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방법 논문

소설 생체 유전자 전달 기술과 시험관 셀 기반 분석 실험

11.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51810

⸱

2014년 6월 8일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Clinical Immunology, University of California, Davis, 2Institute for Pediatric Regenerative Medicine, Shriners Hospitals for Children - Northern California, 3Department of Dermatology, University of California, Davis

이 논문에서

요약

전구세포의 파골세포로의 분화는 사이토카인과 성장인자에 의해 조절됩니다. 여기에서는 사이토카인이 파골세포형성에 미치는 영향을 연구하는 방법으로서 in vivo에서 파골세포를 파골세포로 분화하기 위한 새로운 유전자 전달 기술과 전구세포를 in vitro에서 파골세포로 분화하기 위한 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

파골세포의 분화와 활성화는 근골격계 질환의 발병에 중요한 역할을 하는데, 이 세포는 주로 뼈 흡수에 관여하기 때문입니다. 파골세포는 특정 사이토카인이 존재하는 단핵구/대식세포 전구세포로부터 체외에서 생성될 수 있으며, 이는 생존과 분화를 촉진합니다. 여기에서는 in vivo 및 in vitro 기술이 모두 시연되어 과학자들이 파골세포 분화, 신호 전달 및 활성화에 대한 다양한 사이토카인 기여를 연구할 수 있습니다. minicircle DNA delivery gene transfer system은 골다공증 관련 모델을 확립하기 위한 대안적인 방법을 제공하며, 다양한 약리학적 억제제의 in vivo 효능을 연구하는 데 특히 유용합니다. 마찬가지로, 특정 사이토카인이 존재하는 상태에서 인간 전구 세포에서 파골세포를 생성하기 위한 체외 배양 프로토콜을 통해 과학자들은 중개 응용을 위해 인간 세포의 파골세포 형성을 연구할 수 있습니다. 이러한 기술을 결합하면 파골세포 특이적 표적 치료제에 대한 약물 발견 노력을 가속화할 수 있는 잠재력이 있으며, 이는 전 세계 수백만 명의 골다공증 및 관절염 환자에게 도움이 될 수 있습니다.

서론

근골격계 질환은 국가 및 지역 보건 시스템 1에 대한 미국과 현재의 심각한 결과에있는 사람들의 수백만에 영향을 미칩니다. 이 질환은 뼈의 손실과 광범위한 치료 및 회복의 오랜 기간을 필요로 관절 기능을 특징으로한다. 일반적으로, 파골 세포의 수 및 / 또는 활성의 상대적 증가는 세포가 골다공증, 뼈 재 흡수하도록 특수화 및 관절염이 관찰된다. 생리적 조건에서 파골 세포의 수와 활성을 골아 세포에 의해 생산되는 핵 인자 κ B-리간드 (RANKL)의 수용체 활성에 의해 조절된다. 게린 (OPG), RANKL에 대한 미끼 수용체는 조골 세포 (3)에 의해 생성되는 조직 sRANKL의 과발현 또는 OPG의 삭제를 포함하는 생체 내 동물 모델 골다공증 연구에 매우 유용합니다.; 그러나,이 방법은 형질 전환 마우스 4,5의 생성을 필요로합니다. 여기서, 새로운 대안근골격계 관련 질환의 연구 sRANKL를 과발현하는 방법이 설명된다. 특히, minicircle (MC) DNA 기술 및 유체 전달 방법은 생체 내에서 sRANKL의 유전자 전달을 달성하고 체계적으로 6 마우스 sRANKL를 과발현하는 데 사용되었습니다.

이 방법은 또한 낮은 칼슘 다이어트 (8)에 의해 난소 7식이 개입을 다음 파골 세포의 호르몬 변조 골다공증의 다른 생체 모델을 보완. 이 모델들은 수술 절차가 필요하고 상당한 비용 9에서 몇 달까지 걸릴 수 있습니다 그러나 근골격계 관련 질환의 다양한 측면을 연구하는 것은 매우 유용하다. 난소 절제 (OVX) 설치류 모델은 난소를 제거함으로써 인간의 폐경 후 골다공증 (10)을 흉내 낸 에스트로겐 결핍에 이르게 실험 동물 모델입니다. 인간의 폐경 후 골다공증, 에스트로겐 defici 조건ency은 골절의 위험이 증가로 연결 골다공증은 미국에서만 약 8 백만명의 여자에 영향을 미칩니다. OVX 모델은 폐경 후 골다공증에 유용하지만 그것은 일반적으로 골다공증을 연구하는 제한된 이점을 제공합니다. 에스트로겐 따라서 그것의 부재에서 증가 된 파골 세포 활성은 10-12을 관찰하고, 파골 세포 및 조골 세포 유도 세포 사멸을 억제함으로써, 골 손실을 억제한다. 골 흡수 호의 RANKL-OPG 비율 불균형도 13를 관찰된다. 성장 인자 β (TGF β의), 증가 된 인터루킨 12 (IL-12) 및 TNF, IL-1 및 IL-6 (14, 15)를 변형의 수준을 감소함으로써 그러나, 생체 내에서 에스트로겐 결핍도 수반한다. 이러한 사이토 카인은 RANKL 경로의 뼈 리모델링 조절 성 기능을 독립적 알고있다, 그것은 전적으로 RANKL-RANK 축에있는 파골 세포의 활성화를 속성 수 없다. 이 문서에 설명 된 모델은 비브에서 공부하는 연구자 수오 전 염증성 사이토 카인없이 파골 세포와 뼈 손실에 RANKL-RANK 축이 OVX 쥐 모델에 비해.

또한, 체외 파골 세포 기술은 근골격계 질환의 잠재적 인 치료 트리트먼트의 파골 세포의 활성을 연구하는 중요한 도구입니다. 이전 연구는 또한 마우스 대 식세포 집락 자극 인자 (M-CSF)와 마우스 sRANKL와 마우스 골수 유래 대 식세포 (BMMs)를 배양하는 파골 세포의 분화 3,16,17로 이어질 수있는 것으로 나타났습니다. 여기서, 마우스 골수로부터뿐만 아니라 체외 (18)에서 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMC를)까지 다핵 파골 세포 - 유사 세포를 생성하는 프로토콜이 설명된다. 성숙한 말기 차별화 된 완벽한 기능 파골 세포를 정의하는 데 필요한 세포 기반 분석도 간략하게 설명되어 있습니다. 체외 기술은 생체 방식의 소설을 보완하고 함께 P 역할owerful 조사 도구는 파골 세포의 분화 및 활성화를 공부한다. 이러한 시스템을 사용하여, 과학자들은 생체 내 및 시험관 내에서 파골 세포 생성 및 증식 및 활성화에 필요한 자극 및 신호를 정의 할뿐만 아니라 약리학 적 및 생물학적 억제제의 효능을 시험 할 수있다.

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프로토콜

sRANKL MC DNA의 1. 유체 역학 배달

  1. 마우스의 꼬리 정맥을 통해 유체 역학 배달
    1. 꼬리 정맥 주입하기 전에 마우스의 무게를. 마우스의 체중의 10 % ~의 총 부피에 sRANKL 또는 링거액에 녹색 형광 단백질 (GFP) MC (미리 따뜻한 37 ° C에서)를 희석.
    2. 혈관을 팽창하고 눈에 보이는 측면 혈관 (정맥 주사)를 확인하기 위해 주사 전에 10 분 동안 새장에 마우스를 따뜻하게. 탈수와 고열을 피하기 위해 신중하게 마우스를 모니터링합니다.
    3. 즉시 정맥 주사가 넓혀진 눈에 보이는대로, 제한 수단에 마우스를 전송하고 이동을 억제하는 통에 충분히 플러그를 삽입합니다. 같은 호흡으로 정상 활동에 마우스를 모니터링합니다. 필요한 경우 제한 기의 플러그를 조정합니다.
    4. 와이프 주류로 꼬리의 끝으로부터 주입 영역 3 / 4을 소독. 마우스 꼬리 정맥 주입을 위해 27 ~ ​​30 G 바늘을 사용합니다. 한 손으로 단단히 꼬리를 잡고있는 바늘을 삽입꼬리 정맥에. 주사기에 압력을 적용하고 5-7 초 내에 주입을 완료합니다.
    5. 꼬리 정맥에서 바늘을 제거하고 출혈을 멈추게하는 주사 부위에 면봉으로 압력을 적용합니다. 호흡 속도가 정상 속도로 감소되면 다음 동식물 사육장에 다시 마우스를 전송, 15 ~ 30 분 동안 마우스를 모니터링합니다.
  2. 마우스 혈청 TRACP5b 포스트 유전자 전송의 전신 마우스 sRANKL 표현과 정량화의 확인
    1. 혈관을 팽창하고 정맥 주사를 볼 수 있도록하기 위해 5 ~ 10 분간의 장에 마우스를 따뜻하게. 탈수와 고열을 피하기 위해 신중하게 마우스를 모니터링합니다.
    2. 꼬리의 끝에서 앞으로 사이트 한 곳에서 마우스의 꼬리에 잎을 가진 작은 절개를합니다.
    3. 혈청 분리 튜브에 혈액의 약 100 μl를 수집합니다.
    4. 실온에서 30 분 동안 혈청 분리 튜브를 배양한다.
    5. 원심 분리기 5 분 10,000 XG에 샘플 및 혈청을 수집합니다. STOR추가 분석을 위해 -80 ° C에서 E 세럼.
    6. 상용 가능한 키트를 사용하여 혈청 샘플에 sRANKL ELISA와 마우스 혈청 TRACP5b 분석을 수행합니다.

마우스 BMMs 2. 체외 파골 세포 생성

  1. 분리 및 BMMs의 배양
    1. 경골과 대퇴골 뼈의 분리 : CO 2 기증자 마우스를 안락사, 70 % 에탄올로 다리를 소독. 그대로 대퇴골과 경골 뼈를 제거하기 위해, 종골 뼈에 치골에서 해부.
    2. 뼈를 손상시키지 않고 조심스럽게 피부와 근육을 제거합니다. 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 포함하는 배양 접시에서 처리 대퇴골과 경골 뼈를 놓습니다.
    3. 골수 제거 : 대퇴골과 경골 뼈의 한쪽 끝을 잘라 및 α-MEM은 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는로드 25 G 바늘을 1 ㎖ 주사기를 사용하여 50 ㎖ 튜브에 골수를 플러시 (파골 세포 배양액 / OCM).
    4. 프로세스 골수 : 혼합 및 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 전달하여 새로운 50 ㎖ 튜브에 골수 현탁액을 전송합니다. 원심 분리기 300 XG와의 세포를 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 10 % FBS (파골 세포 배양액 / OCM (+))를 포함하는 α-MEM에 다시 일시 중지합니다.
  2. 대 식세포의 문화
    1. 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계산합니다.
    2. 96 - 웰 플레이트에 넣고 37 ℃에서 부화 유리 커버 슬립 (5 ㎜) 또는 상아질 조각에 6 잘 판 3 × 10 5 세포를 잘 당 플레이트 1 X 10 6 세포
    3. 기음 비 부착 세포를 포함하는 48 시간 동안 25 NG / ML 마우스 M-CSF를 포함하는 신선한 OCM (+)와 37 ° C에서 세포를 품어 모든 미디어.
    4. 25 NG / ML 마우스 M-CSF 및 파골 세포를 시작하는 30 NG / ML 마우스 sRANKL를 포함 기음 모든 미디어와 신선한 OCM으로 37 ° C에서 세포를 배양 (+) 미디어. 필요에 따라 매 3 일마다 미디어를 보충.
    5. 세포 성장약 6~8일 뼈를 resorbing 할 수있는 거대한 멀티 핵 세포를 형성하는 데 필요한 권한입니다. 즉시 다핵 세포가 나타날 때, 상용 가능한 키트를 사용하여 염색 TRAP (주석 산염 저항하는 산성 인산 가수 분해 효소)를 수행하고, 완전히 성숙 할 때, 기능 분석을 수행합니다. phalloidin도 스테인 및 이미지 (19) 이전에 설명한 바와 같이 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 슬라이스 상아질 부착 세포를 이용하여 커버 슬립에 F-액틴 링 시각화.

인간 PBMC를 3. 체외 파골 세포 생성

  1. 인간 PBMC를의 분리
    1. 50 ㎖ 튜브에 미리 예열 Histopaque-1077의 10 ML을 추가합니다.
    2. 빈 백혈구 필터는 50 ML 튜브 (PBS와 혈액의 1:1 비율)로 멸균 PBS와 혈액 은행에서 얻을. 혈액이 histopaque와 혼합하지 않도록하고, 아주 천천히 histopaque 용액에 희석 된 혈액을 레이어.
    3. 18 ° C에서 20 분 1000 XG에 원심 분리기 샘플 따라원심 분리를하여 보내고, 정중 백혈구 함유 백색 버피 코트 층을 분리하고 50 ㎖의 새로운 튜브로 옮긴다.
    4. 세포를 수집하는 5 분 650 XG에 다시 PBS와 원심 분리기로 세포를 희석.
    5. 미디어 및 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산 (-) OCM에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다.
  2. PBMC를 도금 및 배양
    1. OCM에있는 세포를 재현 탁 (+) 미디어 판 (8) × 10 / ㎖ 당 잘 6 잘 플레이트 또는 1 X 10 6 세포 / ㎖ 당 잘 96 - 웰 플레이트에있는 6 개의 세포. 로 면역 형광 이미징뿐만 아니라 골 흡수 분석에 적합한 뼈 조각에 대한 필요에 따라 유리 커버 슬립 (5 ㎜)에 플레이트 세포는 이전에 (20)을 설명했다.
    2. 변경 배양액 인간 M-CSF 2-3 일마다 또는 필요에 따라 세포를 보충. 그런 osteoclastogenes을 시작 OCM (+) 미디어 25 NG / ML 인간의 M-CSF와 함께 인간의 sRANKL 30 겨 / ㎖를 추가하여 5 일에 분화 단계로 진행이다.
    3. 거대한 멀티 핵 세포를 형성하는 데 약 14-21일에 세포를 성장. 마자 다핵 세포가 나타나는 바와 같이, 이들 세포는 TRAP 표지 할 수 있고, 완전히 성숙 할 때, 기능적 분석법이 수행 될 수있다. F-액틴 링은 phalloidin도 얼룩을 사용하여 커버 슬립에 시각화 할 수 있습니다. 세포 형태는 SEM에 의해 조각을 상아질에 부착 된 세포에서 검사 할 수 있습니다.

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결과

여기서, 파골 세포에 대한 사이토 카인의 효과를 연구하기위한 방법으로 체외로 파골 전구 세포 분화에 대한 생체 내 및 세포 배양 프로토콜에서 파골 세포의 분화를위한 신규 한 유전자 전달 기술이 설명된다. 그림 1에서, 마우스에있는 GFP 마우스 sRANKL MC의 성공적인 유전자 전달의 대표적인 결과가 표시됩니다. 그림 2에서, 마우스의 골수 또는 시야 현미경에 의한 파골 세포에 전구 세포의 인간 PBMC 세포 분화 시간 코스의 문화를 대표하는 이미지가 표시됩니다. 그림 3, 마우스 골수 유래 파골 세포의 특성을 세 가지 독립적 인 방법의 대표 이미지가 표시됩니다 . 마우스 sRANKL의 존재는 TRAP의 표현 (그림 3A와 B)와 F-액틴 링 (그림 3 C와 D)의 형성을 활성화합니다. 스캔 ELEC트론 현미경 (SEM)을 마우...

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토론

근골격계 조건은 병적 상태와 장애의 원인을 선도하고 150 개 이상의 질병 및 증후군 구성되어 있습니다; 현재 약 90 만 명의 미국인에 영향을 미치는. 관절 염증 및 골 파괴는 관절염과 골다공증 등의 근골격 조건의 주된 기능이다. 골다공증은 주로 뼈의 골절로 이어지는 뼈의 무결성을 약화 조건이다. 관절염은 부어, 부드럽고 뻣뻣한 제한 정상적인 운동이되어 장애로 이어질 수있는 관절의 염증을 특징으로 질병을 쇠약, 만성입니다. 근골격계 질환의 발병이 크게 서로 다르지만, 골 파괴가 무엇보다 중요한 일반적인 기능입니다. 근골격계 조건에서 뼈 파괴는 주로 골 흡수와 골 형성 (21, 22) 사이의 불균형에 의해 발생합니다. 한 치료 방법은 뼈를 파괴하는 이들 세포의 능력을 차단하도록 시도하는 것이다 23. 여기에 설명 된 기술과 절차는 생체 내 및 시험 관내에서 모두 파골 세포의 연구를 할 수 있습니다.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

연구는 NIH 연구 보조금 R01 AR062173과 IEA에 대한 SHC 250862의 일부 지원을 받았습니다. ES는 NIH T32 CTSC 박사 전 펠로우십을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알파-MEM생명 기술 12561-056
Human M-CSFMiltenyi Biotec130-096-492
마우스 M-CSFMiltenyi Biotec130-094-643
Human RANK-Ligand - 용해성Miltenyi Biotec130-094-631
마우스 RANK-Ligand - 용해성Miltenyi Biotec130-094-076
Braintree용 Tailveiner Restrainer
마우스 트랜스/랭크 L/TNFSF11 Quantikine ELISA 키트 R& D systemsMTR00
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) KitSigma387A
MouseTRAP assay 면역진단시스템SB-TR103
마우스 TV-150STD

참고문헌

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