C. elegans의는 일반적으로 고체 한천 플레이트에 성장 또는 액체 문화에서 E. 씨앗을 품고있다 대장균. 독성 및 영양 연구를 혼동에서 세균의 부산물을 방지하기 위해, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램의 범위에 대한 웜의 수가 증가하고 동기화, 무균 액체 배지, CeHR을 이용했다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜에서는, 우리는 필요한 자료를 제시하고 수정 C를 만들기위한 절차. 전자 legans 요법 이니 및 재생 미디어 (mCeHR). 또한, C.를 노출하고 순응하는 단계 E. 성장 엘레 액체 매체를 무균하는 대장균이 설명되어 있습니다. 무균 C.를 활용 마지막으로, 하류 실험 엘레이 절차의 장점을 설명한다. C.를 분석하고 결정하는 능력 엘레 영양소의 요구 사항은 다양한 헴 농도와 무균 액체 미디어에 N2 야생 형 웜 성장에 의해 설명되었다. 이 절차는 웜의 성장과 발전을위한 최적 농도를 결정하거나, 약물 치료의 독성 학적 효과를 결정하기 위해 다른 영양소와 함께 복제 할 수 있습니다. 야생 형 웜의 성장에 대한 다양한 헴 농도의 효과는 질적 현미경 관찰을 통해 T를 정량 측정 하였다각 헴 농도에서 성장 웜 그는 수. 또, 다양한 영양소 농도의 효과는 또한 영양소의 변화에 대응 형광 센서를 표현 웜을 이용하여 정량 할 수있다. 또한, 웜의 다수 용이 미립자 포격을 사용하여 트랜스 제닉 C. elegans의 생성을 위해 제작 하였다.
서론
토양 선충은 예쁜 꼬마 선충은 독극물에 유전학에서 많은 연구에 사용되는 강력한 모델 생물이다. 그 1mm 크기, 사일, 배양 용이성의 신속한 생성 시간 및 큰 자손 번호 따라서 이러한 선충 유전자 및 약리학 화면 1, 2의 호에 이용되어왔다. 연구팀은 척추 시스템에서 보존 분자 경로를 식별하기 위해이 웜을 활용. 이러한 경로는 세포 죽음 신호, 노화 및 대사 경로, 신경계 3-6 (가) 있습니다. 또한, C.의 투명성 엘레 직접 유전자 발현 패턴과 단백질의 현지화를 분석하기 위해 시각화 할 수있는 형광 단백질 기자를 사용하여 유전자 변형 라인의 생성 할 수 있습니다.
많은 연구에서이 선충은 선충의 성장 배지 (NGM) 판을 사용하여 고체 한천 기반 표면 또는 L에서 배양iquid 문화는 음식 소스 7,8로 대장균 시드. 이러한 세균의 음식 소스는 부산물 결과의 해석에 영향을 미치는 세균의 간섭과 생화학 및 독성학 연구를 혼동 할 수 있습니다. , C. 이러한 배합 효과를 피하기 위하여 엘레 음식 소스로 세균없는 상태입니다 무균 액체 매체에서 배양 할 수있다. 이 미디....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 웜 변종
- C. 구하는 엘레은 Caenorhabditis의 유전학 센터 (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc)에서 브리스톨 N2 균주를 야생형과 NGM 플레이트에 그들을 유지 E. 시드 대장균 균주 OP50 7. 참고 : 유전자 변형 웜은 IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) 이전 11 기술로 활용이 생성 된 종자는. IQ6011는 해당 저자의 요청하실 수 있습니다.
수정 C. 2. 준비 엘레 해비 및 재생 매체 (mCeHR)
12 아래에 설명 된대로 mCeHR 액체 매체를 준비합니다. 이 무균 액체 매체는 벌레가 추가 음식 소스없이 증가 할 수 있습니다. 이러한 층류 후드로 엄격히 멸균 조건을 사용하여 무균 액체 매질 및 무균 벌레의 모든 조작을 수행한다.
- 식료품 점에서 매우 저온 살균 무 지방 우유를 얻습니다. 냉장 프로를 사용덕트 아닌 실온 품. mCeHR 매체 행진에 판 한천 뇌 심장 주입 (BHI)에 우유를 사용하고....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
C.를 배양 E.에 의해 생산 차 대사 산물의 간섭없이, 웜에 필요한 영양소의 결정에 무균 액체 배지 에이즈 엘레 대장균. 야생형 N2 웜은 세 세대 내 mCeHR 미디어에 순응하고 NGM 박테리아 접시에서 자란 벌레에 비해 성장을 보여줍니다. 사실, 이러한 웜은 OP50 박테리아 성장 웜 3.5 일에 비해 4 일 안에 임신하는이된다.
mCeHR 사용의 한 가지 이점은이 웜 (14)의 정확한 영양 요구를 조사 연구에서 관찰되었다. 그림 1 웜은 mCeHR 1 ㎜까지, 헴의 양을 증가 보충 성장했다. 이러한 웜의 관측 벌레가 L4 유충 단계로 개발하지만 mCeHR 아홉 일 후에 임신하는 단계로 발전 할 수 없습니다와 함께, 4 μM 아래 헴 농도에서 성장에 현저한 지연을 보여 주었다. 10 μM, 20의 농도에서56, M 헴은 웜 4 일 임신하는 단계로 개발하고 자손의 많은 수를 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜에서 우리는 빠른 C.를 허용하는 수정 된 무균 액체 미디어 mCeHR을 제시 웜의 다수의 생산 elegans의 생성. 벌레가 E.을 오염하지 않고 재배로이 매체는 몇 가지 장점을 보여줍니다 대장균이나 세균의 부산물 및 영양 및 독성 학적 연구에 이용 될 수있다. E.의 사용 대장균 또는 연구에서 다른 박테리아는 몇 가지 단점이있다. 예를 들어, 박테리아의 성장은 다양한 조건 하에서 변경 및 박테리아 결과의 해석을 혼동, 정량되는 분자를 대사 할 수있다. 따라서, 이러한 연구를 수행 할 수있는 정의 된 매체의 개발은 매우 유리하다.
비록 C. 엘레는 이전의 연구 (15), C.에서 자란 벌레 액체 매체에서 재배 된 엘레 유지 보수 매체 (CeMM) 우리가 obse 무엇 달리 세대 16.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익 또는 이익의 충돌이없는 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 HealthGrants DK85035 및 DK074797 (IH)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| MgCl2• 6H2O | 시그마 | M-2393 | |
| 구연산 나트륨 | 시그마 | S-4641 | |
| 구연산 칼륨 수화물 | 시그마 | P-1722 | |
| CuCl2• 2H2O | 피셔 | C455-500 | |
| MnCl2• 4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2• 6H2O | 시그마 | F-1018 | |
| CaCl2• 2H2O | Fisher | C70-500 | |
| 아데노신 5-모노포스페이트, 나트륨 염 | 시그마 | A-1752 | |
| 시티딘 5-인산 | 시그마 | C-1006 | |
| 구아노신 2' - 및 3' -모노포스페이 | 시그마 | G-8002 | |
| 유리딘 5-인산염, 다이소듐 염 | 시그마 | U-6375 | |
| 티민 | 시그마 | T0376 | |
| N-아세틸글루코사민 | 시그마 | A3286 | |
| DL-알라닌 | 피셔 | S25648 | |
| p-아미노벤조산 | , 시그마 | A-9878 | |
| 비오틴 | 시그마 | B-4639 | |
| 시아노코발라민(B-12), | 시그마 | V-2876 | |
| 폴리네이트(Ca) | 시그마 | F-7878 | |
| 나이아신 | 시그마 | N-0761 | |
| 나이아신아마이드 | 시그마 | N-3376 | |
| 판테테인 | 시그마 | P-2125 | |
| 판토텐산 (Ca) | 시그마 | P-6292 | |
| 프테로일글루탐산(엽산) | ACRCS | 21663-0100 | |
| 피리독살 5'-인산 | 시그마 | P-3657 | |
| 피리독사민 2HCl | 시그마 | P-9158 | |
| 피리독신 HCl | 시그마 | P-6280 | |
| 리보플라빈 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| 티아민 HCl | 시그마 | T-1270 | |
| DL-6,8-티옥트산 | 시그마 | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| 콜린 이산 구연산 | 시그마 | C-2004 | |
| myo-Inositol | 시그마 | I-5125 | |
| D-글루코스 | 시그마 | G-7520 | |
| 락트알부민 효소 가수분해물 | 시그마 | L-9010 | |
| 뇌 심장 주입 | BD | 211065 | |
| 염화헤민 | 프론티어 사이언티픽 | H651-9 | |
| HEPES, 나트륨 염 | 시그마 | H-3784 | |
| 콜레스테롤 | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM 비필수 아미노산 | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM 아미노산 용액 | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| 금 입자 (Au 분말) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| 또는 | |||
| 금 입자 1.0 μ m | 바이오라드 | 165-2263 |
참고문헌
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
