻기 위해 조정될 수있다. 깊은 장착 형광 개재물 또는 약한 형광 신호의 경우에, 영상 획득 시간 min으로 몇 초를 위해 증가 될 수있다. 표면 흠이나 강한 형광 신호의 경우에, 획득 시간은 실시간 비디오 레이트 형광 이미징을 허용하도록 몇몇 밀리로 감소 될 수있다.
유방암 수술에서 NIRF 이미징 응용 프로그램의 전자 "> 6. 시뮬레이션

  1. 컨테이너에서 조직 시뮬레이션 유방 팬텀을 가지고 평면 비 형광 표면에 놓습니다. 이어서, 종양 시뮬레이션 개재물의 절제를위한 충분한 작동 거리를두고, 유방 팬텀 상기 NIRF 촬상 장치를 배치.
  2. NIRF 이미징 및 / 또는 팬텀 유방의 촉진을 사용하여 종양 시뮬레이션 형광 포함 지역화. 어떠한 형광 신호가 검출 할 수없는 경우에, 포함은 어느 검출 또는 이미지 획득 시간이 증가되어야위한 팬텀에 너무 깊이 위치된다.
  3. 포함 지역화되면, 팬텀 가슴을 절개하고 기존의 수술 도구를 사용하여 실시간 NIRF -지도하에 종양 시뮬레이션 포함을 제거합니다. 또한, 포함은 표준 진료를 시뮬레이션하기 위해 육안 검사 및 유방 팬텀의 촉진에 의해서만 인도는 절개 할 수 있습니다.
  4. 직접 제거 후불충분 절제를 나타내는 남아있는 형광 활동에 대한 종양 시뮬레이션 포함, 이미지 외과 공동의.
  5. 더 형광 신호가 남아 있지 때까지 남아있는 형광 활동의 경우, 직접 NIRF의지도하에 포함 잔해를 절제.
  6. 절개 된 팬텀 조각 이미지 NIRF 유도 거시적 마진 상태 평가를 시뮬레이션 할 수 있습니다. 플라크 따라 5 ㎜ 플라크 및 이미지 - 본원은 3 팬텀 조직 슬라이스. 절제에 도달 형광 신호는 긍정적 인 절제의 존재를 나타냅니다.

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결과

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본 연구의 결과는 이전에 다른 곳에서 구보고되었다.

우리의 데이타는 NIRF 촬상 유방암 환자에서 유방 NIRF 유도 보전 수술 시뮬레이션, 유방 조직 시뮬레이션 팬텀 형광 종양 시뮬레이션 개재물을 검출하도록 적용될 수 있다는 것을 보여준다. 우리의 팬텀 모델을 사용하여, 우리는 실현 가능한 (그림 2) 수술 중 종양 현지화, NIRF 유도 종양 절제 수술 공동 여백의 수술 평가, 잔류 질병의 탐지를 발견했다. 요컨대, 네 팬텀 유방 전체가 모두 별개의 치수 및 / 또는 형태 (표 1)와이 형광체를 함유하는 개재물, 제작했다.

형광 종양 시뮬레이션 개재물은 종래의 수술 도구를 사용하여 상기 제 1 및 제 2 유방 수술 팬텀으로부터 제거 하였다. 개재물의 절제는 촉진 및 운전 방식의 육안 검사에 의해 유도 된필자 필드입니다. 외과 의사가 종양 시뮬...

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토론

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우리는 통합 된 종양 시뮬레이션 흠 유방 모양의 팬텀의 사용을 통해 NIRF 유도 BCS의 잠재적 인 임상 응용 프로그램을 시뮬레이션. 수술 중 종양 현지화, NIRF 유도 종양 절제술, 수술의 범위에 대한 평가, 절제 수술 후 평가는 모든 사용자 지정 빌드 NIRF 카메라 시스템을 사용 가능한 발견되었다. 형광 종양 시뮬레이션 개재물의 비 침습 검출 2cm 이하의 깊이에서 팬텀 조직에 위치 개재물에만 가능 하였다. 수술 중 그러나 제한된 신호 침투 깊이는 주로 외과 오버레이 조직을 절개하여 표면에 가까운 관심 조직을 가지고있는 것 BCS 수술의 특성에 의해 해결되었다.

수술 중 NIRF 이미징은 이온화 방사선의 부족, 기술의 일반적인 안전하고 높은 해상도 9,14 포함하여 몇 가지 중요한 장점을 가지고 있습니다. 또한 techniqUE는 수술의 범위에 관한 의사 대한 실시간 피드백을 제공하며 형광 신호 (13)의보다 정확한 위치 파악을...

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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이 작업은 Jan Kornelis de Cock 재단의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 헤모글로Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The NetherlandsH2500조직 내 광자의 흡수를 시뮬레이션합니다.
Intralipid 20%Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The NetherlandsI141조직 내 광자 산란 시뮬레이션
실리콘 A 반투명 40(2성분 다가addition 실리콘)NedForm, Geleen, 네덜란드패키지는 성분 A와 B로 구성되며 일대일로 혼합되어야 합니다(A:B=10:1).  제조업체 페이지 링크: http://tinyurl.com/ncjq7jx
Gelatine 250 BloomSigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands48724가슴 모양 팬텀의 구성
AgaroseHispanagar, Burgos, Spain종양 시뮬레이션 내포물의 구성
TrisSigma-Aldrich, Zwijndrecht, The NetherlandsT1503 
HClSigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands258148
NaClSigma-Aldrich, Zwijndrecht, The NetherlandsS9888
NaN3Merck, 다름슈타트, 독일822335주의: 심한 독. 이 화합물의 독성은 용해성 알칼리 시안화물의 독성과 비슷하며 성인 인간의 치사량은 약 0.7g입니다.
수술 중 응용을 위한 NIRF 이미징 장치의 예:
T2 NIRF 이미징 플랫폼 SurgVision BV, Heerenveen, 네덜란드현재 연구에 사용된 맞춤형 NIRF 이미징 시스템. 자세한 내용은 www.surgvision.com
Photodynamic EyeHamamatsu Photonics Deutschland GmbH, Herrsching am Ammersee, GermanyPC6100www.iht-ltd.com
FLARE 이미징 시스템 키트The FLARE Foundation Inc, Wayland, MA, USAwww.theflarefoundation.org
FluobeamFluoptics, Grenoble, Francewww.fluoptics.com
Artemis 핸드헬드 카메라Quest Medical Imaging BV, Middenmeer, 네덜란드www.quest-mi.com
수술 중 적용을 위한 NIRF 형광 염료의 예:
Indocyanine greenICG-PULSION,  독일 펠트키르헨PICG0025DE   현재 연구에 사용된 NIRF 이미징을 위한 임상 등급 형광 염료. 자세한 내용은 www.pulsion.com
IRDye 800CW NHS EsterLI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA929-70021www.licor.com
빈 은 에서 확인할 수 있습니다.

참고문헌

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