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방법 논문

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된 초파리 Melanogaster

22.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51814

⸱

2014년 8월 21일

 , 
1Département de Génomique Fonctionnelle et Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Center for Life NanoScience, Istituto Italiano di Tecnologia

이 논문에서

요약

이 책의 목적은 시각화 및 초파리에서 추출한 RNA에 향상된 북부 얼룩 프로토콜의 동작 단계를 논의 배아, 세포 및 조직을 melanogaster하는 것입니다. 이 프로토콜은 작은 RNA 종의 효율적인 검출에 특히 유용하다.

초록

지난 수십 RNA 수준에서 유전자 발현을 제어 메커니즘 주위 과학적 관심 폭발을 보아왔다. 분자 생물학의이 지점은 크게 전사 후 조절에 중요​​한 선수로의 RNA를 비 암호화의 발견에 의해 연료를 공급하고있다. 이러한 혁신적인 관점은 높은 처리량 레벨 (게놈 전체의 식별) 또는 단일 후보 분석 (특정 종의 정상 상태 축적)으로 모두 함께 짧은 RNA를 발현 프로파일 링에 대한 강력한 기술의 개발에 의해 촉발되었다. 여러 첨단 전략 투여 또는 도피 분자를 시각화 현재 사용할 수 있지만, 북부 오 점 분석은 RNA 발현의 즉각적이고 정확한 평가를위한 분자 생물학 자격이 접근 남아있다. 이는 많은 경우에 더 정교하고 고가의 기술의 응용을 향해 첫 단계는 쉽게 통찰력을 얻기 위해 우선적 인 방법 남아 나타내고RNA 생물학에. 여기에서 우리는 수동으로 애벌레 / 성인 조직을 해부 또는 체외 배양 된 세포에서, 전체 배아를 melanogaster 초파리에서 약하게 발현 마이크로 RNA (또는 다른 작은 규제 RNA 종)을 검출 (북 오 강화) 효율적인 프로토콜 개요. RNA의 매우 제한된 양이 필요하고 계측법 절연 세포가 될 수있는 흐름 물질의 사용은 또한 예상된다.

서론

RNA 생화학는 지난 몇 년 동안 일에 극적으로 진행되는 발생했습니다. 유전자 발현의 조절에서 RNA 전위의 우리의 이해는 신규 한 RNA 기반 규제 메커니즘 3,4의 발견에 의해 이미 공지 된 전사 후 이벤트 깊은 특성화에 의해, 강력한 비 암호화 리보 - 레귤레이터 (2)의 식별 정보를 이용하여 버스트되었습니다 5. 모두 함께 이러한 연구가 허용 한 RNA 생물학 극적으로 현재 과학 풍경에 주요 연구 대상이되고, 현장을 확인합니다. 특히, 최근 몇 년 동안 우리는 분자 신경 생물학 (6), 현대 생명 과학에서 가장 역동적 인 연구 영역 중 하나에서 "RNA 세계"의 보급에 미치는 영향의 감각을 얻고있다. 지난 세기 지난 10 년 동안 과학 전반적인 시나리오는 RNA 간섭 7,8 발견 의해 소형 RNA를 규제 9,10의 혁명되었습니다마이크로 RNA (11)에 특정과 관련하여, 내생 적 유전자 발현의다면 발현과 조합 규제 등 거의 모든 세포 기능의 조절에 관여 작은 비 암호화 RNA를 표현.

miRNA가 높은 번호가 초파리뿐만 아니라 12 ~ 15 인간의 세포에서 발견했을 때 거의 십년 AMBROS 및 Ruvkun의 연구소에 의해 예쁜 꼬마 선충에서 miRNA의 초기 발견 후, 새롭게 관심 분야에가되었습니다. 그 이후로, 다양한 형질 전환 방법 덕분에, 초파리는 miRNA의 생합성 및 활동에 대해 깊이 탐구 귀중한 생물 컨텍스트로서 서 있었다. 초파리의 miRNA가 경로를, 신진 대사 노화 신호에서 이르기-곤충 특정 또는 진화 적으로 보존 된 프로세스에 고유 한 기능을 계시했다 행동하고, 물론, 신경. 이 방향을 따라, 우리는 최근 흥미로운 공동의 소설 링크 16을 발표했다마스터 유전자 GCM / RNA 활공 경로 사이에서 발생 rrelation. 플라이 전사 인자 GCM / 글라이드 17-19 능성에 아교 대 신경 운명의 선택이 신경 전구체 20 비행 지시 세포 운명 결정의 독특한 예를 구성한다. 스물 년이 주제에 대한 오랜 연구는 GCM /를 통해 수렴 유전자 발현 조절의 다양하고 중복 입력의 발생 신경 개발 과정에서 신경 세포와 신경 교세포의 대응 사이의 섬세한 비율을 균형에 필요한 임계 값 레벨을 설정하는 21 ~ 28 활공을 강조 분명히하고있다.

우리는 DMEL-miR279 타겟팅을 통해 그 규정은 GCM의 전사 후 미세 조정 / 16 식 활공에 기여하는 또 다른 제어 수준을 나타냅니다 발견했다. 전 세계적으로 이러한 연구 선이 필요 한 특정 방법론 개선 : 년 함께 몇 가지 기술은 원래 트라를 분석하기 위해 개발itional RNA들처럼, 작은 비 코딩의 RNA를 정량화 변환 된의 RNase 보호 분석법, cDNA를 배열 29-31, 실시간 PCR 방법 32-35 및 36,37 시퀀싱 등. 다른 측면에서, 기술적 접근 방법의 재 교정이 분야에서 지속적으로 진행되는 육성하고있다.

북부 얼룩 분석 (NB, 또는 RNA 겔 블롯 분석은) 대표 인스턴스를 구성 : 그것은 크기가 결정뿐만 아니라 모두 발현 수준의 정량을 보장 이후 크게, RNA 축적을 프로파일 사용된다. 그러나, 본 방법의 본질적인 나쁨 감도는 짧은 RNA를 원한다면, 낮은 풍부한 유전자 발현 미세 튜너에인가 될 때 제한된다. 해로운 결과는 특정 생체 시료 어려운 그 응용 프로그램을 만드는 총 RNA, 많은 양의 요구 사항입니다. 이러한 이유로, 작은 RNA를 검출을위한 특정 NB 변종의 경우 38 ~ 40를 개발되어 있습니다 : 우리는 개선 된 NB 발동을 이용했다edure 41 (ENB, 향상된 북부 오), DMEL-miR279와 GCM / 활공의 전술 상호 작용을 해명하면서.

이 방법은, 카르 보디이 미드 유도체의 활동을 기반으로 화학적 가교 결합 단계에 의존 [1 - 에​​틸 3 - (3 - 디메틸 아미노 프로필) 카 보디이 미드, EDC] 고체 지지체에 핵산을 고정한다. 카르 보디이 미드 활성화 카복실 또는 포스페이트 그룹 및 아민 기 (42) 사이에 아미드 결합의 형성을 촉진하는 것으로 알려진 다기능 가교제이다. 이 속성은 나일론 막의 표면에서 그룹을 아미노하기 위해 모노 인산화 된 5'-하이드 록실 그룹을 통해 공유 커플 작은 RNA들에 악용 될 수 있습니다. 얻어진 부착 구성은 다시 검출 현저한 향상 43 결과 프로브의 타겟의 혼성화의 효율을 고정화 핵산의 접근성을 높이고.

이 기술은 특정 relevanc 가정초파리 분자 연구에서 전자가있는 작은 비 암호화 RNA를 소설과 독특한 클래스의 발생이 44 떠오르고있다. 이 중, 45, 46가 순서 특정 유전자 침묵 (gene silencing)에 참여 piwi 상호 작용하는 RNA를 (piRNAs 47)의 특정 하위 유형을 구성 rasiRNAs. 이 방법의 동작 상세하게 설명 하나 rasiRNA, rasi4 중, 최초로, 마이크로 RNA-DMEL miR279 및 DMEL-miR286의 분석을 기준으로하고, 이하에서 가시화된다. 우리는 RNA (이하 1 μg)의 최소 금액에서 제대로 표현 대상도 공개 허용이 방법을, 극단으로 밀었다.

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프로토콜

1 샘플 컬렉션

  1. 피펫에 의해 반 부착 슈나이더의 두 세포 (평균 1-5 × 10 6 세포), 분리 및 원심 분리 (1 분 100 XG)에 의해 그들을 수확. 체외 부착 세포 배양의 경우는, 표준 조건에서 그들을를 Trypsinize 직접 셀 스크레이퍼의 도움으로, RNA 추출 시약의 양에 편리한 플레이트에서 그들을 수집.
  2. 배아 수집, 플라이 케이지에서 초파리 균주를 성장하게 배아는 계란 누워 판에 누적됩니다. 증류수에 붓 DH (2 O)에 의해 배아를 닦아, 자체 필터링 파편을 버리고 씻어 유리 병 (48)에 배아를 복구 할 수 있습니다.
  3. 다른 방법으로 수동으로 조직 / 장기를 해부하다. 힘으로 박리 바늘 또는 집게를 사용하여, 실체 현미경 (배율 20 배)에서는 인산염 완충 식염수 (PBS)에 초파리 복부에서 고환 (피르 분석을위한 우선적 인 시스템)을 격리설리반 등 49 ualized.
  4. 유 봉은 RNA 추출 시약 0.5 볼륨의 중독에 샘플을 균질화.

2 RNA 추출 / 분석

  1. 다음은 제조업체의 지침에 상용 시약을 통해 RNA 분리를 수행합니다.주의! RNA 추출 에이전트는 일반적으로 독성 및 부식성이다. 또는 다음과 같이, RNA 분리 (50)에 대한 테 K-기반의 프로토콜을 적용
    1. 정지 믹스 400 μL로 샘플을 희석하고 실온에서 15 분 동안 배양한다.
    2. 클로로포름 : 이소 아밀 알코올과 클로로포름 추출 및 에탄올 (EtOH를) 침전 / 세탁에 의한 표준 페놀에 의해 hydrosoluble 구성 요소를 복구 할 수 있습니다. 공기 샘플을 건조 diethylpyrocarbonate (DEPC)로 재현 탁 더블 (일) H 2 O 증류 - 처리
  2. UV 분광 측정하여 RNA 농도를 평가합니다. 또한, RNA의 순도는 2.0에 가까운 높은 BAS 보장260에 ED / 280 읽기.
  3. 다음과 같이 아가 로스 젤을 변성에 RNA 준비 확인
    1. 깨끗한 비커에서 연속 교반, DEPC-DDH 2 O의 82 ㎖에 아가로 오스의 1.2 g을 녹인다. 완전히 용해 될 때까지 끓인다.
    2. 겔 용액을 냉각시킵니다; 온도가 60 °가 10 배 4 morpholinepropanesulfonic 산 10 ㎖를 추가 C에 도달 할 때 (MOPS)는 1X 최종 농도 (FC)에 버퍼, 8 ml의 3 포름 알데히드 % 37 %의 FC.주의! 포름 알데히드는 발암 물질이다.
    3. 수평 전기 영동 셀에 겔을 붓고. 젤은 적어도 1 시간 동안 후드 강화하도록 허용합니다. 응고 후, MOPS 1X에 젤 잠수함.
    4. 분취 RNA 시료 2 μg 및 1 μg의 래더 (정확한 평가가 요구 될 때 RNA 마커를 사용). RNA에 아가로 오스 로딩 염료 (ALD)의 3 볼륨을 추가하고 사다리. 열 70 ° C 5 분 동안 얼음에 즉시 차가운에서. CA의 ution! ALD의 내용 (에티 디움 브로마이드 및 포름 아미드, 자료 참조)는 각각, 돌연변이 및 부식성이다.
    5. 샘플을로드하고 가끔 버퍼 재활용 약 1 시간 동안 50 V에서 젤을 실행합니다. UV 시각화 또는 젤 이미징에 의해 RNA의 분류 패턴을 확인합니다. 28S와 18S rRNAs과 된 tRNA에 해당하는 개별 밴드를 인식 (그림 1 참조).
  4. -80 ° C에서 북부 분석 또는 저장 RNA 진행합니다.

3 변성 아크릴 아마이드 젤 준비

  1. 이 분류 단계에 대한 작은 수직 전기 영동 장치 (플레이트의 크기 8cm X 9cm, 빗 두께 0.75 mm)를 사용합니다.
  2. 주조 프레임에서 함께 깨끗한 안경을 조립합니다.
  3. (1 19) MOPS 1X 용액, 7 M 우레아 10 % 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 10 ㎖를 준비합니다. 바로 주입하기 전에, 10 %의과 황산 암모늄 100 ㎕ TEMED 및 10 μL를 추가하고 신속 용액을 혼합한다.주의! 아크릴 아마이드는 신경 독성 및 발암 물질이다.
  4. 유리판 사이에 젤을 부어 거품을 피하기 위해 신중하게 잘 빗를 삽입합니다. 젤은 사용하기 전에 적어도 45 분 동안 실온에서 중합 보자. 또한, 겔 O / N, 물에 젖은 여과지에 싸여 사란 랩에 밀봉 저장합니다.

4 샘플 준비

  1. 나누어지는 0.5-20 각 샘플에 대한 총 RNA ㎍의. 볼륨 3-4 μl를 초과하면, 진공은 샘플을 건조.
  2. 크기 결정 용 마커로서 (제조 섹션 4.3 및 4.4 참조), 샘플에 평행 방사성 표지 저역 사다리의 분취 량 (20-30 CPS)를 실행. 단계 4.5에 기재된 바와 같이, 샘플들에 병렬로 취급.
  3. 사다리 : 10 bp의 단계 사다리의 0.1 μg을 사용하여 인산 앞으로 반응을 설정합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 품어 20 mM의 FC에 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가하여 반응을 중지합니다.
  4. EtOH로 침전 / 세척, 건조 공기에 의해 정화DDH 2 O (약 100 μL).에 재현 탁주의! 32 P 방사성 소스입니다.
  5. 각 샘플에 아크릴 아미드 파란색 염료 (ABD)의 동일한 볼륨을 추가합니다. 5 분 동안 80 ° C에서 가열에 의해 변성 및로드.주의까지 얼음에 멋지다! 포름 아미드 (ABD의 내용이) 부식성이다.

(5) 전기 영동 분획

  1. 캐스팅 지원을 유리판을 제거하고 적절하게 전기 영동 셀을 조립한다. 충분한 실행 버퍼 (RB)와 모두 내부 및 외부 챔버를 입력합니다.
  2. 부드럽게 빗를 제거하고 10 분 동안 200 V에서 젤을 미리 실행합니다. 로드 샘플 전에 주사기를 통해 일부 RB를 분출하여 우물에서 요소 예금을 씻어.
  3. 플랫 팁을 사용하여 각 우물의 바닥에서 4.5 단계에서 신중 충 샘플. 거꾸로 실행을 방지하기 위해 양극과 음극 연결을 확인합니다. 샘플이 5 분 동안 100 V에서 젤을 입력 한 후, 난V. 200에 전압을 ncrease
  4. 약 7cm의 분별 길이를 들어, 45 분 - 장기적으로는 충분하다. 젤을 오버플로 브로 모 페놀 블루 (ABD에서 추적 안료를)하지 마십시오.
  5. 선택적인 단계로 에티 디움 브로마이드 (EtBr이) 염색에 의해 분류 된 긴 RNA를 겔에 - 시각화 :
    1. 겔의 정상에서 멀리 2cm를 잘라 짧게 DDH 2 O.에서 슬라이스를 씻어
    2. RB, EtBr이 0.5 μg / ml의 FC 부드러운 동거와 15 분 동안 실온에서 겔 슬라이스를 품어.
    3. RB에서 1​​5 분 동안 젤 Destain, UV 조사 또는 겔 촬상 장거리 rRNAs 시각화. RNA 로딩과 품질 (그림 1, 패널 7).주의를 확인! 에티 디움 브로마이드가 돌연변이이다.
  6. 한편 작은 RNA 종을 포함하는 겔의 하부 블로 팅을 진행.

6 젤 블로 팅

  1. 6 블롯 영역에 맞추기 위해 압지 조각과 uncharge의 상당 부분을 잘라D 나일론 막을. 용지, 막과 RB의 두 블로 팅 패드를 적 십니다. 완전히 반복 RB에서 그들을 압박하여 패드를 흡수해야합니다.
  2. 장치에서 젤을 제거하고 주걱의 평균에 의해 안경을 엽니 다. 우물을 제거하기 위해 깨끗한 커터를 사용합니다. 젤에 젖은 와트 종이를 놓고 조심스럽게 들어 올립니다.
  3. 겔의 자유면에 나일론 막을 놓습니다. 샘플 상태에 따라 필터의 방향을 모서리를 표시. "샌드위치"(3 종이 조각 각면)을 완료합니다. 가능한 모든 공기 방울을 제거하고, 표면에 오점 플라스틱 막대 롤.
  4. 모래 바닥 카세트에이 모래 바닥 패드와 다음 사이의 오점을 놓습니다. , 모래 바닥 모듈에 카세트를 조립 RB와 챔버를 작성하고 (겔과 긍정적 인 말단 사이에 유지해야 나일론 막) 올바른 방향을 확인합니다.
  5. 20 분 동안 20 V에서 전송합니다. 참고 : 10 분 블로 팅 모듈과 연구를 연 후, 균일 한 조건을 보장하기 위해전송을 완료하기 전에 180도 샌드위치 otate.

7 막 가교

  1. 신선한 가교 솔루션 (XLS)의 6 ML을 준비합니다. 포화 10cm는 (나일론 막보다 더 큰) 10cm XLS.주의와 압지의 조각을 X!에 HCl (XLS의 구성 요소)이 높은 부식성이다.
  2. 오점을 해체 젖은 3MM 필터 종이에 막 배치합니다. 참고 : RNA는 포화 종이와 직접 접촉하지 않아야합니다. 두 개의 유리판 사이의 필터 종이를 놓고 사란 랩에 포장.
  3. DDH 2 O 세척 한 다음 2 시간 동안 60 ° C에서 막을 열. -20 ° C에서 저장 또는 하이브리드를 진행합니다.

8 멤브레인의 프레 하이브 리다이 제이션

  1. RNA로드 (옵션 단계 5.5)을 선택되어 있으면 직접 하이브리드를 진행합니다. 아니면, 나일론 필터의 꼭대기로부터 거리 1cm 잘라 프로브 간 hybridizatio 않도록분별 긴 RNA를 ns의.
  2. 37 ° C에서 하이브리드 솔루션 (HS) 10 ㎖를 예열. 5 분 동안 95 ° C에서 연어 정자의 1 mg의 변성 얼음에 시원하고 HS 추가 할 수 있습니다.
  3. 혼성화 오븐에서 회전에 따라, 적어도 1 시간 동안 37 ℃에서 HS에서 필터를 배양한다. 필터의 RNA 측이 HS에 직면 해 있는지 확인합니다.

9 프로브 합성

  1. 4.3에 설명 된대로 특정 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 10 pmol의에 인산 앞으로 반응을 설정합니다.
  2. (EtOH로 침전도 이상) 트리스-EDTA-염화나트륨 (TEN)의 5 볼륨이 반응 버퍼 및 G-25 세파 덱스 컬럼에 젤 배제 크로마토 그래피에 의한 합병되지 않는 뉴클레오티드의 표지 프라이머를 정화 추가합니다. 프로브 활성을 액체 섬광 계수기에 의해 평가 될 수있다.

(10) 멤브레인 하이브리드

  1. 신선한 10 ㎖의 분취 (전술 한 바와 같이 제조 및 보완)로 배출 HS를 교체합니다. 에 프로브를 가열얼음에 시원하고 새로운 HS에 추가 10 분 동안 95 ° C에서. 37 ° C ON에서 필터를 품어.

(11) 멤브레인 세척

  1. 하이브리드 솔루션을 복구 및 방사능 차폐 상자에 -20 ° C에서 보관하십시오.
  2. 세척 버퍼 (WB)의 필터를 세척하여 실온에서 10 분 동안 철저하게 씻는다.
  3. 필터 코너에서 잔류 방사능을 점검하기위한 가이거 뮬러 감지기를 사용합니다. 배경 배출량은 약 5 CPS 때, 박람회를 막에 진행합니다.

(12) 신호 감지

  1. 오토 라디오 그래피 필름 또는 분자 영상 화면 ON에 필터를 노출. 사진 처리 또는 디지털 변환하여 신호를 알 수있다.
  2. 전용 정량화 소프트웨어 (ImageJ에 또는 Optiquant)에 의해 밴드의 강도를 분석 할 수 있습니다.

(13) 멤브레인 스트립

  1. 스트리핑 끓는 용액의 500 ㎖에 잠수함, 막 1 차 신호를 제거하려면다음 1 분 동안 실온에서 배양한다. 소설 (전) 하이브리드를 진행 또는 -20 ° C에서 필터를 저장합니다.

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결과

도 1에서 설명 텍스트 및 개략적 전반적인 절차에 따라, 우리는 상이한 기원의 복잡한 RNA 샘플로부터 RNA를 작은 식을 평가 하였다. (: 아가 로스 젤 분류 변성 선택적 단계) 두 번에로드 그림 1에서 제시 한 실험에서, RNA는 무결성 검사 테 K 추출하여 초파리 슈나이더의이 세포로부터 분리되었다. 겔의 절반은 중립 멤브레인에 블 롯팅시키고, 화학적 가교 결합에 의해 EDC; 후반전 후 UV 크로스가 결합, 양전하 나일론 필터 상에 (1.2 × 105 μJ / cm 2)을 옮겼다. DMEL-miR279 가족에 속하는이 마이크로 RNA의 내생 적 표현은 (DMEL-miR279 자체 DMEL-miR286 15)는 두 조건 모두에서 확인되었다. 개선 된 절차 (ENB)는 표준 일 (SNB) 높은 감도 존중을 보장합니다.

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토론

RNA가 신경을 조절 통해 얽혀 닳고 닳은 우리의 감사가 지속적으로 증가하고 있지만, 신경 줄기 세포 생물학, 신경 세포의 분화 / 기능 통합, 신경 병변 및 암의 개발에 영향을 미치는 RNA 기반 circuitries의 기계적인 의미는 미개척 남아있다. 초파리는 짧은 RNA를 비 암호화 및 전사 인자가 큰 분자 플레이어로 간주되는 비경 셀룰러 경로를 해명하는 수단으로서 melanogaster 왕국 통해 이러한 네트워크의 유지 보수 시스템은 유전자의 전위를 만든다. 이보기에서, 후보 작은 RNA 발현 수준의 프로파일 링은 정확한 기능 분석에 대한 초보의이다 : 예를 들어 북 블로 팅 분석의 개선 된 버전으로 통해 ​​수행 DMEL-miR279가 생체 내에서 GCM / 글라이드 운명의 결정을 변조 우리의 최근 시위에서 온다 발현 분석 용 툴.

(51)에서의 초기 개발 이후 클래스 = "jove_content는">, NB...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 연구소 국립 드 라 상테 동부 표준시 드 라 공들인 Médicale에 의해 지원되었다, 센터 국립 드 라 공들인 과학원, 4 대학 드 스트라스부르, HOPITAL 드 스트라스부르, 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암, 연구소 국립 뒤 암, 직원은 국립 드 라 공들인 및 지역 알자스.

피에트로 Laneve는 라 공들인 Médicale는 Fondation에 의해 부어지지를 받고 있습니다. 현재는있는 Istituto 이탈리아 Tecnologia (IIT) 교제의받는 사람입니다. 출판 비용을 Neurex 네트워크에 의해 지원됩니다 (TriNeuron - 프로그램 Interreg IV 상단 라인)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
최종 구성/이름회사카탈로그 (재고)코멘트<
원심분리기, 5418Eppendorf5418 000.017
오염 제거제, RNase AwaySigma-Aldrich83931유리/플라스틱 제품에 적용하고
RNase 억제제, DEPCSigma-AldrichD5758유해 //// 1609-47-8
샘플 준비
실체 현미경, M60Leica 
1X PBS 버퍼
137 mM NaCl시그마-알드리치S30147647-14-5   
2.7 mM KCl시그마-알드리치P95417447-40-7 
10 mM Na2HPO4Sigma-AldrichS32647558-79-4 
1.8 mM KH2PO4시그마-알드리치P97917778-77-0 
RNA 추출/분석
UV-Vis 분광 광도계Thermo ScientificNanodrop 2000
겔 이미저, ChemiDoc XRS+Biorad170-8265
수평 전기영동, 미니 서브 셀 GTBioRad170-4487EDU
RNA 추출 시약, TRIzol 시약Life Technologies15596026Hazardous
PCA (25:24:1), 추출Sigma-Aldrich77617136112-00-0
Chlorophorm, 추출Sigma-AldrichC243267-66-3 를 위한 1:1;  
EtOH, 2.5 vol. 강수량, 세척용 70%Sigma-Aldrich5984464-17-5 
유전자 눈금자 1Kb DNA 사다리Thermo ScientificSM0311
스톱 믹스
300 mM NaOAc, pH 5.5Sigma-AldrichS2889127-09-3
1x RSB 용액
2% 도데실황산나트륨 (SDS)Sigma-Aldrich71736강수량을 피하기 위해 SDS를 절대 냉각시키지 마십시오 //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinase KRoche Applied Science0-3115828001EC 3.4.21.64 9
10X 망상적혈구 표준 완충액(RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4Sigma-AldrichT59411185-53-1   
100 mM NaCl시그마-알드리치S30147647-14-5   
30 mM MgCl2Sigma-AldrichM82667786-30-3
변성 아가로스 젤
1.2% 아가로스Sigma-AldrichA9539젤을 최소 1시간 동안 응고시키십시오 //// 9012-36-2
10X MOPS 버퍼
0.2 M MOPS 나트륨 염, pH 7Sigma-AldrichM9381MOPS 나트륨 염을 혼동하지 마십시오. 걸레 //// 71119-22-7
아가로스 로딩 염료
1x MOPS 버퍼
3% 포름알데히드시그마-알드리치F8775위험 //// 50-00-0
50% 포름아미드시그마-알드리치47670위험 //// 75-12-7
에티듐 브로마이드(EtBr) 30 μ g/ml시그마-알드리치E1510위험 //// 1239-45-8
브로모페놀 블루 시그마-알드리치B0126115-39-9 
SMALL RNA FRACTIONATION
플랫 젤 로딩 팁Life TechnologiesLC1002
Savant SpeedVac 집중Thermo Scientific DNA120
수직 전기영동, Mini-PROTEAN Tetra Cell Biorad165-8000
변성 아크릴아미드 겔
10% 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 (19:1)시그마-알드리치A3449위험. 사용하기 전에 젤을 45분 동안 중합시키십시오
. 1x TBE 버퍼 (또는 1x MOPS 버퍼)
7 M 요소Sigma-AldrichU650457-13-6
0.1% 과황산 암모늄Sigma-Aldrich2155897727-54-0 
0.1% TEMEDSigma-AldrichT9281110-18-9
유전자 통치자 초저범위 DNA 사다리(10bp-단계)Thermo ScientificSM1211라벨 0.1 μ g, "프로브 라벨링"반응
아크릴 아미드 블루 염료 
50% 포름아미드Sigma-Aldrich47670위험 //// 75-12-7
Bromophenol 블루Sigma-AldrichB0126115-39-9 
러닝 버퍼(RB)
1x MOPS 버퍼 
대안적인 RB: 1x TBE 버퍼
1x TBE 버퍼
5X TBE
445 mM 트리스 기반시그마-알드리치T150377-86-1 
445 mM 붕산Sigma-AldrichB790110043-35-3
20 mM EDTASigma-AldrichEDS60-00-4   
겔 염색 용액
: 브롬화 에티듐 0.5 μ g/mlSigma-AldrichE1510유해 //// 1239-45-8
1x RBEtBr로 15분 동안 얼룩, EtBr
BLOTTING
3MM Whatman 종이Sigma-AldrichZ270849
중성 나일론 멤브레인, Hybond NXGE 헬스케어 생명 과학RPN203T감광성
가교
가교 용액 (XLS)
1 % 1- 메틸이 미다 졸 (v / v)시그마 - 알드리치336092항상 XLS의 새로운 부분 표본을 준비하십시오 // 616-47-7
12.5 mM HCl시그마-알드리치H1758위험 //// 7647-01-0
3.1 % EDC (w / v)시그마-알드리치345025952-53-8   
(PRE)-HYBRIDIZATION
액체 신틸레이션 카운터 BeckmannLS 6500
전단 연어 정자, 0.1 mg/ml Life TechnologiesAM9680
rasi4 안티 센스 프로브5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -
안티 센스 프로브5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279
안티 센스 프로브5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286
안티 센스 프로브5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'
정제 키트, Illustra MicroSpin G-25 열GE Healthcare Life Science27-5325-01
(Pre)-Hybridization Solution (HS)
0.5% SDSSigma-Aldrich71736151-21-3 
5x Denhardt의 솔루션
20X SSPE
3.6 M NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
0.2 M 인산나트륨시그마 알드리치3424837601-54-9   
20 mM EDTA (pH 8.0)시그마-알드리치EDS  60-00-4   
50x Denhardt의 솔루션
1% Ficoll 400 (w/v)Sigma-AldrichF263726873-85-8
1% 폴리비닐피롤리돈Sigma-AldrichPVP409003-39-8
1% BSASigma-AldrichA79069048-46-8   
1X TEN 버퍼
10 mM Tris-Cl (pH 8.0)Sigma-AldrichT150377-86-1 
100 mM NaCl시그마-알드리치S30147647-14-5   
1 mM EDTA (pH 8.0)시그마 - 알드리치EDS60-00-4   
프로브 라벨링
0.4 μ M 올리고뉴클레오티드
1.5 μ l Ci/μ l [γ-32P] ATPPerkin ElmerNEG002A유해 //// 51963-61-2
1x T4 폴리뉴클레오티드 키나아완충액 BiolabsB0201
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 0.5 단위/μ lBiolabsM0201EC 2.7.1.78
세척
Geiger Mueller 탐지기Canberra IndustriesMCB2/CPS –
세척 버퍼(WB), 2x SSPE
엄격한 세척 버퍼
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
신호 감지
PharosFX Plus 시스템Biorad170-9460
이미지 J자유롭게 사용 가능한
수량 1Biorad
X 선 필름, BioMax XARSigma-AldrichF5888
X 선 필름 용 감광성 현상액 Sigma-AldrichP7042
X 선 필름 용 해결사Sigma-AldrichP7167
스트리핑
스트리핑 용액
10 mM Tris-HCl pH 8.8Sigma-AldrichT150377-86-1 
5 mM EDTA시그마-알드리치EDS60-00-4   
0.1 % SDS시그마 - 알드리치71736거품을 피하기 위해 끓인 후 SDS를 첨가하십시오 // 151-21-3
td colspan="4">일반 요구 사항기 3'5s-rRNA제 EM77021

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