방법 논문

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

DOI:

10.3791/51792

⸱

2014년 9월 20일

 , 
1Department of Biology, Indiana University

이 논문에서

요약

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초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

초록

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후 배아 초파리에서 개발, 초파리의 중요한 부분은 가상적인 디스크라고 불리는 주머니 같은 구조의 집합 내에서 일어난다. 이러한 디스크는 성인 플라이 내에 발견되는 성인 구조물의 높은 비율을 야기. 여기에서 우리는이 디스크를 복구하고 항체, 전사 기자 단백질 트랩과 분석을 준비하기 위해 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 가장 가상적인 디스크 등 얇은 조직에 적합하지만, 용이하게 애벌레 및 성인 뇌 난소 조직과 같이 두꺼운 용도 변경 될 수있다. 서면 프로토콜과 함께 제공되는 동영상은 세번째 령 유충, 조직의 고정 및 항체, 상상 디스크 치료의 절개를 통해 독자 / 시청자를 안내합니다. 프로토콜은 또한 이하의 제 1 및 제 2 령 유충으로부터 가상적인 디스크를 해부하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜의 장점은 상대적으로 짧은 것을이며 수있다해부 조직의 높은 품질의 보존을 위해 최적화 도중에. 또 다른 장점은 사용되는 고정 절차가 초파리 단백질을 인식하는 항체의 압도적 인 숫자로 잘 작동한다는 것입니다. 우리의 경험에 의하면,이 절차를 잘 작동하지 않는 민감한 항체의 매우 작은 수는있다. 이러한 상황에서, 치료는 우리가 해부 단계와 항체 배양을 위해 규정 한 가이드 라인을 따라 계속하는 동안 다른 고정 칵테일을 사용하는 것으로 나타납니다.

서론

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한 세기 이상 초파리, 초파리의 경우, 개발, 행동과 생리학을 연구하는 최고의 시스템이다. 후자의 촬영 장소의 대부분과 배아 및 사후 배아 단층 상피 내에서 가상적인 디스크 1-3 전화 : 파리의 개발은 크게 두 단계로 나눌 수 있습니다. 가상적인 디스크의 그림은 첫번째 곤충 개발 한 그의 광범위한 논문의 일부가 오는 8 월 Weismann에 의해 1864 년에 출판되었다. 이러한 디스크는 1-14 플라이 성인에서 발견되는 성인 구조물의 높은 비율을 야기 궁극적으로 조기 번데기 단계 대규모 histolysis 생존하고, 유생 단계 동안 패턴 화되고, 배아 발생 동안 그들의 발전을 시작한다. 애벌레 개발 과정에서 각 디스크의 운명, 모양과 크기에 관한 몇 가지 중요한 결정을합니다. 제 1 및 제 2 령 유충 내 디스크는 일차 운명을 취 establis을 주어 아르정확한 형상을 채용하고 15-16 세포의 필요한 수를 생성 구획 경계 힝. 셋째 애벌레 령 초 전 번데기의 단계에서, 상상 디스크는 계속 분열 및 세포가 자신의 단말기 운명 16을 채택으로 패턴 화되어있다.

초파리 발달 ....

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프로토콜

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애벌레의 1 준비

  1. 해부 버퍼 35mm 페트리 접시를 채 웁니다.
  2. 페트리 접시에 유충을 배치하고 몇 분 (자동 세척 단계) 주위에 수영을 할 수 있습니다.
  3. 실리콘 기반의 해부 접시에 해부 버퍼 풀에 유충을 전송합니다. 이 풀은 판의 한 가장자리에 있어야합니다. 해부 판 유리 페트리 접시 내에 부어 경화 된 실리콘 용액 이루어져있다.
  4. 파스퇴르 피펫을 사용하여-, 박리 판의 중간에 박리 완충액 큰 풀을 배치.
  5. # 5 집게를 사용하여 절개 버퍼의 큰 풀에 작은 수영장에서 단일 청소 유충을 전송합니다.

유충의 2 거친 해부

  1. 유충은 해부 버퍼의 대형 수영장 내에있는 동안 집게로 유충을 걸쇠. 포셉의 다른 쌍 ANIM을 보유하는 데 사용되는 동안 집게 한 쌍의 입 후크를 잡기 위해 사용되어야한다알은 여전히​​ (3 분의 몸 길이의 부드럽게 유충을 잡아).
  2. 신속 포셉 번째 쌍 얻어 신체의 나머지 부분을 당기는 동안 입 후크 근처 표피를 함유하는 핀셋의 쌍을 고정하거나.
  3. 유충이 뿔뿔이하기 시작하면 당신은 긴장에 약간의 방출을 느낄 것이다. 포셉에서 유충을 해제하고 밖으로 유출하는 유충의 "용기"를 할....

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결과

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확실히 상술 된 방법은 인 시츄 프로브, 전사 리포터 단백질 트랩과 함께 항체의 분석을위한 높은 품질의 재료를 생성한다. 그림 1에서 우리는 정기적으로이 방법으로 회수 눈 안테나, 생식기, 날개, haltere과 다리 디스크를 표시합니다. 이러한 디스크는 F-액틴에 결합하기 때문에 각각의 셀을 설명 phalloidin - 복합 형광 물질로 처리되어있다. 조직은 다음 제대로 눈 디스크의 형태 형성 고랑 고정 된 경우, 동심 조직의 가장자리는 생식기, 더듬이와 다리 디스크에 주름 및 날개와 haltere 디스크의 지느러미 - 복부 축이 모두 같은 날카로운 모서리를 나타납니다 . 조직이 제대로하고 고정되어있는 경우 항체, 형광 단백질과 현장 프로브에 또한 날카로운 패턴을 발표 할 예정이다. 몇 가지 예는 그림 2에 나타내었다. 동안 다른 항체로 염색 한 상위 3 패널 디스플레이 디스크를아래 세 개의 패널은 GFP는 세포의 인.......

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토론

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이 절차는 크게 분리 눈길 더듬이 디스크의 후속 처리에 초점을 맞추고 있지만, 그것을 분리하고 날개 haltere, 다리 및 생식기 디스크 (도 4)을 분석하는데 사용되는 의무가있다. (눈 더듬이 디스크와는 대조적으로) 이러한 디스크를 분리하는 프로토콜의 유일한 필수 변형 조대 해부 (프로토콜의 섹션 2)의 방법이다. 제 흉추 레그 (T1) 쌍 유충의 앞쪽에서 발견되어 눈길 더듬이 디스크 절연을위한 프로토콜에 따라 회수 할 수있다. 그러나 두번째 가슴 다리 (T2) 디스크는 표피에 부착된다. 집게의 또 다른 한 쌍의 동물의 복부 표피를 걸쇠에 사용하는 동안 위에서 설명한대로 집게 한 쌍의 입 후크를 보유하는 데 사용되어야한다 이러한 디스크를 분리하기 위해 (에서 유충에 대한 3 분의 걸쇠해야합니다 입 후크. 유충은 단순히 LAR의 나머지 부분에서 떨어져 복부 표피를 찢어 필렛 할 수 있습니다버지니아. T2 다리는 표피에 부착 된 상태로 유지됩니다. 셋째 흉추 (T3)는 다리에 부착 된 표피 자체 .......

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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우리는 JPK에게 원래의 가상적인 디스크 해부 절차를 가르치는 도널드 준비와 케빈 모세에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 그림 1B의 성기 디스크와 그림 3 그림 2A, 브랜든 Weasner의 눈 디스크의 보니 Weasner 감사 플라이 얼룩에 대한 블루밍턴 초파리 주식 센터 및 항체 발달 연구 하이 브리 도마 은행. CMS는 건강 (NIH) GCMS 교육 그랜트의 국립 연구소 (T32-GM007757), 프랭크 W. 퍼트 냄 연구 활동, 그리고 로버트 브릭스 연구 활동에서 장학금으로 지원하고있다. JPK는 국립 안과 연구소의 연구비 지원 (R01 EY014863)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트Dow Corning184 SIL ELAST KIT 0.5 KG해부 플레이트의 기초를 만드는 데 사용
Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mmDow Corning3160-152CO해부 플레이트
# 5 해부 집게Ted Pella525집게는 매우 날카롭게 유지해야합니다
9 잘 시계 유리Vairous Vendors상상 디스크 복합체의 고정에 사용
: 50 ml Erlenmeyer 플라스크, 다양한 공급 업체,업체
삼각 플라스크에 들어갈 수있을만큼 작음
다양한 공급 업체
벤치 탑 로테이터다양한 공급 업체100 &# 956; l 부피는 낮은 설정에서 튀지 않아야합니다
파라 포름 알데히드Macron Chemicals2-26555-1고정액 역할
산 나트륨 MonobasicSigma Chemical CoS-3139해부 및 세척 버퍼를 만드는 데 사용
Sodium Phosphate DibasicSigma Chemical Co71636해부 및 세척 버퍼를 만드는 데 사용
LysineAcros Organics125221000고정액
Sodium PeriodateSigma Chemical CoS-1878사용 고정액
Triton X-100EMD ChemicalsMTX1568-1가상 디스크 천공에 사용
수산화나트륨EM ScienceSX0593-3파라 포름 알데히드
100 % 일반 염소 혈청Jackson Laboratories005-000-121을 용해하는 데 사용차단 용액으로 작용
1차 항체다양한 공급업체는 제조업체의 지시에 따라 10% 염소 혈청으로 희석
2차 항체다양한 공급업체는 제조업체의 지시에 따라 10% 염소 혈청으로 희석
VectashieldMolecular ProbesH-1000샘플의 표백 방지
현미경 슬라이드Fischer Scientific48312-003
유리 커버 슬립 18 x 18 mmFischer Scientific12-542A
Kimwipe 티슈다양한 공급 업체유리 슬라이드가 실리콘베이스에 부착되는 것을 방지
Panit Brush 000다양한 공급 업체샘플에 커버 슬립을 부드럽게 내리는 데 사용합니다
다양한 공급 , 50 ml 원뿔형 튜브, 다양한 공급 업체 1.5 ml 마이크로 배식 튜브, 다양한 공급 업체, 용도에 따라 투명 또는 어둡게, 마이크로 배식 랙 을합니다 인에 .

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
  2. Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).

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재인쇄 및 허가

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