C. elegans의는 일반적으로 고체 한천 플레이트에 성장 또는 액체 문화에서 E. 씨앗을 품고있다 대장균. 독성 및 영양 연구를 혼동에서 세균의 부산물을 방지하기 위해, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램의 범위에 대한 웜의 수가 증가하고 동기화, 무균 액체 배지, CeHR을 이용했다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜에서는, 우리는 필요한 자료를 제시하고 수정 C를 만들기위한 절차. 전자 legans 요법 이니 및 재생 미디어 (mCeHR). 또한, C.를 노출하고 순응하는 단계 E. 성장 엘레 액체 매체를 무균하는 대장균이 설명되어 있습니다. 무균 C.를 활용 마지막으로, 하류 실험 엘레이 절차의 장점을 설명한다. C.를 분석하고 결정하는 능력 엘레 영양소의 요구 사항은 다양한 헴 농도와 무균 액체 미디어에 N2 야생 형 웜 성장에 의해 설명되었다. 이 절차는 웜의 성장과 발전을위한 최적 농도를 결정하거나, 약물 치료의 독성 학적 효과를 결정하기 위해 다른 영양소와 함께 복제 할 수 있습니다. 야생 형 웜의 성장에 대한 다양한 헴 농도의 효과는 질적 현미경 관찰을 통해 T를 정량 측정 하였다각 헴 농도에서 성장 웜 그는 수. 또, 다양한 영양소 농도의 효과는 또한 영양소의 변화에 대응 형광 센서를 표현 웜을 이용하여 정량 할 수있다. 또한, 웜의 다수 용이 미립자 포격을 사용하여 트랜스 제닉 C. elegans의 생성을 위해 제작 하였다.
서론
토양 선충은 예쁜 꼬마 선충은 독극물에 유전학에서 많은 연구에 사용되는 강력한 모델 생물이다. 그 1mm 크기, 사일, 배양 용이성의 신속한 생성 시간 및 큰 자손 번호 따라서 이러한 선충 유전자 및 약리학 화면 1, 2의 호에 이용되어왔다. 연구팀은 척추 시스템에서 보존 분자 경로를 식별하기 위해이 웜을 활용. 이러한 경로는 세포 죽음 신호, 노화 및 대사 경로, 신경계 3-6 (가) 있습니다. 또한, C.의 투명성 엘레 직접 유전자 발현 패턴과 단백질의 현지화를 분석하기 위해 시각화 할 수있는 형광 단백질 기자를 사용하여 유전자 변형 라인의 생성 할 수 있습니다.
많은 연구에서이 선충은 선충의 성장 배지 (NGM) 판을 사용하여 고체 한천 기반 표면 또는 L에서 배양iquid 문화는 음식 소스 7,8로 대장균 시드. 이러한 세균의 음식 소스는 부산물 결과의 해석에 영향을 미치는 세균의 간섭과 생화학 및 독성학 연구를 혼동 할 수 있습니다. , C. 이러한 배합 효과를 피하기 위하여 엘레 음식 소스로 세균없는 상태입니다 무균 액체 매체에서 배양 할 수있다. 이 미디어를 사용하여, 우리는 성공적으로 많은 표준 C에 대한 높은 동기 웜의 수백만을 배양 C.에 차등 규제 유전자의 마이크로 어레이 분석을 포함한 엘레 프로토콜 엘레 다른 헴 농도에 노출, 및 유전자 폭격을 이용한 형질 전환 웜의 제작. 이 매체는 화학적으로 박사 에릭 클레 9 공식화 원래 레시피에서 수정됩니다. 이 mCeHR 미디어를 사용하여, 우리는 성공적으로 헴 항상성에 관여하는 유전자를 발견했습니다, 10 (HRG의)와 같은 헴 반응 유전자를 언급하는 것E. 시드 NGM 한천 플레이트를 사용 정규 성장 조건에서 불가능했다 대장균.
이 프로토콜에서 우리는 C.를 도입하고 유지하기위한 절차를 설명 E. 성장 엘레 콜라이 무균 mCeHR 및 트랜스 제닉 C. 제조 웜의 다수를 구하는 방법이 활용 미세 충격을 사용하여 엘레 라인. C.의 영양 소요량을 결정하기위한 무균 매체 사용의 실용성을 보여 우리 또한 본 연구 엘레 예로 헴을 사용. 이러한 연구는 mCeHR 매체를 사용하여 C. 다수의 급속한 성장을 허용한다는 것을 보여 웜 연구자에 의해 사용 많은 다운 스트림 애플리케이션을위한 엘레.
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프로토콜
1. 웜 변종
- C. 구하는 엘레은 Caenorhabditis의 유전학 센터 (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc)에서 브리스톨 N2 균주를 야생형과 NGM 플레이트에 그들을 유지 E. 시드 대장균 균주 OP50 7. 참고 : 유전자 변형 웜은 IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) 이전 11 기술로 활용이 생성 된 종자는. IQ6011는 해당 저자의 요청하실 수 있습니다.
수정 C. 2. 준비 엘레 해비 및 재생 매체 (mCeHR)
12 아래에 설명 된대로 mCeHR 액체 매체를 준비합니다. 이 무균 액체 매체는 벌레가 추가 음식 소스없이 증가 할 수 있습니다. 이러한 층류 후드로 엄격히 멸균 조건을 사용하여 무균 액체 매질 및 무균 벌레의 모든 조작을 수행한다.
- 식료품 점에서 매우 저온 살균 무 지방 우유를 얻습니다. 냉장 프로를 사용덕트 아닌 실온 품. mCeHR 매체 행진에 판 한천 뇌 심장 주입 (BHI)에 우유를 사용하고 무균 상태를 확인하기 위해 30 ° C, 37 ° C에서 3 일 동안 배양하기 전에. -80 ° C에서 50 ㎖ 멸균 튜브 및 저장소에 우유를 이동
- 다음과 같은 구성 요소를 각각 준비하고 순서와 mCeHR 1 L를 준비하기 위해 주어진 양 (표 1A)의 결합 : 2 mM의 콜린 이산 구연산 10 ㎖, 비타민과 성장 인자 믹스 10 ㎖ (표 1B의 레시피 참조) 2.4 MM의 미오 - 이노시톨 10 ㎖, 10 ㎖의 2 mM의 헤민 클로라이드, 탈 이온수 250 ㎖. 0.22 μm의 필터 장치를 통해 흡입하고 필터를 적용합니다.
- 핵산 혼합물을 20 ㎖ (표 1c에 레시피), 미네랄 믹스 100 ㎖ (표 1d에 레시피), 170 ㎎ / ㎖ 락트 알부민 가수 분해물 20 ㎖의 필수 아미노산을 20 ㎖, 비 필수 아미노산 10 ㎖를 추가 산, 450 mM의 KH 2 PO 4 20 ㎖,1.45 M D-글루코스, 1 M HEPES 10 ㎖, 나트륨 염, 250 ㎖의 탈 이온수 50 ㎖.
- 구성 요소를 살균 필터링 흡입을 적용합니다. 필터를 제거하고 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤의 1 ML을 추가합니다. 미디어의 pH는 약 6-6.5 있는지 확인합니다. 참고 :이 솔루션은 최대 1 년 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 사용하기 전에 mCeHR 매체에 20 % (V / V) 매우 저온 살균 유기 탈지 우유를 추가합니다. 우유를 열고 분취 때 (층류 후드 예를 들면) 양심적으로 멸균 기술을 사용합니다. 4 ℃에서 미디어를 저장
3. C.에게 준비 무균 mCeHR 액체 배지에서 문화 엘레
- 많은 임신하는 웜과 OP50 E. 최소한의 양이 될 때까지 열 60mm NGM 플레이트에 벌레를 성장 접시에 대장균.
- M9 버퍼 (표 1 층에있는 레시피) 5 ㎖로 세척하여 각 판에서 벌레를 제거하고 50 ML 원뿔 튜브에 결합한다.
- s의 벌레를 허용ettle 5 ~ 10 분 동안 서 튜브를 남겨 조심스럽게 E.를 포함 뜨는을 제거 대장균.
- 반복 절차를 계속 진행하기 전에 가능한 잔여 박테리아의 많은을 제거하기 위해 3.2 및 3.3 배 단계를 반복합니다.
- 세의 배수 부피 0.1 N 염화나트륨있는 웜에 resuspend 예컨대 1.5 ㎖, 3 ㎖ 또는 10 ㎖를되는 개별 웜 튜브에서 볼 수있다.
- 5 N NaOH를 5 % 차아 염소산 나트륨 웜 현탁액 1시 2분 6초 비율 (표백) 용액을 첨가함으로써 웜 표백. 예를 들어, 1 ml의 5 N NaOH를 2 ml의 5 % 차아 염소산 나트륨 : 웜 현탁액 6 ㎖. 웜 현탁액에 추가하기 전에 수산화 나트륨과 표백제를 혼합.
- 소용돌이 솔루션을 적극적으로 임신하는 웜이 용해 될 때까지 만 계란 서스펜션 (약 5 ~ 10 분) 내에서 볼 수 있습니다. 10X 대물 렌즈와 위상차 현미경을 사용하여 프로세스를 모니터링.
- 벌레가 완전히 용해 된 후, 즉시 펠렛계란 45 초 동안 800 XG에 4 ° C에서 뜨는을 제거하고 4 ℃에서 45 초 동안 800 XG에서 펠렛을 원심 분리하여 멸균 물 10 ㎖로 두 번 펠릿을 씻어
- 표백 후, 100 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린 보충 mCeHR 미디어 10 ㎖를 포함하는 25cm 2 조직 문화 플라스크에 계란 펠렛을 전송합니다. 무균 기술을 사용하여이 절차를 수행합니다. 원하는 경우, 무균 액체 배양에서 박테리아의 성장을 방지하기 위해, 250 ㎍ / ㎖의 날 리딕 산 등 추가적인 항균제를 추가한다.
- 약 70 rpm으로 진탕 배양기에서 20 ° C에서 액체 문화를 품다.
- 개발 단계 및 성장 속도에 유의 매일 벌레를 확인합니다.
참고 : 웜은 처음에 천천히 성장하고 임신하는가 7 10 일이다이 필요합니다. 벌레가 액체 매질에 순응 그러나, 생성 시간은 야생형 (N2) 웜 약로부터 4 일 감소합니다. - 벌레는 deve을이 후원뿔 튜브에 웜 문화를 전송하고 스윙 버킷 로터를 사용하여 4 ° C에서 5 분 800 XG에 벌레를 펠렛, 액체 매체에서 임신하는 단계로 loped.
- 뜨는을 제거하고 부드럽게 0.1 M의 NaCl의 동일한 볼륨 웜 펠렛을 재현 탁. 예를 들어, mCeHR 10 ㎖에서 배양 벌레를 0.1 M의 NaCl 10 ㎖를 사용합니다. 벌레가 얼음에 5 분 동안 정착 할 수 있습니다.
- 3.5-3.8 단계에서 전술 한 바와 같이 표백 절차를 수행하고, 웜 무균 액체 매질에 2 대째 성장하는 것을 허용한다. 필요한 경우, 세균의 성장을 억제하기 위해 다시 항생제를 추가합니다.
- 다시 동기화 인구를 생산하는 단계 3.5-3.8에 설명 된대로 다시 표백 단계 3.12 및 3.13에 설명 된대로 다음 0.1 M의 NaCl에 벌레를 펠렛 및 재현 탁 웜은 임신이 될 수 있습니다. 지금부터 항생제없이 액체 매체의 L1 애벌레 벌레를 성장.
액체에서 4. 동기화 웜문화
- 펠렛 및 단계 3.12 및 3.13에서 상술 한 바와 같이 0.1 M의 NaCl에있는 벌레를 재현 탁. 단계 3.5-3.8에서 상술 한 바와 같이 블리치.
- M9 버퍼 10 ㎖에 계란 펠렛을 재현 탁하고 유충이 회전 플랫폼 통에 20 ° C에서 O / N을 부화 할 수 있습니다. 참고 : 계란 L1 애벌레로 부화하지만, 추가로 개발하지 않을 것이다, L1 단계에서 벌레를 동기화.
- 유지 및 배양 웜, 5 분 800 XG에 펠릿 L1 유충, 다음 10 mCeHR ml의 25cm 2 플라스크로 전송의 유충을 재현 탁합니다. 벌레가 회전 플랫폼에서 20 ° C로 증가 할 수 있습니다. 벌레에 충분한 영양을 보장하기 위해 3000 웜 / ㎖ / ㎠의 최대 밀도를 유지한다.
주의 :이 단계에서, 항생 물질이 절차는 층류 후드에서 무균 기술을 사용하여 수행 될 때 무균 상태를 유지하기 위해 요구되지 않는다. 웜은 성장을 모니터링하기 위해 매일 점검해야한다.
5. 무료무균 중간 문화에 대한 쌩쌩 및 해동 웜
- 무균 비동기 웜 문화 또는 액체 질소에 동기화 L1 유충을 동결. 5 분 800 XG에 펠렛 웜은 각각의 병에 대한 0.5 ㎖를 사용하여 S 버퍼 (6.45 mM의 KHPO 4, 43.55 mM의 KHPO 4, 146.25 mM의 염화나트륨)을 재현 탁. 각각의 병에 30 % V / V 글리세롤과 S 버퍼의 동일한 볼륨을 추가 및 액체 N 2의 장기 보관하기 전에 -80 ° C로 웜을 전송합니다. 각각의 병에 ML 당 약 1 × 10 6 벌레를 동결.
- 거의 모든 얼음이 녹을 때까지 약 2 분 동안 37 ° C에서 튜브를 배양하여 벌레를 해동. 층류 후드에서 mCeHR을 포함하는 멸균 플라스크에 웜을 전송하고 20 ℃에서 그들을 배치
6. mCeHR의 성장과 재생에 헤민 농도의 효과를 결정
- C.의 영양소에 의존 성장을 검정 무균 mCeHR 미디어를 사용 엘레. 효과 (을)를 확인하려면벌레의 성장과 발전에 F 헤민 농도는 무균 N2 웜 또는 관심의 다른 변종을 동기화 사용합니다. 4 장에서 상술 한 바와 같이 L1 애벌레를 동기화합니다.
- 다음 날, 펠릿 및 동기화 L1 애벌레를 계산하고 무균 미디어 μL 당 1 웜에 희석에. 0.3 M NH 4 OH 10 ㎜ 헤민 염화을 확인하고 진한 염산을 사용하여 pH를 8로 조정합니다.
- 24 웰 플레이트에 mCeHR 매체 800 μl를 추가합니다. 미디어의 100 ㎕를 각 웰에 100 벌레를 추가합니다. 0 μM에서 1.5 μM 세중 1,000 μM까지의 농도로 각 웰에 헤민 염화을 추가합니다. 모든 우물이 0.3 M NH 4 OH의 동일한 농도가 포함되어 있는지 확인합니다. 조심스럽게 100 L1 유충이 각 웰에 첨가되는 것을 보장하기 위해 피펫 팅 전에 벌레를 재현 탁.
- 매일 벌레를 검사하고 각 웰의 각 농도의 성장을 확인합니다. 배양 9 일 후에 벌레의 수를 계산하고 각 헴에 해당하는 웜 / ㎖의 수를 음모농도 (그림 1).
헴 센서 웜에 헤민 농도의 7. 효과
- 4를 포함 mCeHR에 동기화 L1 헴 센서 웜 (Phrg-1 :: GFP)을 품다 μM, 13 μM, 10 μM, 20 μM 헤민.
- 형광 공 초점 현미경, 48 시간 포스트 배양 (그림 2)를 사용하여 이미지 웜.
8. 형질 전환 C.를 생성 할 mCeHR 활용 엘레 미세 사격을 사용하여
참고 : 그림 3 (13)에 설명되어 생성 및 UNC-119 (ED3) mCeHR에서 자란 벌레를 사용하여 미세 충격을 수행하기위한 절차를.
- 웜 준비
- 175cm 2 플라스크 일주 전에 폭격에 mCeHR 미디어의 90 ㎖에 약 1 × 10 6 비동기 UNC-119 (ED3) 웜을 전송합니다. 벌레가 20 ° C의 O로 성장 할 수 있도록 허용NA는 70 분당 회전 수 (그림 3-1) ~에 플랫폼을 흔들어.
참고 : 일주일 후, 벌레 밀도가 많은 성인 임신하는 벌레와 상당히 커야합니다. 약 3 × 10 7 웜은 미세 충격에 필요합니다. - 칠 JM109 E. 대장균 얼음에 10cm의 NGM 플레이트 시드.
- 두 50 ML 원뿔 튜브에 무균 웜을 전송하고 2 분 동안 800 XG에서 벌레를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 M9 버퍼 (그림 3-2) 50 ㎖에 각 관 벌레를 재현 탁.
- 어른 벌레가 얼음에 10 ~ 15 분 동안 중력에 의해 펠릿 할 수 있습니다.
참고 : 2 ㎖ 펠릿은 지금> 90 %의 성인 벌레를 포함해야합니다. 이 2 ㎖ 펠릿은 약 5 × 10 6 웜이 하나의 미세 충격에 충분해야합니다. - 코트는 냉장 JM109의 전체 표면은 웜의 2 ㎖ 펠릿과 NGM 플레이트를 시드. 완전히 흡수 될 수있는 액체가 다음 판을 남길 수 있습니다(그림 3-3)를 진행하기 전에 얼음에 30 분.
- 175cm 2 플라스크 일주 전에 폭격에 mCeHR 미디어의 90 ㎖에 약 1 × 10 6 비동기 UNC-119 (ED3) 웜을 전송합니다. 벌레가 20 ° C의 O로 성장 할 수 있도록 허용NA는 70 분당 회전 수 (그림 3-1) ~에 플랫폼을 흔들어.
- 금 입자의 제조
- 실리콘 처리 microcentrifuge 관에 금 입자의 30 밀리그램 무게. 1 ㎖의 70 % 에탄올을 추가하고 5 분 동안 튜브를 소용돌이.
- 관은 금 입자를 펠렛 10 초 동안 6,000 XG에서 원심 분리 한 후, 15 분 동안 앉아 수 있습니다. 주의 깊게 금 입자에 튜브 반대의 측면에 끝을 터치하여 피펫 팁을 사용하여 상층 액을 제거합니다.
- 1 분 동안 멸균 물 1 ㎖, 소용돌이와 금 입자를 세척하고 짧게 10 초 동안 6,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 다음 멸균 50 % 글리세롤 0.5 ㎖에 금 입자를 재현 탁, 두 번 세척 단계를 반복합니다.
참고 : 금 입자의 최종 농도는 60 ㎎ / ㎖이있을 것이고, 4 ℃에서 1~2개월 저장할 수 있습니다
- DNA - 금 입자 믹스를 준비합니다
- 10 &으로 원하는 플라스미드 DNA의 10 μg을 결합# 956; 실리콘 처리 1.5 ML microcentrifuge 관에서 UNC-119 구조 플라스미드의 g. DI 물 50 μL 잘 재현 탁 금 입자 용액 1 분 후 소용돌이의 100 μl를 추가합니다.
- 2.5 M 염화칼슘 150 μl를 추가하고 1 분 동안 솔루션을 다시 소용돌이. 이 용액에 3 ~ 5 분 동안 0.1 M 스퍼 미딘과 소용돌이의 60 μl를 추가합니다.
- 펄스는 10 초 동안 6,000 XG에서 솔루션을 원심 분리, 상층 액을 제거하고 70 % 에탄올 300 μl를 추가합니다. 소용돌이 아니라 1 분 동안 6,000 XG에 펄스 원심 분리기는, 100 % 에탄올 170 μL에 뜨는에 resuspend를 제거합니다. 적극적으로 5 ~ 10 분 후 원심 분리기를 펄스와 뜨는을 제거하기위한 솔루션을 소용돌이.
- 사격 (그림 3-3)
주 :이 프로토콜은 자재 / 장비의 표에 지정된 입자 전달 시스템으로 수행된다. 사용할 수있는 입자 전달 기기에 대한 지침을 따르십시오.- <리> 15cm 접시에 조직의 용지를 넣습니다. 핀셋을 사용하여, 각각 100 % 에탄올에 일곱 macrocarriers을 찍어 건조 조직에 그들을 배치.
- 철저하게 70 % 에탄올로 biolistic 실, 마크로 캐리어 홀더 및 대상 플레이트를 청소합니다. 깨끗하고 각각의 폭격 절차 이전에 정지 화면을 압력솥.
- 좌석 도구를 사용하여 홀더에 핀셋과 프레스를 사용하여 홀더에 macrocarrriers를 넣습니다.
- 균등하게 각 마크로 캐리어의 중심에있는 DNA 코팅 된 금 입자의 20 μl를 확산하고 용액이 완전히 건조 할 수 있습니다.
- 에탄올 압력 분배의 두 부분을 청소하고 에탄올 청소 파열 디스크를 조립합니다. 사격 실에 조립 된 압력 분배기 및 파열 디스크를 고정합니다.
- 마크로 캐리어 홀더 멸균 정지 화면을 조립하고 금속 필요한 선반과 장소에 잠금에 장치를 배치합니다.
- 조립 MACR를 삽입ocarrier 압력 분배기 아래에 할당 된 슬롯에 biolistic 실에 장치 및 압력주기에 맞 춥니 다.
- 표적 판 선반 위에 벌레와 오픈 NGM 플레이트를 테이프와 실의 문을 닫습니다.
- , 웜 도배 파열 디스크를 파괴하는 데 필요한 그에게 압력을 조정합니다. , 수은 압력 28 인치에 진공을 켭니다 디스크가 파열 될 때까지 화재 버튼을 누릅니다.
- 진공을 해제하고 장치에서 NGM 플레이트를 제거합니다. 접시에서 벌레를 씻어 JM109 E. 시드 스물 10cm의 NGM 플레이트에 다시 배포 대장균 (그림 3-4).
- 벌레가 25 ° C에 최대 10 내지 14 일 동안 성장하고 판을 굶어 수 있습니다. UNC-119의 결함에서 구출 웜은 보통 운동을하고이 시간에 식별 할 수 있습니다. 이러한 독립적 인 유전자 변형 라인 (Figur를 대표로 추가 분석을 위해 별도의 플레이트에서 적어도 10 "야생형"벌레를 선택전자 3-5).
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결과
C.를 배양 E.에 의해 생산 차 대사 산물의 간섭없이, 웜에 필요한 영양소의 결정에 무균 액체 배지 에이즈 엘레 대장균. 야생형 N2 웜은 세 세대 내 mCeHR 미디어에 순응하고 NGM 박테리아 접시에서 자란 벌레에 비해 성장을 보여줍니다. 사실, 이러한 웜은 OP50 박테리아 성장 웜 3.5 일에 비해 4 일 안에 임신하는이된다.
mCeHR 사용의 한 가지 이점은이 웜 (14)의 정확한 영양 요구를 조사 연구에서 관찰되었다. 그림 1 웜은 mCeHR 1 ㎜까지, 헴의 양을 증가 보충 성장했다. 이러한 웜의 관측 벌레가 L4 유충 단계로 개발하지만 mCeHR 아홉 일 후에 임신하는 단계로 발전 할 수 없습니다와 함께, 4 μM 아래 헴 농도에서 성장에 현저한 지연을 보여 주었다. 10 μM, 20의 농도에서56, M 헴은 웜 4 일 임신하는 단계로 개발하고 자손의 많은 수를 ...
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토론
이 프로토콜에서 우리는 빠른 C.를 허용하는 수정 된 무균 액체 미디어 mCeHR을 제시 웜의 다수의 생산 elegans의 생성. 벌레가 E.을 오염하지 않고 재배로이 매체는 몇 가지 장점을 보여줍니다 대장균이나 세균의 부산물 및 영양 및 독성 학적 연구에 이용 될 수있다. E.의 사용 대장균 또는 연구에서 다른 박테리아는 몇 가지 단점이있다. 예를 들어, 박테리아의 성장은 다양한 조건 하에서 변경 및 박테리아 결과의 해석을 혼동, 정량되는 분자를 대사 할 수있다. 따라서, 이러한 연구를 수행 할 수있는 정의 된 매체의 개발은 매우 유리하다.
비록 C. 엘레는 이전의 연구 (15), C.에서 자란 벌레 액체 매체에서 재배 된 엘레 유지 보수 매체 (CeMM) 우리가 obse 무엇 달리 세대 16...
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익 또는 이익의 충돌이없는 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 HealthGrants DK85035 및 DK074797 (IH)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| MgCl2• 6H2O | 시그마 | M-2393 | |
| 구연산 나트륨 | 시그마 | S-4641 | |
| 구연산 칼륨 수화물 | 시그마 | P-1722 | |
| CuCl2• 2H2O | 피셔 | C455-500 | |
| MnCl2• 4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2• 6H2O | 시그마 | F-1018 | |
| CaCl2• 2H2O | Fisher | C70-500 | |
| 아데노신 5-모노포스페이트, 나트륨 염 | 시그마 | A-1752 | |
| 시티딘 5-인산 | 시그마 | C-1006 | |
| 구아노신 2' - 및 3' -모노포스페이 | 시그마 | G-8002 | |
| 유리딘 5-인산염, 다이소듐 염 | 시그마 | U-6375 | |
| 티민 | 시그마 | T0376 | |
| N-아세틸글루코사민 | 시그마 | A3286 | |
| DL-알라닌 | 피셔 | S25648 | |
| p-아미노벤조산 | , 시그마 | A-9878 | |
| 비오틴 | 시그마 | B-4639 | |
| 시아노코발라민(B-12), | 시그마 | V-2876 | |
| 폴리네이트(Ca) | 시그마 | F-7878 | |
| 나이아신 | 시그마 | N-0761 | |
| 나이아신아마이드 | 시그마 | N-3376 | |
| 판테테인 | 시그마 | P-2125 | |
| 판토텐산 (Ca) | 시그마 | P-6292 | |
| 프테로일글루탐산(엽산) | ACRCS | 21663-0100 | |
| 피리독살 5'-인산 | 시그마 | P-3657 | |
| 피리독사민 2HCl | 시그마 | P-9158 | |
| 피리독신 HCl | 시그마 | P-6280 | |
| 리보플라빈 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| 티아민 HCl | 시그마 | T-1270 | |
| DL-6,8-티옥트산 | 시그마 | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| 콜린 이산 구연산 | 시그마 | C-2004 | |
| myo-Inositol | 시그마 | I-5125 | |
| D-글루코스 | 시그마 | G-7520 | |
| 락트알부민 효소 가수분해물 | 시그마 | L-9010 | |
| 뇌 심장 주입 | BD | 211065 | |
| 염화헤민 | 프론티어 사이언티픽 | H651-9 | |
| HEPES, 나트륨 염 | 시그마 | H-3784 | |
| 콜레스테롤 | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM 비필수 아미노산 | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM 아미노산 용액 | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| 금 입자 (Au 분말) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| 또는 | |||
| 금 입자 1.0 μ m | 바이오라드 | 165-2263 |
참고문헌
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