여기에서 우리는 분리, 식별 및 마우스 흉선 상피 세포 (TEC는) 정화용 효율적인 방법을 설명합니다. 프로토콜은 정상 T 세포의 발달, 흉선 기능 장애, 및 T 세포 재구성을위한 흉선 기능의 연구에 활용 될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
흉선은 T 림프구 개발을위한 중요한 기관이다. T 세포 고집, 긍정적 및 부정적 선택을 선택 : 흉선 간질 세포, 흉선 상피 세포 (TEC는)은 T 세포 발달의 여러 단계에서 특히 중요하다. 그러나, 흉선에서 TEC는의 기능이 불완전하게 이해 상태를 유지합니다. 기사에서는 기계적 중단과 소화 효소의 조합을 사용하여 신선한 마우스 흉선에서 TEC 서브 세트를 분리하는 방법을 제공한다. 방법은 흉선 기질 세포 및 흉선 세포를 효율적으로 세포 - 세포 및 세포 - 세포 외 기질로부터 연결 해제 될 단일 세포 현탁액을 형성 할 수있다. 세포 격리하여, 다중 매개 유동 세포 계측법은 TEC는 수지상 세포의 확인 및 특성화에 적용될 수있다. TEC는가 흉선에서 희귀 세포 집단 때문에, 우리는 또한 풍부하고 흉선 세포, 흉선에서 가장 풍부한 세포 유형을 고갈하여 TEC는 정화 할 수있는 효과적인 방법을 설명한다. FOLLO세포 생존의 상실 TEC는 정제 과정을 최소화 할 수 있도록 날개가 농축, 세포 정렬 시간은 감소 될 수있다. 정제 된 세포는 리얼 타임-PCR, 웨스턴 블롯 및 유전자 발현 프로파일 링 같은 다양한 다운 스트림 분석에 적합하다. 프로토콜은 TEC의 기능 연구뿐만 아니라 시험 관내 T 세포 재구성의 발전을 촉진 할 것이다.
서론
초기 T 세포 개발, 골수 조혈 줄기 세포 유래 다 분화능 전구 세포가 흉선의 피질 모집, T 계보에 대한 약속을 받아야하고 T 세포 전구체 1이된다. 매우 가변적 T 세포 수용체 1 전구 세포의 큰 풀을 형성 피질에서, T 세포 전구체 CD4 및 CD8 더블 네거티브 (DN) 흉선 세포 확장 및 미성숙 CD4 및 CD8 이중 양성 (DP) 흉선 세포로 분화. 만 DP 세포의 선택 MHC 제한 집합은 CD4 또는 CD8 하나의 긍정적 인 (SP) 흉선 세포가 흉선의 수질로 마이그레이션하고, 기능적 능력 성숙 T 세포에 긍정적 인 선택 2 불린다 이벤트를 차별화 6. 반면, 자동 반응 흉선 세포의 클론 부정적인 선택을 받아야하고 자기 공차 규제 T 세포로 변환, 또는 아직 명확하지 않은 목적을 위해 상피내 림프구로 전환, 세포 사멸을 통해 제거 3,7-10.
흉선에서, 흉선 간질 세포는 이러한 다양한 T 세포 발달의 운명 5,11,12에 대한 신호를 제공하는 고유의 미세 환경을 형성한다. 대뇌 피질의 TEC는 (cTECs) 및 수질의 TEC는 (mTECs), 수지상 세포, 대 식세포, 섬유 아세포, 혈관 내피 세포, 신경 크....
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프로토콜
본 연구에서는, 성인 (6 - 8 주) 암컷 C57BL / 6 쥐를 사용 하였다. 마우스는 국립 암 연구소에서 구입 한 특정 병원균이없는 상태에서 유지되었다. 미네소타 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (IACUC)는 모든 동물 실험을 승인했다.
인스 트루먼 트와 버퍼의 1 준비
- 효소 용액을 준비 알부민 풍부한 완충액 (PBS 1X [칼슘 / 마그네슘 2 + 불 함유]와 0.5 % 소 혈청 (0.05 %와 RPMI1640 배지를 Liberase TH의 DNase I 및 100 U / ㎖ [/ w V]) 알부민 및 2 mM의 에틸렌 디아민 테트라 산 [EDTA]), FACS 완충액 (1X PBS [칼슘 / 마그네슘 2 + 불 함유 함유하는 1 % 태아 소 혈청 [FBS] 및 0.02 % NaN3가), 버퍼 정렬 FACS (1X PBS [칼슘 / 마그네슘이 2 + 불 함유] 2 % FBS), RP10 및 배지를 함유하는 (RPMI-1640 배지)는 10 % FBS와 함께 공급된다.
- 10 패닝 접시를 준비합니다. (0.01 ㎎ / ㎖ G 40 ml의 코팅 용액을 준비귀....
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결과
수득 된 세포 현탁액은 흉선 세포, 조혈 유래 기질 세포 및 비 - 조혈 기질 세포로 구성 3 절에서 설명한 바와 같이이 프로토콜을 사용하여, 흉선 오르간 성인 마우스 (섹션 2) 및 흉선 세포 현탁액으로부터 제거 제조 하였다. CD45는 조혈 팬 마커가 흉선 세포 및 대 식세포와 수지상 세포로 조혈 기질 세포 모두에서 발현이다. 반면, TEC는 조혈 기원하지 않으며 CD45 15을 표명하지 아니합니다. 제 4 절에 설명 된대로 세포 염색 및 유세포 분석을 실시 하였다.
TEC 서브 세트, 및 cTECs mTECs 두 가지 유형, 공통 쌍 유력한 TEC 전구체 (15)로부터 유래. 두 cTECs 및 mTECs는면 (28)에는 EpCAM 분자를 표현한다. 따라서 TEC는는는 EpCAM 양성 및 CD45 음성 유동 세포 계측법에 의해 (그림 2A)에 따라 문이 될 수있다. cTECs 및 mT.......
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토론
프로토콜에서 중요한 단계는 흉선 간질 세포 (섹션 3)의 준비와 TEC는의 농축 (4 절)입니다. 이 적극 신선한 효소 용액마다 준비하고, 조직이 가능한 한 빨리 처리하는 것이 좋다. 풀링 thymi 들어, 효소 용액의 부피를 최적화 thymi의 수에 따라 요구된다. 모든 조직 잔사 처리 후에 남아 있으면, 더 효소액 및 배양 시간의 연장을 첨가하여 세포 수율을 증가시킬 수있다. TEC는의 농축, 상층 액의 수집을 완료하고 세포의 손실을 감소 5.3 절에 설명 된 판 린스를 반복하는 동안.
1980 년, Wekerle 등. 완전 세포 내 소포 내에서 많은 가능한 림프 세포를 감싸 큰 대뇌 피질 상피 세포 아르 "흉선 간호사 세포"(다국적 기업) 33 - 첫번째 TEC는 유형을보고했다. 1982 년 Kyewski 카플란은 다양한 격리 응축 설명초국적 34의 수율에 영향을 itions. 최근 다카 하마와 동.......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 (KAH에) 건강 그랜트 R01 AI088209 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 또한 미네소타 유동 세포 계측법 자원의 대학 감사합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 안티-마우스 EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| 안티-마우스 MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| 안티-마우스 Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| 플로우 사이토미터 | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| 플로우 셀 분류기 | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS 튜브 | BD Biosciences | 352052 | |
| 유세포 분석 소프트웨어 | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX는 형광 색소에 따라 다르고 YY는 바이알 크기에 따라 다릅니다. |
참고문헌
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. ....
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